ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIFÚNGICO DE QUITOSANO PARA EL CONTROL DE PODREDUMBRES EN MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus) DURANTE EL PERÍODO POSCOSECHA PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL JÉSSICA MARÍA GUEVARA ZAMBRANO [email protected] DIRECTORA: ROSA VILAPLANA VENTURA Ph.D. [email protected] CO-DIRECTORA: SILVIA VALENCIA CHAMORRO Ph.D. [email protected] Quito, julio del 2016 © Escuela Politécnica Nacional (2016) Reservados todos los derechos de reproducción DECLARACIÓN Yo Jéssica María Guevara Zambrano, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento. La Escuela Politécnica Nacional puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente. ___________________________ Jéssica María Guevara Zambrano CERTIFICACIÓN Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por Jéssica María Guevara Zambrano, bajo nuestra supervisión. _________________________ Rosa Vilaplana Ventura Ph.D. DIRECTORA DEL PROYECTO _________________________ Silvia Valencia Chamorro Ph.D. CO-DIRECTORA DEL PROYECTO AUSPICIO La presente investigación contó con el auspicio financiero del proyecto PIMI 14-16, “Desarrollo de métodos alternativos no contaminantes para el control de las podredumbres que se producen en el período poscosecha en frutas andinas y tropicales”, de la Escuela Politécnica Nacional (EPN), que se ejecuta en el Departamento de Ciencia de Alimentos y Biotecnología (DECAB). AGRADECIMIENTOS A mis padres Jeanette Zambrano y Nelson Guevara, por todos los consejos, sacrificios, su amor y apoyo incondicional a lo largo de mi vida. A las Dras. Silvia Valencia y Rosa Vilaplana, por sus enseñanzas, cariño y paciencia. Al personal del DECAB y mis compañeros de laboratorio. A mis amigos, por hacer de estos años universitarios, los más divertidos e inolvidables de mi vida. A mis hermanos Daniel, Miguel, Michelle y Vivian i ÍNDICE DE CONTENIDOS PÁGINA GLOSARIO RESUMEN INTRODUCCIÓN xi xii xv 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1 1.1 Generalidades de la mora de Castilla 1.1.1 Descripción botánica y taxonómica 1.1.2 Composición nutricional del fruto 1.1.3 Cosecha y poscosecha de la mora de Castilla 1.1.4 Cultivo de mora de Castilla en Ecuador 1.1.5 Caracterización físico-química y nutricional del fruto 1.1.5.1 Parámetros físicos 1.1.5.1.1 Tamaño y forma 1.1.5.2 Parámetros químicos 1.1.5.2.1 Sólidos solubles totales 1.1.5.2.2 Acidez activa ph 1.1.5.2.3 Acidez titulable total 1.1.6 Fungicidas de síntesis química utilizados en el cultivo 1 1 2 3 5 7 7 7 7 7 8 8 9 1.2 Factores que inciden en las podredumbres durante la poscosecha de la mora de Castilla 1.2.1 Factores precosecha 1.2.1.1 Suelo 1.2.1.2 Condiciones ambientales 1.2.1.3 Labores culturales Microorganismos patógenos 1.2.2.1 Hongos 1.2.2.1.1 Botrytis spp 1.2.2.1.2 Rhizopus spp 1.2.2.1.3 Colletotrichum spp 1.2.2.1.4 Penicillium spp 1.2.2.1.5 Mucor spp 1.2.2.1.6 Fusarium spp 10 10 10 11 12 15 15 16 18 19 20 22 23 Tratamientos alternativos para el control de podredumbres poscosecha en mora de Castilla 1.3.1 Tratamientos físicos 1.3.1.1 Inmersión en agua caliente 1.3.1.2 Curado 1.3.1.3 Radiación UV-C 1.3.1.4 Radiación por microondas 1.3.2 Tratamientos químicos de bajo riesgo 1.3.2.1 Sustancias naturales 1.3.2.1.1 Aceites esenciales 24 24 24 24 25 25 26 26 26 1.2.2 1.3 ii 1.3.3 1.3.4 1.3.2.1.2 Jasmonatos y ácido salicílico 1.3.2.1.3 Quitosano 1.3.2.2 Sustancias GRAS (Generally Recognized as Safe) 1.3.2.2.1 Carbonatos bicarbonatos y otras sales 1.3.2.2.2 Ácido cítrico 1.3.2.2.3 Ácido ascórbico 1.3.2.2.4 Ácido acético Control Biológico Métodos de conservación durante la poscosecha 1.3.4.1 Atmósfera controlada (AC) 1.3.4.2 Pre-enfriamiento 1.3.4.3 Recubrimientos comestibles 2 PARTE EXPERIMENTAL 2.1 Identificación de los diferentes géneros de hongos causantes de podredumbres poscosecha en mora de Castilla (Rubus glaucus) 2.1.1 Aislamiento de los hongos patógenos presentes en la mora de Castilla 2.1.2 Purificación e identificación de los hongos patógenos 2.2 2.3 Determinación de la especie de hongo más patogénica 2.2.1 Preparación de inóculos 2.2.1.1 Determinación de la concentración de los inóculos 2.2.2 Metodología de inoculación artificial 2.2.2.1 Inoculación artificial mediante una herida en los frutos 2.2.2.2 Inoculación artificial mediante inmersión de los frutos en suspensiones con los inóculos 2.2.3 Almacenamiento y conservación de los frutos 2.2.4 Determinación del índice de incidencia de enfermedad (IIE) 2.2.5 análisis estadístico Estudio del efecto de diferentes concentraciones de quitosano en la calidad físico-química, sensorial y microbiológica de los frutos recubiertos 2.3.1 Inoculación artificial de los frutos 2.3.2 Preparación de los recubrimientos con las diferentes concentraciones de quitosano 2.3.2.1 Recubrimiento al 0,5; 1,0 y 2,0 % de quitosano 2.3.3 Aplicación de los recubrimientos a las moras de Castilla 2.3.4 Aplicación del fungicida de síntesis química a las moras de Castilla 2.3.5 Almacenamiento y conservación de los frutos recubiertos 2.3.6 Determinación del iie de los frutos recubiertos 2.3.7 Evaluación de las propiedades físico-químicas de los frutos recubiertos 2.3.7.1 Propiedades físicas de los frutos 2.3.7.2 Propiedades químicas de los frutos 26 27 28 29 29 30 30 30 31 31 32 33 34 34 34 35 36 36 37 38 38 39 39 40 41 42 42 42 42 43 43 43 44 44 44 45 iii 2.3.8 2.3.9 2.3.10 2.3.11 2.4 Análisis estadístico Evaluación microbiológica y sensorial de frutos recubiertos con la concentración de quitosano más efectiva 2.3.9.1 Aplicación del tratamiento con quitosano Evaluación microbiológica de los frutos recubiertos Calidad sensorial de los frutos 45 46 46 46 46 Estimación del costo de aplicación de quitosano como método alternativo a los fungicidas químicos de síntesis 48 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49 3.1 Identificación de los diferentes géneros de hongos aislados de la mora de Castilla (Rubus glaucus) 3.1.1 Penicillium spp 3.1.2 Rhizopus spp 3.1.3 Botrytis spp 3.1.4 Colletotrichum spp 3.1.5 Fusarium spp 3.1.6 Geotrichum spp 3.1.7 Cladosporium spp 3.1.8 Mucor spp 49 50 51 53 55 57 59 61 63 3.2 3.3 Determinación del género de hongo más agresivo 3.2.1 IIE de los frutos inoculados artificialmente mediante una herida en el centro 3.2.2 IIE de los frutos inoculados artificialmente por inmersión en las suspensiones de esporas Evaluación del efecto de diferentes concentraciones de quitosano en la calidad de mora de castilla inoculada artificialmente con Botrytis spp 3.3.1 IIE de los frutos 3.3.2 Evaluación de las características físico-químicas y sensoriales de la materia prima (día 0) 3.3.2.1 Análisis físico-químicos 3.3.2.2 Análisis sensorial 3.3.3 Evaluación de las características físico-químicas y sensoriales de los frutos tratados durante el almacenamiento 3.3.3.1 Análisis físicos 3.3.3.1.1 Peso 3.3.3.1.2 Diámetro 3.3.3.1.3 Longitud 3.3.3.2 Análisis químicos 3.3.3.2.1 pH 3.3.3.2.2 Sólidos solubles totales (SST) 3.3.3.2.3 Acidez titulable total 3.3.3.3 Análisis sensorial 65 68 70 73 74 77 77 78 79 79 80 83 85 86 87 88 90 91 iv 3.4 Análisis del efecto de la mejor concentración de quitosano en la calidad microbiológica y sensorial de mora de Castilla 3.4.1 Análisis microbiológico 3.4.2 Análisis sensorial 93 93 95 3.5 Estimación de costos de aplicación del tratamiento poscosecha 97 4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 101 4.1 Conclusiones 101 4.2 Recomendaciones 102 BIBLIOGRAFÍA 103 ANEXOS 115 v ÍNDICE DE TABLAS PÁGINA Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la mora de Castilla 2 Tabla 1.2. Composición nutricional en 100 g de mora de Castilla 3 Tabla 1.3. Evolución de la exportación de mora de Castilla en Ecuador 6 Tabla 1.4. Clasificación de la mora de Castilla según el calibre 7 Tabla 1.5. Cantidades de los elementos requeridos en el cultivo de mora de Castilla y su interpretación 13 Relación entre los elementos del cultivo de mora de Castilla y su interpretación 14 Concentración de gases en atmósferas almacenamiento y en atmósferas modificadas 32 Tabla 1.6. Tabla 1.7. normales de Tabla 3.1. Géneros de hongos aislados y purificados con su codificación 49 Tabla 3.2. Características (t = 0 días) 78 Tabla 3.3. Tabla 3.4. Tabla 3.5. Tabla 3.6. Tabla 3.7. físico-químicas de la mora de Castilla Parámetros físicos evaluados en la mora de Castilla en las salidas 1 (día 7) y 2 (día 14) almacenadas a 4 oC y 95 % de HR. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD 80 Parámetros químicos evaluados en la mora de Castilla en las salidas 1 (día 7) y 2 (día 14) almacenadas a 4 oC. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD 87 Atributos sensoriales evaluados en la mora de Castilla almacenada hasta 14 días a 4 oC. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD 92 Análisis microbiológico de la mora de Castilla recubierta con quitosano al 2 % y de los frutos control en las salidas 1 (día 0), 2 (día 7) y 3 (día 14) almacenada a 4 oC 94 Atributos sensoriales evaluados en la mora de Castilla recubierta con quitosano al 2 % y de los frutos control en las salidas 1 (día 0), 2 (día 7) y 3 (día 14), almacenada a 4 oC, analizados con el test LSD 96 vi Tabla 3.8. Tabla 3.9. Costo total de equipos necesarios para la aplicación de recubrimiento de quitosano en mora de Castilla como tratamiento poscosecha 98 Costos semanales de la aplicación de un recubrimiento de quitosano en mora de Castilla como tratamiento poscosecha 99 vii ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA Figura 1.1. Escala del índice de color de la mora de Castilla 4 Figura 1.2. Principales destinos de la mora ecuatoriana del año 2010 al 2014 6 Figura1.3. Estructura de un hongo filamentoso (Botrytis cinerea) 16 Figura 1.4. Aspecto microscópico de Botrytis spp 17 Figura 1.5. Mora de Castilla infectada con Botrytis spp 17 Figura 1.6. Aspecto microscópico de Rhizopus spp 18 Figura 1.7. Mora de Castilla infectada con Rhizopus spp 19 Figura 1.8. Aspecto microscópico de Colletotrichum spp 19 Figura 1.9. Mora de Castilla infectada con Colletotrichum spp 20 Figura 1.10. Aspecto microscópico de Penicillium spp 21 Figura 1.11. Mora de Castilla infectada con Penicillium spp 21 Figura 1.12. Aspecto microscópico de Mucor spp 22 Figura 1.13. Mora de Castilla infectada con Mucor spp 22 Figura 1.14. Aspecto microscópico de Fusarium spp 23 Figura 1.15. Mora de Castilla infectada con Fusarium spp 23 Figura 1.16. Estructura química del quitosano y su producción a partir de Quitina 27 Figura 2.1. Procedimiento para la inoculación artificial de los frutos 40 Figura 2.2. Escala de los valores del IIE de los frutos inoculados. 41 Figura 3.1. Penicillium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 50 Figura 3.2. Aspecto microscópico de Penicillium spp (×40) 51 Figura 3.3. Rhizopus spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo DA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 52 viii Figura 3.4. Aspecto microscópico spp (× 40) de un esporangio de Rhizopus 53 Botrytis spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 54 Figura 3.6. Aspecto microscópico de un conidióforo de Botrytis spp (× 40) 55 Figura 3.7. Colletotrichum spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 56 Aspecto microscópico de las conidias de Colletotrichum spp (× 40) 57 Fusarium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso derecha) de la placa 58 Aspecto microscópico de macroconidias y microconidias de Fusarium spp (× 40) 59 Figura 3.5. Figura 3.8. Figura 3.9. Figura 3.10. Figura 3.11. Geotrichum spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 60 Figura 3.12. Aspecto microscópico de hifas de Geotrichum spp (× 40) 61 Figura 3.13. Cladosporium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 62 Aspecto microscópico de hifas y conidias de Cladosporium spp (× 40) 63 Mucor spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 64 Aspecto microscópico de esporangio y esporas de Mucor spp (×40) 65 Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Botrytis spp HM11 66 Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Rhizopus spp HM8 67 Figura 3.14. Figura 3.15. Figura 3.16. Figura 3.17. Figura 3.18. ix Figura 3.19. Figura 3.20. Figura 3.21. Figura 3.22. Figura 3.23. Figura 3.24. Figura 3.25. Figura 3.26. Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Colletotrichum spp HM14 67 IIE (%) de Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp HM14 inoculados artificialmente en mora de Castilla mediante una herida en el centro de los frutos con 103 conidias mL-1 (A) y 105 conidias mL-1 (B). Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD 69 IIE (%) de Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp HM14 inoculados artificialmente en mora de Castilla mediante la inmersión de los frutos en suspensiones con 103 conidias mL-1 (C) y 105 conidias mL-1 (D). Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD 71 IIE (%) de frutos inoculados con Botrytis spp HM11 (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC. Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD 75 Gráfico de medias con el método de la diferencia significativa mínima de Fisher (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil 76 Pérdida de peso de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 ºC y evaluados con el test LSD 82 Pérdida de diámetro de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 ºC y evaluados con el test LSD 84 Pérdida de longitud de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC y evaluados con el test LSD 86 x ÍNDICE DE ANEXOS PÁGINA ANEXO I Esquema del procedimiento para recubrir los frutos con las distintas concentraciones de quitosano 116 ANEXO II Esquema del procedimiento para recubrir los frutos con la mejor concentración de quitosano 117 ANEXO III Formato para el análisis sensorial de los frutos aplicados los distintos tratamientos poscosecha 118 ANEXO IV Formato para el análisis sensorial de los frutos control y de los frutos recubiertos con quitosano 120 xi GLOSARIO Acérvulo. Masa de hifas que se forman bajo la epidermis o bajo la cutícula del organismo parasitado, y produce una capa de conidióforos, cortos y rematados por un conidio apical (Micoroda, 2012). Apófisis. Cualquier tipo de protuberancia al final de una estructura alargada (Micoroda, 2012). Artroconidias. Conidias que resultan de la fragmentación o desarticulación de las células de una hifa, después del engrosamiento de su pared celular y condensación del citoplasma (RAE, 2015). Columela. Porción axial estéril dentro de la cabeza del esporangio; columna central estéril (Micoroda, 2012). Conidióforos. Extremo de las hifas modificadas de donde se separan las células condiógenas (Micoroda, 2012). Conidios. Esporas especializadas mediante las cuales se reproducen asexualmente la mayoría de los Ascomycetes (Micoroda, 2012). Esporangiosporas. Esporas asexuales típicas de los hongos inferiores (RAE, 2015). Esporodoquios. Apelotonamiento tuberoso de hifas (Micoroda, 2012). Estípites. Estructuras largas y no ramificadas (RAE, 2015). Estomas. Abertura microscópica en la epidermis de las partes verdes de los vegetales superiores que permiten el intercambio de gases y líquidos con el exterior (RAE, 2015). xii Folíolos. Cada una de las hojuelas de una hoja compuesta (RAE, 2015). Fusiforme. Se aplica al pie de las setas adelgazado en su cumbre y ensanchado un poco en la base terminándose casi en punta (Micoroda, 2012). Hialino. Traslúcido (RAE, 2015). Hifas. Célula alargada normalmente de menos de 10 micras de espesor y que es el elemento constituyente del cuerpo de los hongos (Micoroda, 2012). Micelio. Parte vegetativa (talo) del hongo, formado por una densa serie de filamentos ramificados (hifas) que se entremezclan entre sí, de estructura y composición variables. Puede ser de formas muy diversas; constituye masas filamentosas entrelazadas (Micoroda, 2012). Micotoxinas. Metabolitos secundarios producidos por acción de los hongos sobre los alimentos, provocando una podedumbre rápida, mediante un proceso de maceración enzimática. Las principales especies responsables de estas sustancias son de los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillum (Micoroda, 2012). Septos. Tabique que divide de un modo completo o incompleto una cavidad (RAE, 2015). xiii RESUMEN En este proyecto de titulación, se evaluó la efectividad de recubrimientos realizados con diferentes concentraciones de quitosano para el control de podredumbres en mora de Castilla (Rubus glaucus) durante el periodo poscosecha. Para esta evaluación se realizaron dos ensayos, en el primer ensayo la mora de Castilla fue almacenada a temperatura ambiente durante 4 días para favorecer la esporulación y germinación de los hongos patógenos responsables de podredumbres durante la poscosecha. Estos hongos fueron aislados y purificados en placas Petri con medio de cultivo PDA y posteriormente identificados a nivel de género por sus características macro y microscópicas. A continuación, se inocularon artificialmente moras de Castilla desinfectadas con 3 de los hongos patógenos purificados (Botrytis spp, Colletotrichum spp y Rhizopus spp), y se determinó el género más agresivo durante la poscosecha mediante el cálculo del índice de incidencia de enfermedad (IIE). En esta prueba se evaluaron dos concentraciones de microorganismos diferentes (10 3 y 105 conidias mL-1) y se realizó mediante dos métodos de inoculación artificial. El primer método consistió en efectuar una herida en el centro de los frutos dentro de las cuales se insertaron los inóculos de los hongos. El segundo método consistió en sumergir las moras en las suspensiones de esporas de los patógenos. En cada método de inoculación se utilizó un diseño factorial 3 × 2. Los frutos fueron almacenados hasta 14 días a 4 oC y 90 % de humedad relativa. Con el hongo responsable de la podredumbre más severa, el método de inoculación y la concentración de inóculo más efectivos se inocularon nuevamente moras de Castilla. Se prepararon soluciones con diferentes concentraciones de quitosano (0,0; 0,5; 1,0 y 2,0 %) y se aplicaron sobre los frutos inoculados mediante pulverización. Se calculó el IIE y se evaluaron las características físico-químicas y sensoriales de los frutos recubiertos. Los frutos inoculados y aplicados los tratamientos fueron almacenados hasta 14 días a 4 oC y 90 % de humedad relativa. xiv En el segundo ensayo, se recubrieron moras de Castilla desinfectadas con la concentración de quitosano más efectiva para el control de podredumbres durante la poscosecha y que mejores características físico-químicas presentó. Se realizaron análisis microbiológicos y sensoriales de los frutos control y de los frutos recubiertos. Los frutos fueron almacenados hasta 14 días a 4 oC y 90 % de humedad relativa. Se calculó el PVP que tendría un recipiente de 250 g de mora de Castilla con el tratamiento implementado. Se obtuvieron en total 8 géneros de hongos diferentes de la mora de Castilla, Penicillium spp, Botrytis spp, Colletotrichum spp, Mucor spp, Rhizopus spp, Fusarium spp, Geotrichum spp y Cladosporium spp. El IIE más alto se obtuvo con Botrytis spp con un valor de 88,43 % al inocular 10 5 conidias mL-1 mediante inmersión de los frutos en la suspensión de esporas. El tratamiento más efectivo para el control de podredumbres durante la poscosecha de mora fue el de quitosano al 2 %, con un valor del IIE de 50, 92 %. Además, este recubrimiento no alteró las propiedades físico-químicas de los frutos, preservó su calidad organoléptica y mantuvo los límites de aerobios totales, coliformes totales y hongos y levaduras dentro de los rangos permitidos durante los 14 días de almacenamiento en refrigeración. El precio de venta al público del envase con 250 g de moras sería $ 3,65. xv INTRODUCCIÓN La mora de Castilla (Rubus glaucus) pertenece a la familia de las Rosaceas. Los frutos son carnosos, tienen forma redondeada y están conformados por drupas pequeñas. El color de las moras varía entre rojo y negro brillante conforme avanza su desarrollo y su sabor es agridulce (INEN, 2010). Este cultivo proviene de la Cordillera de los Andes ecuatorianos y colombianos (Martínez, Beltrán, Velastegui, Yánez y Valle, 2007, p.5). A nivel nacional, la mora de Castilla se produce en una altitud entre los 1 800 y 3 000 msnm, y se tiene una extensión de cultivo de aproximadamente 5 200 ha. La producción anual está entre 12 y 14 T, y las pérdidas por pudriciones pueden llegar al 21% de la producción total (Tamara y Vallejo, 2009, p. 6). Los microorganismos responsables de las pudriciones en mora de Castilla son los hongos (Betts, 2013, p. 10). Los principales hongos que se desarrollan en estos frutos son Botrytis spp, Rhisopus spp y Colletotrichum spp (Ramírez, Aristizábal y Restrepo, 2013, p. 180). La mora se caracteriza por su bajo valor calórico, y por la gran cantidad de pigmentos naturales y antioxidantes polifenólicos que posee (antocianinas y carotenoides) (Huang, Zhang, Liu y Chun, 2012, p. 98). Los antioxidantes polifenólicos son compuestos bioactivos que protegen al cuerpo humano de radicales libres y moléculas inestables que causan daño celular y posteriormente crónicas enfermedades degenerativas. Las antocianinas además, dan a las moras su color oscuro, y protegen al cerebro del estrés oxidativo. (DRISCOLLS, 2010). Los objetivos de esta investigación fueron aislar e identificar los diferentes géneros de hongos causantes de podredumbres durante el periodo poscosecha de la mora de castilla (Rubus glucus) para determinar el género de hongo más patogénico. Aplicar un tratamiento poscosecha en los frutos y evaluar su efectividad contra las podredumbres fúngicas. El tratamiento poscosecha consistió en la pulverización de los frutos con soluciones de quitosano. El quitosano es un polisacárido de origen natural con una importante xvi aplicación en la agroindustria debido a sus propiedades antifúngicas y antibacterianas. (Moreno, Cartaya, González, Reynaldo y Ramírez, 2012, p. 70). El uso del quitosano en recubrimientos para frutos y hortalizas reduce el desarrollo de pudriciones durante el almacenamiento causadas por Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Mucor spp, Penicillium expansum entre otros (Ramos et al., 2010, p. 50). Al formar una película semipermeable, el quitosano ocasiona cambios físicoquímicos favorables en el metabolismo de frutos y hortalizas alargando su vida de anaquel. Además, este polímero, induce mecanismos de defensa, tales como la producción de fitoalexinas y el aumento en la actividad de quitinasas (Artés, 2005, p. 66). El quitosano al ser un producto biodegradable y no tóxico puede ser una opción distinta al uso de fungicidas de síntesis química. Se puede utilizar en tratamientos poscosecha de frutas y hortalizas de esta manera alcanzar una agricultura sustentable (Lárez, 2008, p. 19). 