Determinación de proteínas en solución

Determinación de proteínas en solución
Las prácticas de bioquímica a menudo requieren de medidas rápidas de proteínas
en cantidades de microgramos. Las publicaciones científicas contienen varios
procedimientos para la determinación de proteínas en solución. Los más ampliamente
usados son tres métodos clásicos y uno recientemente descubierto. Los cuatro métodos
no trabajan todo el tiempo con cualquier tipo de proteínas. Es probable entonces que
una misma solución de proteína medida por los cuatro métodos, dé cuatro resultados
diferentes. Es importante reconocer que no hay un “método perfecto” para medir
proteínas.
Cada método presenta ventajas y desventajas que deben ser consideradas para
seleccionar el mejor procedimiento. Factores que importan son:
 La sensibilidad
 La exactitud deseada
 La naturaleza de la proteína
 La presencia de sustancias en solución que interfieren
 El tiempo disponible para llevar a cabo el ensayo.
Los cuatro métodos más ampliamente usados se comparan en la tabla adjunta.
Ensayo de biuret
Cuando las sustancias contienen dos o más uniones peptídicas reaccionan con sulfato de
cobre en medio básico formando un complejo de color púrpura. El producto coloreado
es el resultado de la coordinación del N del enlace peptídico con los iones Cu2+ . La
cantidad de producto formado depende de la concentración de la proteína.
En la práctica se realiza una curva de calibración usando una solución estándar de
proteína. Un estándar apropiado es una solución de seroalbúmina bovina. Se tratan
cantidades conocidas de la solución estándar con el reactivo de biuret y se permite el
desarrollo de color. Las medidas de absorbancia a 540nm (A540) son hechas contra un
blanco conteniendo el reactivo de biuret y buffer o agua. La A540 es graficada contra la
concentración de proteína en mg/mL ( curva de calibración ). La solución problema de
proteína es tratada con reactivo de biuret, se desarrolla el color y se determina su A540.
La concentración de la solución problema se determina a partir de la curva de
calibración. Pocas sustancias interfieren con el test de biuret. Un color anormal se
desarrolla en presencia de buffers de aminoácidos, Goods buffers y Tris. El test de
biuret tiene múltiples ventajas incluidas la rapidez, el color similar desarrollado para
diferentes proteínas y pocas sustancias que interfieren. Una desventaja es la baja
sensibilidad ya que la menor concentración que detecta es de 1mg.
Ensayo de Lowry
Este ensayo de proteínas es uno de los más sensibles por lo tanto es ampliamente usado.
El test de Lowry puede detectar proteínas en niveles tan bajos como 5 g. El principio
por el cual se desarrolla el color es idéntico al del ensayo de biuret solo que hay un
segundo reactivo ( Folin-Ciocalteu) que se adiciona para incrementar la cantidad de
color a desarrollar. Dos reacciones cuentan para desarrollar el color azul intenso, (1) la
coordinación de los enlaces peptídicos con cobre en medio alcalino (reacción de biuret)
y (2)la reducción con el reactivo de Folin-Ciocalteu ( fosfomolibdato-fosfotungstato )
con los residuos de tirosina (Tyr) y triptofano (Trp) dela proteína.
El procedimiento es similar al ensayo de biuret. Se prepara una curva de calibración con
seroalbúmina bovina u otra proteína pura y se determina la concentración problema a
partir de la curva realizada. La ventaja obvia de este ensayo es la alta sensibilidad que es
100 veces mayor que la de Biuret sin embargo se necesita un mayor tiempo para su
realización. El ensayo de Lowry es infortunadamente interferido por diferentes
sustancias y un crítico cronometraje es necesario en la adición de los reactivos. Los
buffers de Good incrementan la absorbancia del blanco y no pueden estar presentes en
el ensayo. Otras sustancias que interfieren son el sulfato de amonio en concentraciones
mayores de 0.15%, la glicina en más de 0.5% y los mercaptanos. Como todas las
proteínas difieren en la cantidad de tirosina y triptofano que presentan, el desarrollo de
color difiere de una proteína a otra inclusive en la seroalbúmina bovina estándar. Es por
eso que el ensayo de Lowry debe ser usado solo para medir cambios en la concentración
de proteínas y no para determinar valores absolutos de la misma. Esto no disminuye el
valor del ensayo porque para muchos ensayos bioquímicos (como la purificación de
proteínas ) cambios relativos en la concentración de proteínas son indicados.
Ensayo de Bradford
Las múltiples limitaciones de los ensayos anteriores estimularon la investigación de
mejores métodos de cuantificación de proteínas en solución. Un reciente procedimiento
desarrollado se basa en la unión de la proteína a un colorante, con numerosas ventajas.
La unión del colorante Coomassie Brilliant Blue a la proteína en solución ácida produce
un cambio en la máx. del colorante desde 465nm a 595nm. La absorción a 595nm se
relaciona directamente con la concentración de proteína.
