azucares

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LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS
PRÁCTICA # 8
TÉCNICAS ANALÍTICAS PARA LA CUANTIFICACIÓN
DE COMPONENTES QUÍMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES
INTRODUCCIÓN
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los
componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones,
celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.
Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y
se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los
polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de
desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia,
textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos
de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el
sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos.
El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en
composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe
principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está
determinada por los polisacáridos estructurales.
Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos
existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios
intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y
suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el
cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se
metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO2, H2O y
ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes
(otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos
azucarados, glucósidos, etc.).
Durante todo este proceso, el contenido de
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azúcares
aumenta
casi
invariablemente
básicamente
por
hidrólisis
que
experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como
sustratos para la actividad respiratoria.
Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios
métodos para su determinación:
Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon,
Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:
Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se
clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles
(reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son
altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros
agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente
reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan
formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza
tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la
cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida
por la misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el
espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria
para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio,
comparándola después con la radiación absorbida por un blanco.
La regla
específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia
con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede
establecer como sigue:
Log Io = abc
I
En donde:
Io = Radiaciòn incidente o radiaciòn transmitida por el blanco.
I = Radiaciòn transmitida por la muestra.
Log Io = absorbancia de la muestra
I
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En donde:
a = coeficiente de absorbancia (absortividad) – las unidades dependen de las
unidades utilizadas para la determinaciòn de la concentraciòn.
b = longitud de la celda usualmente en centìmetros.
c = concentraciòn de la muestra en las unidades apropiadas.
I
En esta práctica se empleará la técnica colorimétrica de Nelson y Ting para
determinar glucosa, fructosa y sacarosa.
OBJETIVOS
El estudiante explicará por escrito el fundamento del método empleado para
la determinación de azúcares en las muestras de frutas que se le asignarán.
El estudiante relacionará los contenidos de azúcares determinados en las
muestras de diversos frutos.
El estudiante se concientizarà del concepto y los instrumentos de mediciòn
utilizados en la espectrofotometrìa, y de la aplicaciòn de curvas estàndar utilizando
el mètodo de Nelson y Ting.
MATERIAL
6 matraces volumétricos de 100 ml con tapón.
2 matraces volumétricos de 500 ml con tapón.
2 matraces volumétricos de 250 ml con tapón.
1 embudo de vidrio.
2 matraces Erlenmeyer de 125 ml.
6 pipetas de 10 ml.
2 pipetas de 1 ml.
2 pipetas de 5 ml.
2 vasos de precipitados de 250 ml.
1 baño María simple.
5 celdas de espectrofotómetro.
1 gradilla.
2 círculos de 10 cm de diámetro de papel filtro Whatman # 1.
Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante).
Algodón o gasa .
1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante).
1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante).
Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. En el caso del melón con 1
ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).
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EQUIPO:
1 extractor de jugos.
1 licuadora o mortero.
1 potenciómetro.
1 baño María con control de temperatura y agitación.
1 espectrofotómetro Spectronic 20'® a 515 nm.
REACTIVOS
Solución alcalina de Ferricianuro.
Solución de Arsenomolibdato (25 g).
H2SO4 2N.
NaOH 10N, 1N y 0.1N.
HCl 1:1 (Vol/Vol).
Na2CO3 anhidro. (12.5 g) ó
Na2CO3 monohidratado. (14.3 g).
Tartrato de potasio (12.3 g).
NaHCO3 (10 g).
Na2SO4 anhidro disuelto en 35º ml de agua destilada.
CuSO4 · 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O.
Glucosa (300 µg/ml).
MÉTODO
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Reactivo de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3 anhidro (ó 14.3 g Na2CO3
· H2O), 12.3 g de tartrato de potasio, 10 g de NaHCO 3 y 100 g de Na2SO4 anhidro
en 350 ml de H2O y afore a 500 ml.
Reactivo de Nelson B.- Disuelva 7.5 g de CuSO4 · 5H2O en 50 ml. de H2O
y añada una gota de H2SO4.
Reactivo Alcalino de Nelson.- Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A +
1.0 ml. del reactivo de Nelson B.
Curva de la Glucosa.- Elaborar una solución stock de glucosa en agua
que contenga 300 µg/ml. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30
µg/ml.
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Reactivo de Arsenomolibdato.- Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 · 4H2O
(molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. de agua destilada.
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PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
TOTALES
Prepare una serie de diluciones a partir de la solución stock de glucosa.
Las concentraciones deberán ser de 300, 150, 75 y 30 µg/ml. Utilice matraces
volumétricos aforados con tapón y márquelos con la concentración
correspondiente.
1. Pipetee 1 ml. de cada solución estándar de glucosa y agua destilada como
blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. aforados.
2. Añada 1 ml. de reactivo alcalino de Nelson.
3. Mezcle. Colóque los tubos en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos y
enfríelos al chorro de agua fría.