1 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 GENERALIDADES DE LA MORA DE CASTILLA 1.1.1 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Y TAXONÓMICA La mora de Castilla (Rubus glaucus) es un arbusto anual, trepador, semi erecto que se originó en la Cordillera de los Andes ecuatorianos y colombianos. En la actualidad, por su resistencia a zonas altas y temperaturas bajas, está diseminada en la mayoría de las regiones del mundo con excepción de las zonas desérticas (Martínez et al., 2007, p.5). La planta posee una raíz principal pivotante y raíces secundarias que no profundizan, el tallo es herbáceo y se ramifica en tallos secundarios redondeados y espinosos con un diámetro comprendido entre 1 y 5 cm. Las hojas tienen 3 folíolos, son de forma ovoide y miden entre 3 y 5 cm, están dispuestas en forma alterna y tienen bordes enteros o ligeramente dentados. Las inflorescencias son blancas, pequeñas, lanceoladas y de pedúnculo corto (ICA, 2011, p. 12; MAGAP, 2013, p. 8). El fruto es colectivo, pequeño, su tamaño varía entre 18 y 30 mm, y su peso puede ser de 3 a 7 g, tiene forma esférica o elipsoidal, está compuesto por drupas (de 100 a 120) adheridas al receptáculo floral, dentro de las cuales se encuentran las diminutas semillas ovoides de color marrón claro. El color de las moras varía de rojo a negro brillante según avanza su desarrollo y tiene un sabor ligeramente dulce (INEN, 2010; Martínez et al., 2007, p. 12). Las condiciones ambientales recomendables para el desarrollo del cultivo son suelos franco arcillosos que posean altos contenidos de materia orgánica, fósforo y potasio, con un pH comprendido entre 5,2 y 6,7. Requiere una precipitación pluvial anual entre 1 500 y 2 000 mm. La fructificación empieza a los 18 meses y se tiene un rendimiento aproximado de 14 t ha-1 (Casaca, 2005, p. 18). La mora de Castilla está clasificada dentro de la familia de las Rosaceas como se muestra en los datos de la Tabla 1.1. 2 Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la mora de Castilla Reino Vegetal División Antofita Clase Dicotiledónea Subclase Arquiclamídea Orden Rosales Familia Rosácea Género Rubus Especie glaucus Nombre científico Rubus glaucus (Cadena, 1985, p. 34) 1.1.2 COMPOSICIÓN NUTRICIONAL DEL FRUTO La mora de Castilla se caracteriza por su bajo valor calórico, y por la gran cantidad de pigmentos naturales y antioxidantes polifenólicos que posee como polifenoles, estilbenos, tocoferoles y carotenoides. Estos compuestos bioactivos pueden proteger al cuerpo humano de radicales libres y moléculas inestables que causan daño celular (Huang et al., 2012, p. 98). Las antocianinas dan a las moras su color oscuro y brillante, y pueden evitar daños en el cerebro debido a estrés oxidativo (Shi, 2010, p. 21). La mora de Castilla constituye un recurso alimenticio de excelente calidad, se caracteriza por ser rica en minerales y en vitaminas, aromática, ligeramente dulce y de muy buen sabor, la composición nutricional de esta fruta se presenta en la Tabla 1.2. 3 Tabla 1.2. Composición nutricional en 100 g de mora de Castilla Factor nutricional Cantidad Agua (g) 92,80 Carbohidratos (g) 5,60 Proteínas (g) 0,60 Fibra (g) 0,50 Cenizas (g) 0,40 Grasa (g) 0,10 Calcio (mg) 42,00 Fósforo (mg) 14,00 Hierro (mg) 1,20 Ácido ascórbico (mg) 15,00 Niacina (mg) 0,40 Retinol (mg) 0,15 Riboflavina (mg) 0,04 Tiamina (mg) 0,02 (Casaca, 2005, p. 24) 1.1.3 COSECHA Y POSCOSECHA DE LA MORA DE CASTILLA Los frutos son no climatéricos y altamente perecederos. La recolección se efectúa una vez alcanzada la madurez comercial, cuando los frutos presentan consistencia dura, firme y color vino tinto brillante. La mora de Castilla tiene maduración escalonada, mientras ciertos frutos del arbusto ya están maduros, otros pueden tener menor grado de madurez, por lo tanto la cosecha se debe realizar diariamente una vez que empieza la fructificación, aproximadamente después de 6 a 8 meses de trasplantar el cultivo. Los frutos se deben recolectar temprano en la mañana, (6h00) para evitar horas calurosas que ocasionan pérdida de agua, peso, frescura y posibles fermentaciones (Casaca, 2005, p. 25). El carácter espinoso de la planta hace de la cosecha la parte más delicada del cultivo, el recolector debe ser cuidadoso y no sostener más de un fruto en la mano para evitar daños. La madurez de la mora se aprecia visualmente, el índice de 4 madurez 3 es el más recomendable para frutos dirigidos a mercados internacionales y 4 para mercados nacionales, los colores de los frutos se pueden observar en la Figura 1.1. Los frutos con índice 3 ya alcanzan la forma, tamaño y acumulación de sólidos solubles y ácidos recomendables para la comercialización (Ayala, Valenzuela y Bohórquez, 2013, p. 16). Figura 1.1. Escala del índice de color de la mora de Castilla (INEN, 2010) Se deben tomar los frutos que presenten un grado de madurez uniforme con los dedos pulgar e índice y desprender suavemente de la planta con movimientos hacia los lados. Para disminuir la manipulación es recomendable clasificar los frutos según el tamaño (grande, mediano o pequeño) y la calidad (exportación, mercado interno o procesamiento) en el momento de la recolección y colocarlos en recipientes plásticos inocuos no puntiagudos con capacidades de 0,25, 0,5 o máximo 1,0 kg (INEN, 2010). Es necesario mantenerlos bajo sombra y protegidos del viento, la exposición al sol puede alterar el color y la apariencia de la mora (Casaca, 2005, p. 25). No se debe recolectar frutos que han caído de la planta, ni mezclar frutos sanos con material extraño o con frutos demasiado maduros, dañados, deformes o maltratados. Es importante no dejar en la planta frutos enfermos, dañados o con algún tipo de insecto debido a que contaminarán y diseminarán la enfermedad al resto de las cosechas (Grijalba, Calderón y Pérez, 2010, p. 32). Toda la fruta defectuosa debe ser removida y colocada en un contenedor separado. Usar empaques adecuados es fundamental para mantener la integridad del fruto, 5 en lo posible, se debe seleccionar empaques de polietileno tereftalato y polipropileno (Sora, Fischer y Flórez, 2006, p. 310) con una altura máxima de 5 cm. En los empaques se deben almacenar cómodamente hasta 2 capas de frutos, de esta manera se evita el impacto, compresión, abrasión y pérdida de agua de las drupas (FAO, 2015). Para extender el tiempo de anaquel de las moras se aconseja someterlas a un pre enfriamiento durante las 2 horas posteriores a la cosecha. El enfriamiento mediante la convección forzada de aire es el método más utilizado para enfriar mora de Castilla. Consiste en pasar elevados volúmenes de aire frío a presión y humedades relativas altas (90 - 95 %) a través de los frutos empacados. Se puede llevar a cabo con circulación continua de aire en cámaras donde el tiempo de enfriamiento puede ser de 8 a 12 h. Otra técnica es colocar los frutos en túneles de enfriamiento por los que circula aire con alta velocidad (entre 5 y 15 m/s), el tiempo de enfriamiento está comprendido entre 1 y 6 h. (Barreiro y Sandoval, 2006, p. 13). La temperatura de la pulpa debe alcanzar 0 – 1 oC (Casaca, 2005, p. 22). El transporte de los frutos debe realizarse en furgones refrigerados a una temperatura de 0 – 1 oC y 90 – 95 % de humedad relativa desde el lugar de acopio hasta el mercado definitivo (la cadena de frío debe mantenerse en aeropuertos, aduanas y estanterías) para mantener y preservar la calidad físico-química de la mora de Castilla (Martínez et al., 2007, p. 13). Bajo estas condiciones de almacenamiento el tiempo de vida de los frutos puede alcanzar los 10 días (PerkinsVeazie, 2010, p. 5). 1.1.4 CULTIVO DE MORA DE CASTILLA EN ECUADOR En Ecuador se conocen varias especies de moras o zarzamoras, las de mayor producción son la mora de Castilla y la mora Brazos. Las regiones óptimas para su cultivo son los valles del Callejón Interandino, a una altura entre 1 800 y 3 000 m (Tamara y Vallejo, 2009, p. 6). La mora de Castilla se cultiva en las provincias de Tungurahua, Cotopaxi, Pichincha, Imbabura, Carchi y Bolívar, en una extensión de 6 5 200 ha, la producción anual está entre 12 y 14 t (INIAP, 2011). En la Tabla 1.3, se puede observar la evolución de las exportaciones de la mora de Castilla en los últimos 5 años. Desde el año 2010 hasta el año 2014 la cantidad exportada aumentó considerablemente pero decreció en el año 2014 debido al incremendo de los aranceles a los píses importadores (BCE, 2015). Tabla 1.3. Evolución de la exportación de mora de Castilla en Ecuador Año Toneladas exportadas FOB Dólar 2010 0,15 0,47 2011 6,60 14,22 2012 18,73 37,70 2013 30,31 92,28 2014 11,18 30,04 (BCE, 2015) Los principales destinos de la mora ecuatoriana han sido Estados Unidos y España con un 76% de la producción como se muestra en la Figura 1.2. 6% Estados Unidos 4% España 7% Antillas Holandesas 7% 20% 56% Alemania Holanda Otros Figura 1.2. Principales destinos de la mora ecuatoriana del año 2010 al 2014 (Tamara y Vallejo, 2009, p. 7) En Ecuador el consumo de este fruto en estado natural es de aproximadamente 2 kg por familia semanalmente, también se consume en refrescos, mermeladas y 7 conservas. A nivel nacional su demanda es alta y se deben tomar en cuenta los requisitos que debe reunir el fruto, como ausencia de residuos de pesticidas, empaque adecuado y una excelente presentación para poder comercializarse (MAGAP, 2013, p. 9). 1.1.5 CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA Y NUTRICIONAL DEL FRUTO 1.1.5.1 Parámetros físicos 1.1.5.1.1 Tamaño y forma Los frutos tienen forma redondeada o elipsoidal con un peso comprendido entre 3,0 y 7,0 g, el tamaño es un factor de calidad que varía según la zona de producción (Ayala et al, 2013, p. 17). La clasificación de la mora de Castilla según la correlación entre el diámetro y la longitud del fruto (calibre) se puede observar en la Tabla 1.4. De acuerdo al calibre que presentan, los frutos son destinados a los diferentes mercados, moras grandes son de exportación y moras medianas y pequeñas son de consumo interno. Tabla 1.4. Clasificación de la mora de Castilla según el calibre Calibre Diámetro (mm) Longitud (mm) Grande Mayor a 25 Mayor a 25 Mediano Entre 25 y 18 Entre 25 y 20 Pequeño Menor a 18 Menor a 20 (INEN, 2010) 1.1.5.2 Parámetros químicos 1.1.5.2.1 Sólidos solubles totales Están compuestos por azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa), ácidos, sales y 8 demás compuestos solubles en agua presentes en las células de los frutos, se miden en grados Brix y se expresa como el porcentaje de sacarosa presente en la pulpa. Para su determinación se emplea un refractómetro (ICTA, 2003, p. 13). Durante el proceso de maduración de la mora el contenido de sólidos solubles totales varía, mientras más maduros se encuentren los frutos, existe mayor cantidad de estos debido a la transformación de ácidos orgánicos en azúcares o a la translocación de carbohidratos de reserva a sacáridos simples en las membranas celulares (Ayala et al., 2013, p. 17). La mora de Castilla debe tener al menos 7 grados Brix el momento de la cosecha, este valor se incrementa conforme aumentan los días de almacenamiento (Badenes y Byrne, 2012, p. 12). 1.1.5.2.2 Acidez activa pH La cuantificación de la concentración de iones hidronio H3O+ o pH es la medida potenciométrica más importante de la industria agroalimentaria, se relaciona con el contenido de ácidos presentes en los frutos. La acidez activa se determina con un pHmetro, equipo que consta de un electrodo de vidrio que genera una corriente eléctrica proporcional a la concentración de protones de la solución que se transforma en unidades de pH (Severiche, Castillo y Acevedo, 2013, p. 22). El pH de la mora de Castilla varía entre 3,9 y 4,5 el momento de la cosecha y puede aumentar ligeramente, sin presentar diferencias significativas durante el período de almacenamiento debido a la actividad de enzimas específicas que promueven la acumulación de azúcares (Ulloa, 2007, p. 15). 1.1.5.2.3 Acidez titulable total Durante los procesos metabólicos normales por los que atraviesan frutas y hortalizas se acumulan ácidos orgánicos en los tejidos, su concentración disminuye durante el proceso de maduración (Domene y Segura, 2014, p. 8). En la mora de 9 Castilla los ácidos solubles son cítrico, málico, succínico y fumárico, de los cuales el ácido predominante es el ácido cítrico con cantidades comprendidas entre 5,69 y 12,02 g kg-1 (Gazioglu, Gundogdu, Sensoy, Celik y Dogan, 2015, p. 80). Se calcula mediante volumetría ácido-base, donde se utiliza NaOH 0,1 N como base y fenolftaleína como indicador, se expresa en % de ácido cítrico y es aproximadamente 2,65% en mora de Castilla el momento de la cosecha (Barreiro y Ruiz, 2006, p. 50). 