En la práctica, la curva de calibración es preparada usando gamaglobulina de plasma
bovino o seralbúmina bovina como estándar. El ensayo requiere un solo reactivo, una
solución ácida de Coomassie Brilliant Blue G-250.Después de la adición de la solución
del colorante a la muestra de proteína, el color se desarrolla completamente en dos
minutos y permanece estable por más de una hora. La sensibilidad de este ensayo es
semejante y a veces supera a la del ensayo de Lowry. Usando un procedimiento de
microensayo, el ensayo de Bradford puede ser usado para determinar proteínas en un
rango de 1 a 20 g. Éste ensayo muestra variaciones significativas con diferentes
proteínas. El método de Bradford no solo es rápido sino que tiene pocas interferencias
con compuestos no proteicos. Las únicas interferencias conocidas son los detergentes,
Triton X-100 y dodecilsulfato de sodio. Las múltiples ventajas de éste método explican
su amplia adopción en laboratorios de investigación bioquímica.
Ensayo espectrofotométrico
Muchas proteínas presentan intensa absorción de luz ultravioleta centrada en los 280nm.
Esto es debido a la presencia de residuos de tirosina y triptofano en la proteína. Sin
embargo, la cantidad de esos residuos de aminoácidos es variable en las diferentes
proteínas como se señaló anteriormente. Si ciertas precauciones son tomadas el valor de
la A280 de una solución de proteína es proporcional a la concentración de proteína. El
procedimiento es simple y rápido. Se transfiere la solución de proteína a una cubeta de
cuarzo y se lee la absorbancia a 280nm contra una cubeta con solución de referencia
conteniendo el solvente de la proteína solamente ( buffer, agua, etc ). Los extractos
celulares contienen otros compuestos que manifiestan su absorbancia en la proximidad
de los 280nm. Los ácidos nucleicos que comúnmente pueden estar presentes en la
solución proteica absorben fuertemente a 280nm ya que su máximo de absorción es de
260nm. Warburg y Chistian desarrollaron un método de corrección para esta
interferencia de los ácidos nucleicos. Se prepararon mezclas de proteína pura y de ácido
nucleico puro y la relación fue determinada experimentalmente. Calcularon así un factor
de corrección (F). La tabla 2 indica una serie de valores de F para diferentes relaciones
de A280/A260.
La siguiente ecuación debe ser usada para soluciones de proteínas conteniendo más de
20% de ácidos nucleicos.
Concentración proteica(mg/mL) = A280 . F
Una modificación de la ecuación realizada por Link (1957) que da resultados similares
es :
Concentración proteica(mg/mL) = 1.55 A280 – 0.76 A260
La Tabla 2 puede ser usada para estimar la cantidad de ácido nucleico en la solución de
proteína.
Tabla 2. Estimación proteica por absorción ultravioleta
A280/A260
1.75
1.63
1.52
1.40
1.36
1.30
1.25
1.16
1.09
1.03
0.95
0.94
0.87
% Ácido
Nucleico
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
5.00
F
A280/A260
1.12
1.08
1.05
1.02
0.99
0.97
0.94
0.90
0.85
0.81
0.78
0.74
0.68
0.85
0.82
0.80
0.78
0.77
0.75
0.73
0.71
0.67
0.64
0.62
0.60
-
% Ácido
Nucleico
5.55
6.00
6.50
7.00
7.50
8.00
9.00
10.00
12.00
14.00
17.00
20.00
-
F
0.66
0.63
0.61
0.59
0.57
0.55
0.51
0.48
0.42
0.38
0.32
0.28
-
El ensayo espectrofotométrico para proteínas es rápido, relativamente sensible y
requiere poca cantidad de muestra pero no es más que una estimación de la
concentración de proteínas. Tiene ciertas ventajas frente al método colorimétrico en
tanto muchos buffers y el sulfato de amonio, no interfieren. El ensayo
espectrofotométrico es particularmente indicado para una medida rápida de una elución
de proteína de una columna cromatográfica, donde solo importan los cambios en la
concentración de proteína.
Tabla 1 .- Comparación de los diferentes métodos de determinación
proteica.
Método
Sensibilidad
Tiempo
Principio
Interferencias Comentarios
Biuret
Baja sensibilidad Moderado Uniones
(1-20mg)
(20-30min) peptídicas +
Cu2+
complejo
púrpura
Buffer Tris,
Algunos
aminoácidos
Lowry
Alta sensibilidad Lento
(1)Reacción de
(40-60 min) Biuret
 5 g
(2) Reducción
con
fosfomolibdatofosfotungstato
de los residuos
Tyr y Trp
Sulfato de
amonio
Glicina
Mercaptanos
Alta sensibilidad
 5 g
Rápido
15 min.
Buffers
fuertemente
básicos
Detergentes
como Triton X100 y
dodecilsulfato de
sodio (SDS)
Moderada
sensibilidad
50-100 g
Rápido
1min
Bradford
WarburgChistian
Espectrofométrico
Corrimiento de
máx. del
colorante
Coomassie de
465nm a
595nm cuando
está unido a la
proteína
Absorción en el Purinas
UV (280nm) Pirimidinas
por residuos de Ácidos nucleicos
Tyr y Trp de la
proteína
Usado para
determinaciones
rápidas, pero no
especialmente
sensibles.
Similar color
desarrollado con
diferentes
proteínas.
Requiere
tiempos mas
largos
La cantidad de
color varía con
las diferentes
proteínas
Control exacto
de los tiempos es
crítico para el
procedimiento.
Útil para
cambios en la
conc. de
proteínas
Excelente
método, pocas
interferencias,
color estable.
La cantidad de
color cambia
con diferentes
proteínas. El
reactivo es fácil
de conseguir.
Rápido y no
destructivo
Absorción de
ácidos nucleicos
puede ser
corregida.