4. Añada 1 ml. de arsenomolibdato.
5. Mezcle bien por un períodode 5 min. (para disolver el Cu 2O para reducir el
aresnomolibdato).
6. Afore a 25 ml. con agua destilada y mezcle.
7. Lea la absorbancia a 520 nm.
Grafíque la absorbancia contra la concentración (µg/g). Utilice esta curva
estándar para determinar la concentración de glucosa en las muestras de
frutas.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES REDUCORES TOTALES
1.- Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos.
2.- Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49).
3.- Colóque 5 ml. del jugo diluido en un matraz volumétrico de 250 ml. y afore con
agua destilada.
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES
1.- Transfiera 1 ml. del jugo diluido a un matraz volumétrico aforado de 100ml. y
añada 5 ml. de reactivo de ferricianuro.
2.- Colóque los matraces en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.
3.- Enfríe los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fría.
4.- Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml. de solución de ácido
sulfúrico 2N.
5.- Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen más
gases.
6.- Añada 4 ml. de arsenomolibdato.
7.- Mezcle una vez más el contenido de los matraces.
8.- Afore a 100 ml. con agua destilada.
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9.- Tome una celda del espectrofotómetro y transfiera ahí el contenido de cada
matraz (uno por celda).
10.- Efectúe la lectura en el espectrofotómetro a 520 nm. El blanco constará de
todos los reactivos antes mencionados, excepto la muestra de jugo de fruta bajo
estudio. No olvide ajustar el espectrofotómetro con agua destilada al principio.
CÁLCULOS:
A partir de la curva estándar se calcula el valor k para la determinación de
azúcares reductores totales mediante la siguiente fórmula:
k = c/a
En donde:
k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva.
c = Concentración de azúcares reductores en gramos/100 ml.
a = Absorbancia de la solución a esa concentración.
Los valores k a diferentes concentraciones de azúcar se promedian y se
designan como K. El contenido total de azúcares reductores, S, de la muestra se
calcula de la fórmula:
S = K.A.D.
En donde:
S = Concentración total de azúcares reductores de la muestra en
gramos/100 ml de jugo.
K = Pendiente promedio de la curva.
D = Factor de dilución.
DETERMINACIÓN DE FRUCTOSA
NOTA: Esta determinación no se realizará en esta sesión de laboratorio).
Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura - eg.,
55°C - con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de oxidación de la
glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. El resultado obtenido es
conocido como fructosa aparente. Ésta es ligeramente más alta que el contenido
real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las fórmulas
adecuadas. El procedimiento para la determinación de esta fructosa aparente es
el mismo que para el cálculo de los azúcares reductores totales, excepto que se
cambia la temperatura y el período de calentamiento a 55°C por 30 minutos.
Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente, oxidados a
55°C se obtienen a partir de las curvas estándar de estos dos azúcares, de la
forma descrita para K. La proporción de Kg a Kf ó Q se utiliza para el cálculo real
de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultáneas:
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G+F=S
G/Q + F = L
En donde:
G = Porcentaje de glucosa en la muestra.
F = Porcentaje de fructosa en la muestra.
S = Porcentaje de azúcares reductores totales (Suma de G y F).
L = Porcentaje aparente de fructosa.
Q = Proporción entre Kg y Kf (Kg/Kf)
En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azúcares
presentes son fructosa. La fructosa aparente L se calcula a partir de la fórmula S
= K.A.D., sustituyendo L por S y Kf por K. Se obtiene la siguiente fórmula para el
porcentaje de glucosa en la muestra:
G = (S - L) X Q
Q-1
El cociente q/(Q-1), se utiliza como una constante en los cálculos del valor
real de la glucosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia.
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES TOTALES Y SACAROSA
Nota: Esta determinación no se llevará a cabo en esta sesión de laboratorio)
La sacarosa de la muestra es invertida con el ácido clorhídrico.
procedimiento se describe a continuación:
El
1.- Se colocan 50ml. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml. y se
añaden 10 ml. de ácido clorhídrico (1:1).
2.- Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental.
3.- Se añaden 5 ml. de solución de hidróxido de sodio 10N y los contenidos se
ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solución de hidróxido de sodio 1N
mediante el uso de un potenciómetro.
4.- Los contenidos se transfieren a un matraz volumétrico aforado de 100ml y se
afora con agua destilada.
5.- Se toma una alícuota de 1 ml de esta solución y se pipetea en un matraz
volumétrico de 100 ml. y se sigue el procedimiento descrito para la determinación
de azúcares reductores totales.
6.- Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de
azúcares reductores antes y después de la inversión, multiplicada por el factor de
0.95.
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Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada
especie de futas estudiadas en la sesión de laboratorio.
CUESTIONARIO:
1.- ¿Por qué la sacarosa no se considera como un azúcar reductor?
2.- ¿Para qué se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson?
BIBLIOGRAFIA:
A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980.
Washington, U.S.A.
Horwitz W. (ed). Ed. 13 th.
Ting, S.V. 1956.
Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous
Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food
Chem. Vol. 4(3) 263-266.