1.1.6 FUNGICIDAS DE SÍNTESIS QUÍMICA UTILIZADOS EN EL CULTIVO Los fungicidas son sustancias tóxicas de síntesis químicas con acción biocida utilizados para el control de enfermedades fúngicas de los cultivos. Las técnicas de aplicación de fungicidas a la mora de Castilla pueden ser mediante rociado, pulverizado, por revestimiento o fumigación de locales. Previamente a la aplicación se debe conocer el tipo patógeno que ataca al cultivo y su modo de infección (Viñas, Recasens, Usall y Graell, 2013, p. 38). Los fungicidas pueden ser de contacto o sistémicos. Los fungicidas de contacto se rocían directamente sobre la mora para que formen una película protectora e impidan la germinación de esporas, estos productos no ingresan a la planta. Los fungicidas sistémicos se suministran por medio del agua de riego y son absorbidos por el sistema vascular, actúan en zonas específicas que han sido atacadas por hongos patógenos (Crop Science, 2008). Estos productos pueden ser aplicados durante la precosecha o en la poscosecha de los cultivos. Los fungicidas químicos aplicados durante la precosecha penetran en los tejidos de las plantas y controlan o previenen la germinación de esporas de hongos patógenos. Los residuos de estos productos pueden ser retirados de la superficie de los frutos el momento del lavado o encerado. Los productos más utilizados en esta etapa tienen como materia activa captan, ciproconazol, ciprodinil, difenoconazol, febuconazol, fenhexamida, tebuconazol (Gaviara et al., 2013, p. 70). folpet, iprodiona, metiltiofanato, 10 Los fungicidas químicos que se aplican en la poscosecha protegen a los frutos del ataque de patógenos como Penicillium spp, Mucor spp, Alternaria spp y de infecciones de heridas. Los productos más utilizados en esta etapa tienen como materia activa folpet, imazalil, tiabendazol (Gavira et al., 2013, p. 71). El Imazalil es un fungicida eficaz para prevenir fisiopatías asociadas a daños por frío y pudriciones en cítricos, peras, manzanas, piñas y moras durante el almacenamiento. También es efectivo para el tratamiento de semillas de papa. Es uno de los más inocuos debido a la rápida absorción en el tubo digestivo y excreción de sus metabolitos en la orina en el transcurso de 24 h. El modo de empleo puede ser por pulverización o baño directo de los frutos en 0,5 cm 3 de producto por litro de agua (Miranda et al., 2009, p. 52). La aparición de cepas patogénicas resistentes a fungicidas autorizados provoca un incremento en la dosis de estos productos en busca de su efectividad. El uso indiscriminado de fungicidas químicos aumenta la cantidad de residuos tóxicos en los frutos, contribuye a la contaminación del aire, suelo y mantos freáticos y puede contaminar gravemente las aguas subterráneas. Es importante recalcar que las aplicaciones de estos productos se realizan a través de pulverizadores o en duchas, por lo que es necesario grandes cantidades de agua, y energía. 1.2 FACTORES QUE INCIDEN EN LAS PODREDUMBRES DURANTE LA POSCOSECHA DE LA MORA DE CASTILLA 1.2.1 FACTORES PRECOSECHA 1.2.1.1 Suelo El soporte físico capaz de sostener y nutrir el cultivo es de gran importancia para el desarrollo de la planta y para que los frutos producidos presenten las mejores características de calidad. Para el cultivo de mora, el suelo debe ser franco arcillosos (debe poseer acilla, limo, arena, fósforo y potasio), con suficiente cantidad 11 de materia orgánica (mayor al 5 %) y capaz de retener humedad para que la planta desarrolle frutos sanos, de color agradable y con suficiente dulzor. Es indispensable que el suelo presente un buen drenaje ya que la mora de Castilla es susceptible al encharcamiento y la acumulación de agua en el suelo contribuye a la proliferación de microorganismos patógenos como Botrytis cinerea. Este hongo puede llegar hasta los frutos e infectarlos, ocasionando graves pudriciones y pérdidas comerciales. También es importante una adecuada aireación en el cultivo, que permite a la planta secarse con facilidad después del riego o después de haber llovido para así evitar daños por alta humedad (Handley, 2006, p. 3). Es necesario realizar un análisis de suelo para verificar que se cumple con los requerimientos nutricionales del cultivo, pH, acidez, materia orgánica y eliminar todo tipo de malezas y hierbas antes del trasplante para evitar la contaminación de plagas y microorganismos a la planta. Otro aspecto importante es tomar en cuenta los cultivos que existieron previamente a la plantación de mora de Castilla, ya que cultivos de tomate, papa, pimiento, berenjena, tabaco y frutilla incrementan el riesgo de infección por hongos del género Verticillium spp. Cultivos de durazno, manzana y frambuesa pueden ocasionar pudrición de la raíz de la mora a causa de Phytophthora spp. Cultivos de maíz y trigo pueden beneficiar la producción de mora debido a que reducen problemas de nemátodos y malezas portadoras de microorganismos que al llegar hasta los frutos ocasionan graves pudriciones (Fernandez y Ballington, 2005, p. 2). 1.2.1.2 Condiciones ambientales En este factor se incluyen humedad relativa, temperatura, vientos, iluminación y precipitación, que determinarán el tiempo de vida útil de los frutos. La mora de Castilla tiene un amplio rango de adaptación a distintas condiciones ambientales, sin embargo, para que el cultivo desarrolle frutos sanos y de calidad se requieren condiciones óptimas. 12 La humedad ambiental debe variar entre 70 y 80 %, ya que humedades mayores favorecen la incidencia de microorganismos causantes de podredumbres y enfermedades. La temperatura es fundamental para el desarrollo vegetativo, floración y formación de los frutos y debe variar entre 11 y 25 oC, temperaturas más bajas sensibilizan a los frutos a enfermedades. La altitud de la plantación debe estar entre 1 800 y 2 400 msnm, ya que en altitudes mayores se pueden presentar heladas con frecuencia que afectan la producción y en altitudes menores se tiene mayor cantidad de problemas fitosanitarios. Respecto a la luminosidad el cultivo necesita de 1 200 a 1 600 horas de brillo solar al año. Los frutos de las partes externas del cultivo son más sensibles a enfermedades mientras que los frutos de las partes internas son más susceptibles a podredumbres. Las zonas que presentan precipitaciones anuales entre 1 500 a 2 500 mm son los lugares donde mejor se desempeña el cultivo, niveles más elevados de pluviometría facilitan la esporulación de hongos patógenos (Casaca, 2005, 23). En condiciones ambientales más severas el cultivo podrá desarrollarse pero tendrá menor rendimiento y los frutos serán de menor tamaño y calidad (Franco y Giraldo, 2002, p. 20). 1.2.1.3 Labores culturales Algunos de los trabajos que se deben realizar en los cultivos de mora de Castilla desde el trasplante hasta la cosecha para evitar o minimizar plagas y enfermedades son podas, tutorado, riego, fertilización y nutrición, control de malezas y renovación de la plantación. Las podas del cultivo favorecen la sanidad de la plantación, reducen las pérdidas poscosecha causadas por hongos, facilitan la movilización entre las plantas, extienden el período de cosecha y permiten obtener frutos de mejor calidad. Se requiere para esta labor personal capacitado y equipo adecuado (MAG, 2014). Se 13 debe realizar tres tipos de podas en los cultivos de mora (Casaca, 2005, p. 25): de formación, de mantenimiento y de renovación. Se colocan tutores o guías a los arbustos de la mora con el fin de conducir o sostener la planta, permitir la entrada de luz y aire al cultivo. Facilitar el crecimiento y cosecha de los frutos, impedir que estos toquen el suelo y así aumentar la producción y eficiencia (Delgado, 2012, p. 9). Los sistemas y la calidad del agua de riego son de gran importancia para evitar retraso en el crecimiento y el desarrollo vegetativo del cultivo de mora de Castilla y minimizar ataques de plagas y enfermedades. Será necesario optar por un sistema de riego tecnificado, el más conveniente es por goteo, este método no maltrata la planta y permite optimizar recursos, insumos y personal (Reyes, 2013). Previamente a la fertilización y enriquecimiento nutricional del cultivo es necesario realizar un análisis de suelo para no provocar excesos o deficiencias de elementos que ocasionen fisiopatías. Las cantidades de los elementos de la Tabla 1.5, y la relación entre los elementos de la Tabla 1.6, son una guía para la interpretación de los resultados del análisis, cualquier desbalance ocasionará una alteración en el rendimiento y la calidad de los frutos y predispondrá a la planta al ataque de hongos. Tabla 1.5. Cantidades de los elementos requeridos en el cultivo de mora de Castilla y su interpretación Deficiencia Rango óptimo Exceso - 0,3 > 1,5 < 4,0 4,0 – 20,0 > 20,0 < 1,0 1,0 – 10,0 > 10,0 K < 0,2 0,2 – 1,5 > 1,5 P < 10,0 10,0 – 40,0 > 40,0 Mn < 5,0 5,0 – 50,0 > 50,0 < 3,0 3,0 – 15,0 > 15,0 Cu < 1,0 1,0 – 20,0 > 20,0 Fe < 10,0 10,0 – 50,0 > 50,0 Elemento Unidades Al Ca Mg Zn (MAG, 2014) Meq/100 mL µg/mL 14 Tabla 1.6. Relación entre los elementos del cultivo de mora de Castilla y su interpretación Relación Desbalance Balance Desbalance Ca/Mg < 2,0 2,0 – 5,0 > 5,0 Mg/K < 2.5 2,5 – 15,0 > 15,0 Ca+Mg/K < 10,0 10,0 – 40,0 > 40,0 Ca/K < 5,0 5,0 – 25,0 > 25,0 (MAG, 2014) Es recomendable combinar o alternar fertilizantes orgánicos e inorgánicos para mejorar la estructura del suelo, aumentar la capacidad de retención de agua, disminuir la lixiviación y proteger las plantas de la erosión (MAG, 2014). Las plantas conocidas comúnmente como malas hierbas compiten por agua, nutrientes, luz y espacio con los arbustos de la mora. Estas plantas hospedan a insectos y microorganismos patógenos, y pueden emitir compuestos tóxicos como exudados radicales y lixiviados foliares dañinos para los cultivos. Existen diferentes métodos para el control de estas hierbas, manual o mecánico, biológico y químico. Antes de escoger uno o la combinación de estos se deben considerar aspectos como el tipo y la densidad de hierba a combatir, la topografía y la accesibilidad del área del cultivo (FAO, 2015). La mora de Castilla presenta una producción estable entre 10 y 12 años si el manejo y los cuidados del cultivo han sido desarrollados adecuadamente. Después de este tiempo se debe renovar la plantación para que la producción no disminuya (Durán, 2010, p. 18). Otros aspectos importantes a tener en cuenta son inspeccionar regularmente el cultivo para advertir la presencia de plagas y enfermedades y así poder controlarlas rápidamente, desinfectar las herramientas podadoras que se utilicen con productos en base a cloro o yodo, calibrar regularmente las boquillas de fumigación y mantenerlas en buen estado (ICA, 2011, p. 25). 15 1.2.2 MICROORGANISMOS PATÓGENOS Un fruto sano debe tener una buena capacidad de conservación y defensa contra el ataque de microorganismos patógenos, sin embargo esta capacidad natural puede alterarse debido a agentes abióticos (desbalances nutricionales, estrés ambiental y toxicidad química) y ocasionar deterioros y pudriciones (Tello y Camacho, 2010, p. 29). Los agentes bióticos responsables de alteraciones en los tejidos de los frutos como reblandecimiento, exudación, sabores y olores desagradables y la síntesis de compuestos tóxicos son las bacterias, los hongos y los virus. Estos microorganismos ingresan a la planta por medio de aberturas naturales como estomas o heridas superficiales provocadas por insectos o por el personal de laboreo. Los microorganismos patógenos más comunes en mora de Castilla son los hongos (Tamara y Vallejo, 2009, 38). 1.2.2.1 Hongos Son organismos eucariotas compuestos por una o varias células, tienen nutrición heterótrofa, son parásitos de plantas o animales, la mayoría son saprófitos y pueden producir enzimas. Su reproducción puede ser de forma sexual por la unión de gametos o asexual por gemación, esporulación o fragmentación en el medio extracelular. Se clasifican en hongos filamentosos o mohos y levaduras (Trigos, Ramírez y Salinas, 2008, p. 126; Vargas y Villazante, 2014, p. 2310). Los hongos filamentosos poseen un micelio verdadero con hifas aéreas y subterráneas, como se muestra en la Figura 1.3. Se puede reconocer su crecimiento en alimentos contaminados debido a su aspecto aterciopelado y algodonoso. Se desarrollan en medios con temperaturas frías o moderadas, humedad relativa alta y agua libre sobre la superficie (Betts, 2013, p. 10). 16 Figura 1.3. Estructura de un hongo filamentoso (Botrytis cinerea) Los hongos pueden llegar a los frutos por medio de infecciones adquiridas en cualquier parte del cultivo o contaminaciones durante la cosecha, el momento del transporte o en el almacenamiento de la mora. Los principales hongos que provocan pudriciones durante la poscosecha de mora de Castilla son Botrytis spp, Rhizopus spp, Colletotrichum spp, Penicillium spp, Mucor spp y Fusarium spp (Ramírez et al., 2013, p. 180). 1.2.2.1.1 Botrytis spp Pertenece a la clase Deuteromycetes u hongos imperfectos. Las colonias de Botrytis son de crecimiento rápido de aspecto algodonoso y de color pardo. Se caracteriza por presentar abundantes micelios de color gris y varios conidióforos ramificados con racimos de conidios en los extremos como se puede observar en la Figura 1.4, (Elad, Williamsoon, Tudzynsky y Delen, 2005, p. 9). Este hongo ocasiona la enfermedad conocida como moho gris. 17 Figura 1.4. Aspecto microscópico de Botrytis spp (Crop Science, 2008) Si la infección se presenta en precosecha el patógeno necrosa los tallos y momifica los frutos inmaduros, si se presenta durante la poscosecha o el almacenamiento descompone los frutos como se observa en la Figura 1.5, (Dominguez, Carrero, Pino y Quintero, 2009, p. 79). Figura 1.5. Mora de Castilla infectada con Botrytis spp (Crop Science, 2008) 18 1.2.2.1.2 Rhizopus spp Pertenece a la clase Zygomycetes con hifas no septadas. El micelio de este hongo es algodonoso y de crecimiento rápido, de color blanco al inicio y posteriormente gris, sobre el micelio se encuentran numerosos estolones que conectan los esporangióforos. En la base de los esporangióforos se forman hifas que pueden ser de tres clases, rizoides, estolones y esporangios como se puede ver en la Figura 1.6, (Ramirez, Neira y Correa, 2007, p. 416). Figura 1.6. Aspecto microscópico de Rhizopus spp (Crop Science, 2008) Este hongo es el causante de la podredumbre blanda en la mora de Castilla. Se desarrolla rápidamente en frutos con la superficie húmeda. Inicialmente el hongo crece en el interior de la mora, degrada la pared celular, absorbe los nutrientes y avanza hacia el exterior para cubrirlo con esporangios negros. Los frutos infectados con Rhizopus pierden humedad, se arrugan y momifican como se puede observar en la Figura 1.7, (UNAD, 2013). 19 Figura 1.7. Mora de Castilla infectada con Rhizopus spp (Crop Science, 2008) 1.2.2.1.3 Colletotrichum spp Pertenece a la clase Ascomycetes. El micelio presenta ramificaciones y puede ser de color gris, salmón, naranja, verde o blanco dependiendo de la especie. Este género presenta conidias hialinas, unicelulares y fusiformes ubicadas dentro de una estructura reproductiva denominada acérvulo como se puede observar en a Figura 1.8, (Cerón, Higuera, Sánchez, Bustamante y Buitrago, 2006, p. 100). Figura 1.8. Aspecto microscópico de Colletotrichum spp (Crop Science, 2008) 20 Las especies fúngicas de este género causan una enfermedad grave ampliamente distribuida denominada Antracnosis. Si la enfermedad se presenta durante la precosecha los frutos se deshidratan, momifican y finalmente caen de la planta. Si la enfermedad se presenta en poscosecha los síntomas de los frutos son necrosis, pudrición húmeda y deshidratación como se puede observar en la Figura 1.9, (Gavira, Patiño y Saldarriaga, 2013, p. 68). Figura 1.9. Mora de Castilla infectada con Colletotrichum spp (Casaca, 2005, p. 28) 1.2.2.1.4 Penicillium spp Pertenece a la clase Deutoromycetes. Se caracteriza por la formación de conidios mediante estructuras ramificadas semejantes a pinceles (conidióforos) que se pueden observar en la Figura 1.10. Los conidios tienen forma esférica o elíptica y agrupados adquieren tonalidades verdosas o azuladas (Trigos et al., 2008, p. 127). 21 Figura 1.10. Aspecto microscópico de Penicillium spp (Visagie et al., 2014, p. 358) En las moras se presenta inicialmente como una podredumbre blanda, acuosa y de color marrón claro que luego se cubre de esporas de tonalidades verdes como se puede observar en la Figura 1.11. Los hongos ingresan a los frutos a través de heridas ocasionadas por su manipulación inadecuada (Visagie et al., 2014, p. 350). Figura 1.11. Mora de Castilla infectada con Penicillium spp (Casaca, 2005, p.28) 22 1.2.2.1.5 Mucor spp Pertenece a la clase Zygomycetes. Este hongo presenta colonias de crecimiento rápido, aspecto algodonoso y coloración que varía de blanca o amarilla a parda o gris. Presenta esporangióforos simples o ramificados con esporangios redondos en los extremos, en su interior se desarrollan las esporangiosporas que se pueden observar en la Figura 1.12, (Trigos et al., 2008, p. 127). Figura 1.12. Aspecto microscópico de Mucor spp (Mycology Online, 2015) En los frutos de mora de Castilla, Mucor spp crece rápidamente provocando una pudrición blanquecina al principio y posteriormente gris como se observa en la Figura 1.13. Figura 1.13. Mora de Castilla infectada con Mucor spp (Delgado, 2012, p. 30) 23 1.2.2.1.6 Fusarium spp Pertenece a la clase Ascomycetes. Las colonias de este hongo tienen coloración blanca, crema, naranja, rosa o rojiza. El micelio es abundante y de aspecto algodonoso. Presenta conidióforos simples o ramificados que pueden estar agrupados en esporodoquios. Los macroconidios tienen forma de media luna, son hialinos y septados como se observa en la Figura 1.14. Los microconidios pueden ser fusiformes u ovales (Tapia y Amaro, 2014, p. 85). Figura 1.14. Aspecto microscópico de Fusarium spp (Heffer y Johnson, 2007, p. 42) En la mora de castilla este hongo provoca pudriciones blanquecinas, amarillentas, parduzcas o rosadas de aspecto algodonoso durante el almacenamiento como se puede observar en la Figura 1.15. Fusarium spp produce micotoxinas patógenas para las personas (Heffer y Johnson, 2007, p. 43). Figura 1.15. Mora de Castilla infectada con Fusarium spp (Heffer y Johnson, 2007, p. 42) 24 1.3 TRATAMIENTOS ALTERNATIVOS PARA EL CONTROL DE PODREDUMBRES POSCOSECHA EN MORA DE CASTILLA Los tratamientos poscosecha suministrados a mora de Castilla son importantes para protegerlas del ataque de hongos patógenos causantes de ablandamientos, pardeamientos, y descomposición, y para alargar el tiempo de vida útil y comercialización de los frutos. Además, permiten ofrecer al mercado productos nutritivos, sanos y libres de residuos químicos (Palou, 2007, p. 84). 1.3.1 TRATAMIENTOS FÍSICOS 1.3.1.1 Inmersión en agua caliente Es un tratamiento poscosecha que consiste en sumergir los frutos en agua caliente con el objetivo de impedir el crecimiento o germinación de microorganismos patógenos que puedan provocar podredumbres o cambios indeseables en la apariencia, color y sabor de los productos. La temperatura del agua varía entre 40 y 70 oC y el tiempo depende del microorganismo que se pretende destruir. Con este proceso, la incidencia de podredumbre en el producto se reduce en un 50 %, y la carga microbiana disminuye en un 90 % del valor inicial, principalmente aquella que se encuentra en la superficie de los frutos (UNAD, 2013). 1.3.1.2 Curado El curado es un tratamiento alternativo al uso de fungicidas químicos que consiste en mantener los frutos en un ambiente saturado con vapor de agua a temperaturas altas (50 oC) durante largos períodos de tiempo (2 h). La humedad relativa del ambiente debe permanecer elevada (90 – 95 %) para que los frutos no se deshidraten. Este tratamiento estimula los mecanismos de defensa de los 25 productos contra la invasión de hongos patógenos causantes de podredumbres durante la poscosecha (UNAD, 2013). 1.3.1.3 Radiación UV-C La luz UV-C es una radiación no ionizante con longitud de onda de 200 – 280 nm. Se basa en la exposición del producto a flashes o pulsos de luz intensa que se emiten generalmente con lámparas de mercurio de baja presión. Esta técnica promueve la inactivación microbiana mediante la alteración de su ADN, reduce la velocidad de maduración de frutas y hortalizas, retrasa la senescencia, induce la acumulación de compuestos bioactivos (carotenoides, ácido ascórbico, compuestos fenólicos), disminuye desórdenes fisiológicos y activa la resistencia a microorganismos patógenos (Haro y Guerrero, 2013, p. 69). 1.3.1.4 Radiación por microondas La radiación por microondas consiste en la aplicación de energía en forma de radiaciones electromagnéticas no ionizantes a frutas, verduras, carnes, pescados y alimentos precocidos. Este tratamiento se utiliza con el fin de eliminar microorganismos patógenos del producto y aumentar el tiempo de vida útil. La gama de frecuencias que se utiliza varía de 3 KHz a 300 MHz. Esta radiación se genera en un dispositivo electrónico denominado magnetrón (Pastor y Martínez, 2005). El tratamiento en mora de Castilla indica que una radiación por microonda a 420 W durante 3 s, un posterior empacado al 90 % de vacío y un almacenamiento a 5 oC prolonga la vida útil de los frutos hasta 8 días (Lopez, Maldonado, Castro y Parada, 2011, p. 154). 26 1.3.2 TRATAMIENTOS QUÍMICOS DE BAJO RIESGO 1.3.2.1 Sustancias naturales 1.3.2.1.1 Aceites esenciales Los aceites esenciales son sustancias antimicrobianas de origen natural formadas por sustancias volátiles, principalmente hidrocarburos o compuestos monofuncionales como alcoholes, acetonas, cetonas, éteres, ésteres, terpenos o aldehídos. Se forman y almacenan en los tejidos vegetales. Se extraen por destilación mediante arrastre de vapor o destilación seca y mediante procedimientos mecánicos (especialmente en los pericarpios de cítricos). Son insolubles en agua y solubles en grasas, ceras, aceites vegetales, disolventes orgánicos (éter, cloroformo) y alcoholes (Ortuño, 2006, p. 56). Existen alrededor de 2 000 especies de aceites esenciales presentes en 100 familias de plantas. Los aceites esenciales de mostaza, tomillo, hoja de canela, clavo, hierba luisa, orégano, nuez moscada y palmarosa se usan como antimicrobianos por sus propiedades fungicidas, acaricidas, insecticidas y germicidas. Inhiben el crecimiento de Fusarium spp, Penicillium spp, Botrytis spp y Aspergillius spp (Murillo, Viña y Correa, 2003, p. 79). Las aplicaciones de aceites esenciales in vitro tienen mayor efectividad que las aplicaciones in vivo. Pruebas in vitro realizadas en placas de PDA demostraron que el aceite esencial de canela con una concentración de 250 ppm inhibe completamente el desarrollo de Botrytis cinerea aislado de mora de Castilla (Gonzales, 2010, p. 29). 1.3.2.1.2 Jasmonatos y ácido salicílico Dentro de los jasmonatos se incluyen al ácido jasmónico y a sus ésteres como el metil jasmonato. Estas fitohormonas son reguladores naturales del crecimiento de 27 las plantas. Tienen la capacidad de inhibir podredumbres en los frutos causadas principalmente por hongos del género Botrytis, Penicillium y Rhizopus. Los jasmonatos y el ácido salicílico incrementan los niveles de proteínas antipatogénicas y compuestos fenólicos antimicrobianos en los frutos, por lo que la capacidad de resistencia al ataque de patógenos aumenta (Gonzales, Zavaleta y Tiznado, 2007, p. 65). 1.3.2.1.3 Quitosano La quitina es un polisacárido de alto peso molecular, insoluble (en agua, disolventes orgánicos, álcalis y ácidos diluidos) y de baja reactividad, está conformada por unidades de N-acetil-D-glucosamina unidas por enlaces β-D (1,4). Es el polímero natural más abundante después de la celulosa, se encuentra principalmente en crustáceos, insectos y hongos. La desacetilación parcial de la quitina en soluciones alcalinas concentradas origina al quitosano, un biopolímero con mejores propiedades de solubilidad en soluciones acuosas de la mayoría de ácidos orgánicos e inorgánicos y es mucho más reactivo debido a que sus grupos amino e hidroxilo pueden ser acilados, alcohilados y reaccionar con bases de Schiff. La estructura química de este polisacárido se puede observar en la Figura 1.16, (Mármol et al., 2011, p. 58). Figura 1.16. Estructura química del quitosano y su producción a partir de quitina (Castañeda, De la Fuente, Pacheco, Ortiz y Barboza, 2011, p. 16) 28 El quitosano se caracteriza por las propiedades antibacterianas y antifúngicas que posee. Las aplicaciones de este polisacárido abarcan campos como la medicina y farmacia, agricultura, biotecnología, industrias alimenticia, textil, papelera y cosmetológica (Moreno et al., 2012, p. 70). Es uno de los polisacáridos más utilizados en la elaboración de recubrimientos comestibles para frutos y hortalizas, su aplicación proporciona excelentes resultados en la reducción de pérdida de peso y firmeza de las frutas. Por su efecto antifúngico reduce el desarrollo de pudriciones durante el almacenamiento causadas por Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Alternaria alternata, Mucor spp, Penicillium expansum entre otros (Ramos et al., 2010, p. 50). Al formar una película semipermeable, el quitosano ocasiona cambios físicoquímicos favorables en el metabolismo de frutos, en general, la síntesis de CO 2, etileno y la pérdida de agua se reducen. Otros cambios en el producto tratado con quitosano son disminución en la pérdida de firmeza y aumento en el contenido de sólidos solubles totales (SST). Además este producto, induce mecanismos de defensa, tales como la producción de fitoalexinas y aumento en la actividad de quitinasas (Artés, 2005, p. 66). El quitosano es una alternativa a los fungicidas químicos de síntesis y puede ayudar a alcanzar una agricultura sustentable. 1.3.2.2 Sustancias GRAS (Generally Recognized As Safe) El organismo responsable del control de los aditivos alimentarios FDA (Food and Drug Administration) estableció en la categoría de sustancias GRAS a productos que han sido utilizados por largos periodos de tiempo sin provocar efectos indeseables. Las sustancias GRAS son reconocidas como seguras y son permitidas sin restricciones por las distintas legislaciones en el campo agroalimentario. A este grupo pertenecen ácidos y sales orgánicas o inorgánicas que pueden sintetizarse fácilmente. 29 Estos productos tienen actividad antimicrobiana y preservante (Palou, 2007, p. 86). Los principales compuestos GRAS con propiedades fungicidas son carbonatos, bicarbonatos, sales sódicas, potásicas, cálcicas y amónicas de ácidos orgánicos (formatos, acetatos, propionatos, sorbatos, benzoatos) e inorgánicos (cloruros, fosfatos, molibdatos), ácido láctico, peróxido de hidrógeno, ácido ascórbico, ácido acético, etanol, hexanol y cloro. 1.3.2.2.1 Carbonatos, bicarbonatos y otras sales Los carbonatos y bicarbonatos son sales ácidas derivadas del ácido carbónico. Estos compuestos fueron declarados por la EPA (Environmental Protection Agency) como sustancias exentas de límites de residuos en las actividades agrícolas y fueron clasificados por el USDA (Unites States Department of Agriculture) como ingredientes autorizados en productos orgánicos (Viñas et al., 2013, p. 43). Al aplicarse en los frutos estas sales se acumulan en los sitios potenciales de infección y alteran las rutas metabólicas de los microorganismos. Se utilizan durante la poscosecha con el fin de controlar podredumbres ocasionadas por hongos patógenos y extender la vida comercial de los productos. La efectividad es alta en cítricos y baja en frutos de hueso (combinar con control biológico) (Kader y Pelayo, 2011, p. 28). 1.3.2.2.2 Ácido cítrico Es un ácido orgánico suave que se encuentra en frutas (cítricos principalmente) y verduras. Tiene propiedades antioxidantes, conservantes, y saborizantes. Su pKa a 25 oC es 6,40. Es un compuesto acidulante y regulador del pH por lo que se utiliza como parte de los tratamientos para el control de microorganismos patógenos responsables de las podredumbres en los frutos (Bucheli, 2008, p. 22). 30 1.3.2.2.3 Ácido ascórbico El ácido ascórbico o vitamina C tiene propiedades antioxidantes y es captador de radicales libres. Se encuentra en frutas y verduras frescas. Su pKa a 25 oC es 4,17. Al igual que el ácido cítrico se utiliza como componente de los tratamientos para el control de microorganismos patógenos responsables de las podredumbres en los frutos (Bucheli, 2008, p. 22). 1.3.2.2.4 Ácido acético Es acidulante, regulador del pH y conservante natural. Se obtiene generalmente por la carbonilación del metanol. Su pKa a 25 oC es 4,80. Es un compuesto que se utiliza como solvente en recubrimientos comestibles para frutos debido a sus propiedades antimicrobianas (Bucheli, 2008, p.23). 1.3.3 CONTROL BIOLÓGICO Los tratamientos biológicos se refieren a la utilización de agentes vivos (antagonistas) con la capacidad natural de controlar el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos. La actividad entre los antagonistas y los patógenos es específica. Antes de elegir un tratamiento biológico es necesario conocer las capacidades de supervivencia del agente en condiciones ambientales y en refrigeración y los mecanismos de acción por los cuales estos microorganismos inhiben a los patógenos. Numerosos hongos filamentosos, bacterias y levaduras pueden controlar las pudriciones poscosecha en los frutos, su modo de acción incluye la competencia por espacio y/o nutrientes, la secreción de antibióticos, la interacción directa con las estructuras del patógeno o la inducción de resistencia en los tejidos del fruto (Palou, 2007, p. 88). Algunos de los agentes de control biológico que se comercializan para su aplicación en frutos son las levaduras Candida oleophila y 31 Crptococcus albidus, la bacteria Pseudomonas syringae y el hongo Trichoderma spp. En poscosecha, las aplicaciones se realizan mediante inmersión o aspersión de los frutos. Estos antagonistas minimizan las pudriciones causadas por hongos patógenos como Botrytis, cinerea, Penicillium expansum, Mucos piriformis, Fusarium sambucinum, Geotrichum citri-auranti, y Helminthosporium solani (Kader y Pelayo, 2011, p. 30). 1.3.4 MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DURANTE LA POSCOSECHA 1.3.4.1 Atmósfera controlada (AC) La atmósfera controlada es una técnica de conservación frigorífica que consiste en reducir los niveles de O2 y aumentar los niveles de CO2 hasta alcanzar los requerimientos de cada producto hortofrutícola y mantenerlos constantes durante el almacenamiento. Los equipos utilizados en los frigoconservadores son dispositivos de detección de gases, medidores de HR y temperatura, generadores de N2, depuradores de CO2 y eliminadores de O2. Esta técnica puede incrementar el tiempo de vida útil de los productos entre 2 y 3 veces más que otros métodos de conservación (Cerón y Rodríguez, 2007, p. 57). Para mora de Castilla las condiciones óptimas de la AC se presentan en la Tabla 1.7. Con estas concentraciones de gases se consigue ralentizar las reacciones químicas y enzimáticas. Se disminuyen las tasas de respiración, transpiración y producción de etileno y se retrasa el deterioro microbiano. El empleo de AC permite alargar el tiempo de vida de anaquel de los frutos sin alterar sus características organolépticas y nutricionales y sin dejar residuos químicos. Esta tecnología no es aplicable a volúmenes pequeños de producto, por lo que es 32 considerablemente costosa (García, Gago y Fernández, 2006, p. 14). Tabla 1.7. Concentración de gases en atmósferas normales de almacenamiento y en atmósferas modificadas Porcentaje de la concentración de gases Gases Atmósfera normal Atmósfera controlada O2 21 % 5 – 10 % N2 78% 70 % CO2 < a 0,1 % 20 - 25 % (Sora et al., 2006, p. 210) 1.3.4.2 Pre-enfriamiento Los tratamientos con frío o pre enfriamientos consisten en la disminución de la temperatura de los frutos de forma rápida en períodos cortos de tiempo, son importantes debido a la reducción de pérdidas en la calidad de los productos, reducen la incidencia de microorganismos patógenos (hongos y bacterias), disminuyen la velocidad de los procesos del metabolismo celular y la pérdida de agua de los frutos, y retardan su senescencia y maduración. En general, extienden el tiempo de vida útil de la mora de castilla siempre y cuando la temperatura de refrigeración no ocasione daños por frío (Sevillano, Sánchez, Romojaro y Borjam, 2008, p. 3). El pre enfriamiento de un producto es la eliminación del calor de este en grado tal que se alcance la temperatura recomendada para su transporte, almacenamiento o procesamiento, los factores más importantes son temperatura y tiempo (el tiempo recomendado para enfriar frutas y hortalizas debe estar entre 1 y 15 h) (Casaca, 2005, p. 33). El enfriamiento mediante la convección forzada de aire es el método más utilizado para enfriar mora de castilla, consiste en pasar elevados volúmenes de aire frío a presión y humedad relativa altas a través de los frutos empacados, de esta forma se extrae el calor de manera rápida y uniforme en condiciones higiénicas. 33 1.3.4.3 Recubrimientos comestibles Los recubrimientos comestibles son finas capas de productos elaborados a base de biopolímeros que envuelven a los frutos con el fin de prolongar su tiempo de vida útil, se ingieren junto con el producto y son una alternativa amigable con el ambiente. Se aplican a frutas frescas y mínimamente procesadas para crear una atmósfera modificada en su interior que ayude a mantener la integridad estructural del producto, formar una barrera contra la humedad y evitar pérdidas de firmeza y peso que afectan directamente el sabor, la apariencia y la calidad en general de los frutos. Presentan permeabilidad a gases como CO2, O2 y vapor de agua, disminuyen la tasa de respiración de los productos, impiden la evaporación de compuestos volátiles y retardan la oxidación enzimática. Los frutos recubiertos son considerados como alimentos saludables debido a que son portadores de ingredientes funcionales como antioxidantes y antimicrobianos (Pérez-Galgo, Del Río y Rojas, 2011, p. 1). 34 2 PARTE EXPERIMENTAL 2.1 IDENTIFICACIÓN DE LOS DIFERENTES GÉNEROS DE HONGOS CAUSANTES DE PODREDUMBRES POSCOSECHA EN MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus) Para el desarrollo de la investigación se utilizó mora de Castilla (Rubus glaucus) proveniente de la granja del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) de Píllaro, provincia de Tungurahua. Los frutos se cosecharon manualmente a tempranas horas de la mañana (6:30 am) para evitar que las horas calurosas afecten su calidad y frescura. Estos frutos fueron recolectados en canastos de 3 Kg de capacidad, y transportados a temperatura ambiente durante 4 horas hasta el laboratorio de Poscosecha del Departamento de Ciencia de Alimentos y Biotecnología (DECAB) de la Escuela Politécnica Nacional. 2.1.1 AISLAMIENTO DE LOS HONGOS PATÓGENOS PRESENTES EN LA MORA DE CASTILLA Con el fin de aislar la mayor cantidad de hongos patógenos, la mora de Castilla se almacenó a temperatura ambiente (20 – 21 oC) por 4 días, de esta manera, los frutos empezaron a presentar síntomas de pudrición. Estas condiciones favorecieron la germinación y esporulación de los hongos causantes de podredumbres durante el período poscosecha. Para el aislamiento se utilizó un total de 180 frutos que se repartieron en 9 repeticiones de 20 frutos cada una. Cada muestra de 20 frutos se colocó en vasos de precipitación con 1 L de agua destilada estéril, se agitó durante 3 minutos para eliminar el material orgánico adherido a la superficie. Una vez que las moras estuvieron limpias, se extrajo y desechó el agua y se cortó con un cuchillo la parte 35 contaminada de cada fruto. Dicha parte se colocó en erlenmeyers con agua+tween80 estéril y se removió vigorosamente para liberar las esporas. Este proceso se realizó en cada una de las 9 repeticiones. En la cámara de flujo laminar desinfectada se hizo un banco triple de diluciones D 2, D3 y D4 de cada erlenmeyer (desde este momento denominado suspensión madre). Se realizó el siguiente procedimiento para cada dilución: · D2: se tomó 50 uL de la suspensión madre y se colocó en un tubo de ensayo con 5 mL de agua+ tween80 estériles. · D3: se tomó 500 uL de D2 y se colocó en un tubo de ensayo con 4,5 mL de agua+tween80 estériles. · D4: se tomó 500 uL de D3 y se colocó en un tubo de ensayo con 4,5 mL de agua+tween80 estériles. Después de realizar cada dilución se tomó el tubo de ensayo y se agitó durante 10 s en un vortex (Bohemia, USA). Se etiquetó cada una de las placas Petri con medio PDA (Papa Dextrosa Agar) con los datos del fruto, la dilución, el número de réplica y la fecha. Se sembraron por triplicado 0,1 mL de cada una de las suspensiones D2, D3 y D4 en las placas PDA y se incubaron a 25 oC (FDA, 2001). Se empezaron a realizar observaciones de las placas a partir de las 48 horas de la siembra. 2.1.2 PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS PATÓGENOS Para la purificación de las cepas de los hongos se seleccionó de las placas la colonia menos contaminada y se resembró en una nueva placa Petri mediante 3 puntos en el medio de cultivo PDA. Las placas se incubaron a 25 oC y se realizaron observaciones a partir de las 48 horas para detectar contaminantes. Se realizaron 2 réplicas de las siembras de cada tipo de microorganismo. Durante la caracterización morfológica de las cepas de hongos aisladas se observó la forma de crecimiento de la colonia, el tamaño, el aspecto, la textura, la coloración 36 de ambas caras de las placas Petri y la producción de pigmentos (Cañedo y Ames, 2004, p. 102). Para la identificación a nivel de género de los hongos se observaron las esporas y las estructuras fructíferas de cada cepa aislada. Para observar las esporas se colocó agua+tween80 estéril en la placa Petri donde se desarrolló el patógeno hasta obtener una suspensión. De esta suspensión se tomó una gota y se observó en el microscopio óptico (SOGERESA, Spain) con un lente de aumento x 40. Se analizaron las estructuras fructíferas de cada hongo así como la forma y el tamaño de las esporas. Los hongos se compararon e identificaron a nivel de género según las claves micológicas de fuentes bibliográficas (Pitt y Hocking, 2009, p. 53). Los hongos que se utilizaron para realizar estas observaciones tenían al menos 7 días de incubación. 2.2 DETERMINACIÓN DE LA ESPECIE DE HONGO MÁS PATOGÉNICA De toda la colección de patógenos se escogieron tres que, según Ramírez et al. (2013, p. 180) son los principales causantes de graves podredumbres en la poscosecha de mora de Castilla. Para determinar el modo de inoculación artificial más efectivo y obtener un alto nivel de podredumbre se prepararon suspensiones con los microorganismos seleccionados a dos concentraciones diferentes (10 3 y 105 conidias mL-1). 2.2.1 PREPARACIÓN DE INÓCULOS Se colocó agua+tween80 estéril en cada una de las placas Petri que contenían a los patógenos purificados. Se raspó suavemente el micelio hasta obtener una suspensión de esporas. Se colocó esta suspensión en un tubo de ensayo y se agitó en un vortex. Se tomó una gota del tubo de ensayo y se vertió en el centro de una 37 cámara Neubauer (BOECO, Germany). Se acomodó la cámara en el microscopio óptico, se ajustaron los lentes a aumento x 40 y se procedió al conteo de esporas con ayuda de un contador manual (Hand Tally Counter, China) (Ochoa, Hernández, Latisnere, León y Larralde, 2007, p. 354). 2.2.1.1 Determinación de la concentración de los inóculos Se calculó la concentración inicial (conidias mL-1) a la que se encontraba la suspensión de esporas de cada hongo, mediante la Ecuación 2.1. !"#$%$&' () = %*+%,+%-+%. /0 × 4 × 123 [2.1] Donde: 56: número de esporas en los cuadros de la diagonal derecha del campo superior de la cámara 57: número de esporas en los cuadros de la diagonal izquierda del campo superior de la cámara 58: número de esporas en los cuadros de la diagonal derecha del campo inferior de la cámara 59: número de esporas en los cuadros de la diagonal izquierda del campo inferior de la cámara Para obtener las concentraciones deseadas (10 3 y 105 conidias mL-1) se tomó un volumen conocido de la suspensión inicial (calculado con la Ecuación 2.2) con una micropipeta, se colocó en un tubo de ensayo con 5 mL de agua+tween80 estéril y se agitó en el vórtex durante 10 s. ;1 × < = ;>?@1 A <B Donde: [2.2] 38 C6: Concentración inicial calculada mediante el conteo C7: Concentración final deseada (103 y 105 conidias mL-1) D: Volumen en mL de la suspensión de hongo que se va añadir a @1 para llegar a ;> E6: Volumen en mL de agua+tween80 al que se le va a añadir < para poder llegar a ;>F(5 mL) Se realizaron las suspensiones de los hongos más agresivos a las concentraciones deseadas y se procedió a la inoculación artificial. 2.2.2 METODOLOGÍA DE INOCULACIÓN ARTIFICIAL Se sumergieron aproximadamente 2 kg de mora de Castilla en una solución de 50 ppm de hipoclorito de sodio durante 50 s para desinfectar los frutos. Posteriormente, estos se enjuagaron con agua potable y se colocaron sobre una superficie limpia y desinfectada para extraer el exceso de agua. Con la finalidad de determinar el método de inoculación artificial más adecuado para obtener un alto nivel de podredumbre en este tipo de frutas se evaluaron dos métodos de inoculación. Las gavetas plásticas en las que posteriormente se almacenaron las frutas se lavaron, desinfectaron y rotularon (con la información del microorganismo, concentración y método de inoculación artificial aplicado). 2.2.2.1 Inoculación artificial mediante una herida en los frutos Se escogieron moras del mismo calibre, se tomó un alfiler desinfectado y con él se procedió a hacer una herida en el centro de cada fruto. Con una micropipeta se tomaron 15 uL de las suspensiones de esporas de cada microorganismo y se depositaron dentro de la herida de los frutos. Para cada microorganismo y cada 39 concentración se inocularon artificialmente 36 frutos, (216 frutos en total). Se dejó secar la gota inoculada sin mover los frutos. 2.2.2.2 Inoculación artificial mediante inmersión de los frutos en suspensiones con los inóculos Se prepararon los inóculos de los patógenos a las concentraciones deseadas (103 y 105 conidias mL-1) en vasos de precipitación con 200 mL de agua+tween80, según los cálculos de la Ecuación 2.2. Se tomaron grupos de 6 frutos previamente desinfectados, se colocaron en papel filtro y se sumergieron dentro de los vasos con las suspensiones de esporas de los hongos durante 30 s. Transcurrido este tiempo se eliminó el exceso de agua de las moras. Una vez que los frutos estuvieron secos se colocaron en las gavetas plásticas. Para este método de inoculación también se utilizaron 36 frutos para cada hongo y cada concentración (216 frutos en total). 2.2.3 ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE LOS FRUTOS Una vez que los frutos estuvieron inoculados y secos, se taparon las gavetas con fundas plásticas y se colocaron en una cámara de refrigeración a 4 oC y 90% de humedad relativa. Se realizaron observaciones a partir del día 1 posterior a la inoculación. El diseño factorial utilizado en la determinación del género de hongo más agresivo fue 3 × 2, donde las variables fueron tipo de hongo (hongo 1, hongo 2 y hongo 3) y concentración del inóculo (103 y 105 conidias mL-1). En la Figura 2.1, se observa el esquema del procedimiento para la inoculación artificial de mora de Castilla. 40 Mora de Castilla Agua clorada 50 ppm, Ta Desinfección Selección Secado T = 20 oC Inoculación 103 y 105 conidias mL-1 Herida en el fruto Inmersión de los frutos Almacenamiento 4 oC, 90% HR Figura 2.1. Procedimiento para la inoculación artificial de los frutos 2.2.4 DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE INCIDENCIA DE ENFERMEDAD (IIE) Para determinar el IIE se realizaron observaciones de los frutos los 14 días posteriores a la inoculación. Diariamente se le asignó un valor comprendido entre 0 y 3 a cada fruto inoculado, según el nivel de pudrición que presentaba. La Figura 2.2, representa la escala que se utilizó para asignar el IIE a cada fruto. 41 Figura 2.2. Escala de los valores del IIE de los frutos inoculados. Se determinó el índice de incidencia de enfermedad (IIE) de cada microorganismo al final del ensayo mediante la Ecuación 2.3. GGHF?IB = [?&×0B+?J×*B+?K×,B+?%×-B] -# × 122 [2.3] Donde: LM NM OM 5: número de frutos asignados a la categoría de escala de valores 0, 1, 2, 3 P: número total de frutos inoculados 2.2.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados fueron analizados mediante un análisis de varianza ANOVA con un nivel de significación del 95 % y con el procedimiento de las mínimas diferencias significativas de Fisher (LSD). Los cálculos se realizaron en el programa Statgraphics Centurion XV. 42 2.3 ESTUDIO DEL EFECTO DE LAS DIFERENTES CONCENTRACIONES DE QUITOSANO EN LA CALIDAD FÍSICO-QUÍMICA, SENSORIAL Y MICROBIOLÓGICA DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS 2.3.1 INOCULACIÓN ARTIFICIAL DE LOS FRUTOS Se prepararon los inóculos del hongo más agresivo aplicando la Ecuación 2.3. A continuación, se inocularon artificialmente moras de Castilla desinfectadas mediante el método de inoculación más efectivo y con la concentración del agente patógeno más severa. 2.3.2 PREPARACIÓN DE LOS RECUBRIMIENTOS CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE QUITOSANO Para la elaboración de los recubrimientos se utilizó como base quitosano (Aldrich, SLBG5615V, Iceland). Se probó la efectividad de estos recubrimientos en el control de podredumbres durante la poscosecha. El ácido orgánico utilizado como solvente para el quitosano fue ácido ascórbico al 1,0 % (p/p). 2.3.2.1 Recubrimiento al 0,5; 1,0 y 2,0 % de Quitosano Para la preparación de los recubrimientos de quitosano al 0,5; 1,0 y 2,0 % se colocaron 1,5; 3,0 y 6,0 g de quitosano en 300 mL de agua destilada respectivamente. A cada solución se añadió 3,0 g de ácido ascórbico. Posteriormente, se agitaron las soluciones en una plancha de agitación magnética (Stuart Scientific, UK) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se esterilizaron las soluciones en el autoclave a 121 oC durante 20 min. Finalmente, se dejaron enfriar todos los recubrimientos hasta temperatura ambiente y se vertieron en frascos spray. 43 2.3.3 APLICACIÓN DE LOS RECUBRIMIENTOS A LAS MORAS DE CASTILLA Se tomaron los frutos inoculados ya secos y se aplicaron los recubrimientos mediante pulverización individual a 15 cm de distancia aproximadamente. Los frutos recubiertos se dejaron secar y se colocaron en bandejas plásticas. 2.3.4 APLICACIÓN DEL FUNGICIDA DE SÍNTESIS QUÍMICA A LAS MORAS DE CASTILLA Se comparó el modo de acción de los recubrimientos preparados con diferentes concentraciones de quitosano con el de un fungicida de síntesis química. Se preparó una solución de Imazalil al 5,0 % (concentración 5 cm3 L) y se pulverizó sobre los frutos inoculados individualmente. Los frutos se dejaron secar y se colocaron en bandejas plásticas. 2.3.5 ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS Se acomodaron las bandejas dentro de gavetas previamente desinfectadas y rotuladas. Se taparon las gavetas con fundas plásticas y se almacenaron en refrigeración, a 4oC y 90 % de HR hasta 14 días. El diseño factorial que se utilizó en este ensayo fue simple con 4 niveles, donde el factor fue la concentración de quitosano de los recubrimientos que se aplicaron en los frutos (0,0; 0,5; 1,0 y 2,0 %). Se utilizaron 72 réplicas por cada tratamiento (720 frutos en total). El esquema del procedimiento para recubrir los frutos con distintas concentraciones de quitosano se puede observar en el ANEXO I. 44 2.3.6 DETERMINACIÓN DEL IIE DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS Para evaluar la efectividad en el control de podredumbres en la mora de Castilla de las distintas aplicaciones se realizaron observaciones durante los 14 días posteriores a la aplicación de los tratamientos y se calculó nuevamente el IIE siguiendo la metodología explicada en el apartado 2.2.4. 2.3.7 EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS Se evaluaron las propiedades físicas, químicas y sensoriales de la materia prima y de los frutos tratados con los recubrimientos el día 0 (entrada) y los días 7 y 14 (salidas 1 y 2). 2.3.7.1 Propiedades físicas de los frutos Las propiedades físicas evaluadas fueron peso, diámetro y longitud de los frutos. La longitud y el diámetro se midieron con un calibrador metálico. El peso se determinó con una balanza digital (0,01 – 4 100 g) (Boeco BBA51, Alemania). La longitud y el diámetro se reportaron en cm y el peso en g. Los resultados se reportaron como % de variación del parámetro físico evaluado. Para el cálculo se utilizó la ecuación 2.4. IFQ = RST R × 122 Donde: U: parámetro evaluado V: valor del parámetro físico en la entrada W: valor del parámetro físico en la salida [2.4] 45 2.3.7.2 Propiedades químicas de los frutos Las propiedades químicas evaluadas fueron pH, sólidos solubles totales y acidez titulable total. El pH de la pulpa se determinó con un pHmetro electrónico (Fisher Scientific AB150, USA). El contenido de sólidos solubles totales de los frutos con un refractómetro digital (Boeco BOE 32195, Alemania). La acidez titulable mediante lo descrito en la norma AOAC (2007). Los resultados de sólidos solubles totales se reportaron en oBrix y la acidez titulable como porcentaje de acidez del ácido predominante calculado según la Ecuación 2.5. El ácido predominante de la mora de Castilla es el ácido cítrico. X= YZ ×\×^×Y \_ × 122 [2.5] Donde: V: acidez titulable (%) `L : factor del ácido predominante E: volumen de NaOH utilizado (mL) `: factor del NaOH Ea : alícuota de jugo (mL) 2.3.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados fueron evaluados mediante un análisis de varianza ANOVA con un nivel de significación del 95 % y con el procedimiento de las mínimas diferencias significativas de Fisher (LSD). Los cálculos se realizaron en el programa Statgraphics Centurion XV. 46 2.3.9 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA Y SENSORIAL DE FRUTOS RECUBIERTOS CON LA CONCENTRACIÓN DE QUITOSANO MÁS EFECTIVA 2.3.9.1 Aplicación del tratamiento con quitosano en los frutos Se preparó el recubrimiento con la concentración de quitosano más efectiva según el procedimiento descrito en el apartado 2.3.2.1. Este tratamiento se aplicó a frutos desinfectados y sin inocular mediante pulverización individual. Los frutos se almacenaron bajo las condiciones indicadas en el apartado 2.3.5. Se utilizó un diseño factorial simple con 2 niveles, el factor fue concentración de quitosano (0, X %). Los frutos con 0 % de quitosano fueron los frutos control. Se realizaron análisis microbiológicos y sensoriales a los 0, 7 y 14 días de haber aplicado el recubrimiento. Se utilizó 72 réplicas por cada tratamiento (432 frutos en total). El esquema del procedimiento para recubrir los frutos con la mejor concentración de quitosano se puede observar en el ANEXO II. 2.3.10 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS Se efectuaron siembras en placas petrifilm de la muestra control y de la muestra con la concentración de quitosano más efectiva. Se hizo un recuento de aerobios totales mediante el método AOAC 997.12 (Guía 3M, 2001), coliformes totales con el método AOAC 991.14 (Guía 3M, 1999), y mohos y levaduras con el método AOAC 997.02 (Guía 3M, 2004). 2.3.11 CALIDAD SENSORIAL DE LOS FRUTOS Se realizaron dos evaluaciones sensoriales en el transcurso del ensayo. En la primera se realizó una evaluación de la apariencia externa de las moras. Se 47 analizaron atributos de color, olor, textura y apariencia en general de los frutos inoculados artificialmente con la concentración de inóculo del hongo más agresivo seleccionada, y posteriormente aplicados los tratamientos con quitosano y con el fungicida de síntesis química. Esta evaluación se realizó con el fin de comparar la calidad visual de la mora y la efectividad en el control de podredumbres de los tratamientos. A los panelista se les entregaron 5 muestras codificadas con 5 dígitos tomados aleatoriamente. Cada muestra contenía 3 moras de Castilla de cada tratamiento seleccionadas al azar. La segunda evaluación sensorial se realizó una vez que se aplicó el tratamiento más efectivo para controlar la podredumbre de mora de Castilla durante la poscosecha, y se realizaron los respectivos análisis microbiológicos. En esta evaluación sensorial se analizaron atributos de color, firmeza, apariencia en general y aroma de los frutos control y de los frutos recubiertos con quitosano. A cada panelista se le entregaron 2 muestras codificadas con 5 dígitos tomados aleatoriamente. Cada muestra contenía 3 moras de Castilla del tratamiento control y del mejor tratamiento con quitosano seleccionadas al azar. Las dos pruebas sensoriales se realizaron con la ayuda de 12 panelistas semi entrenados con edades comprendidas entre 20 – 27 años. Las evaluaciones de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos fueron descriptivas de calificación con escala estructurada (Ramírez, 2012, p. 88). Estas pruebas se realizaron en la sala de análisis sensorial del DECAB de la EPN, de acuerdo al protocolo especificado en la norma ASTM E 187-10 para la evaluación sensorial de alimentos y bebidas (2010). Todas las muestras fueron preparadas mediante el mismo protocolo y colocadas en recipientes iguales. Se determinó si existía o no diferencia en la aceptabilidad y el grado de esta diferencia entre los frutos tratados con quitosano y los frutos control. Los formatos de los análisis sensoriales se encuentran en los ANEXOS III y IV. 48 2.4 ESTIMACIÓN DEL COSTO DE APLICACIÓN DE QUITOSANO COMO MÉTODO ALTERNATIVO A LOS FUNGICIDAS QUÍMICOS DE SÍNTESIS Para la estimación del costo de aplicación de quitosano como método alternativo a los fungicidas químicos de síntesis se determinaron los costos variables (materia prima, insumos, mano de obra) y los costos fijos (maquinaria y equipos). Se determinó el costo de producción unitario de cada empaque de 250 g de mora de Castilla. El precio de venta al público (PVP) se fijó según el precio de productos similares existentes en el mercado. 49 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 IDENTIFICACIÓN DE LOS DIFERENTES GÉNEROS DE HONGOS AISLADOS DE LA MORA DE CASTILLA (Rubus glaucus) Se realizaron 2 aislamientos y se obtuvieron un total de 8 géneros de hongos diferentes. Para la caracterización macroscópica de las cepas de hongos aisladas se observó la forma de crecimiento de la colonia, el tamaño, el aspecto, la textura, la coloración de ambas caras de las placas Petri y la producción de pigmentos (Cañedo y Ames, 2004, p. 45). Para la caracterización microscópica de los hongos se observaron la forma y el tamaño de las esporas y las estructuras fructíferas de cada cepa aislada. Para la identificación a nivel de género, los aspectos macroscópicos y microscópicos de cada cepa se compararon con las características de hongos descritas por distintos autores como Ramírez et al., (2013, p. 180) y Samson et al., (2000, p. 250). Los diferentes géneros de hongos aislados y purificados con su respectiva codificación se presentan en la Tabla 3.1 Tabla 3.1 Géneros de hongos aislados y purificados con su codificación Género Codificación Penicillium spp HM5 Rhizopus spp HM8 Botrytis spp HM11 Colletotrichum spp HM14 Fusarium spp HM16 Geotrichum spp HM1´ Cladosporium spp HM9´ Mucor spp HM13´ 50 3.1.1 Penicillium spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM5 creció rápidamente. Las colonias eran planas, de aspecto aterciopelado y color marrón claro en los primeros días, posteriormente la producción de esporas fue alta, densa y las colonias adquirieron tonalidades verdes. El diámetro de las colonias alcanzó los 6 cm en 14 días. El hongo produjo un pigmento soluble en el medio de cultivo que cambió ligeramente su coloración a amarillo-verdosa. En el reverso de la placa las colonias presentaban coloraciones pálidas, blancas o ligeramente amarillentas. Estas características se observan en la Figura 3.1. Las descripciones coinciden con Pitt et al., (2009, p. 194) y Trigos et al., (2008, p. 142) para el Penicillium spp. Figura 3.1. Penicillium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa 51 Aspecto microscópico Este género formó conidios en estructuras ramificadas (conidióforos) irregulares con forma de pincel. Las estípites eran cortas y contenían pocas métulas que terminaban en verticilos de 3 – 6 fiálides de forma cilíndrica como se observa en la Figura 3.2. Las esporas eran lisas y tenían forma cilíndrica o esférica. Esta descripción coincide con el aspecto microscópico de Penicillium spp indicado por Samson y Pitt (2000, p. 254) y la UCDAVIS (2014). Figura 3.2. Aspecto microscópico de Penicillium spp (× 40) 3.1.2 Rhizopus spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM8 cubrió toda la superficie de la placa en aproximadamente 5 días. El micelio de las colonias era flocoso y blando. Los esporangios eran visibles de color blanco en los primeros 52 días, y posteriormente negros. La coloración cambiaba desde los bordes de la placa hacia la parte interna. En el reverso de las placas las colonias no presentaban ninguna coloración. Estas características se pueden observar en la Figura 3.3. La descripción coincide con lo indicado por Pitt y Hocking (2009, p. 158) y la UNAD (2013) para el crecimiento de Rhizopus spp en medio de cultivo PDA. Figura 3.3. Rhizopus spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Se distinguió por la formación de rizoides en la base de los esporangioforos. Se encontraban grupos de 3 – 5 esporangios que nacían a partir de los estolones. Los esporangios tenían columela y eran de forma esférica. Las estípites eran robustas y no ramificadas. Las esporangiosporas eran lisas, de forma esférica y de color negro como se puede observar en la Figura 3.4. 53 Los autores Pitt y Hocking (2009, p. 158) y Ramirez et al., (2007, p. 416) coinciden con esta descripción en el aspecto microscópico de Rhizopus spp. Figura 3.4. Aspecto microscópico de un esporangio de Rhizopus spp (× 40) 3.1.3 Botrytis spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM11 cubrió la placa entera en 5 días. Las colonias eran irregulares y algodonosas. Inicialmente el micelio tenía una coloración blanquecina que con el paso de los días se tornó marrón. En el reverso de las placas las colonias presentaban una coloración ligeramente gris. Estas características se pueden observar en la Figura 3.5. La misma descripción la realizaron los autores Aszú (2015) y Dominguez et al., (2009, p. 80) en el desarrollo de Botrytis spp en medio de cultivo PDA. 54 Figura 3.5. Botrytis spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Los conidióforos presentaron ramificaciones alternas y rectas y nacieron de hifas septadas aéreas. Las estípites tenían longitud variada y terminaban en racimos cortos con ápices esféricos. Los conidios nacieron de los ápices y eran lisos, de forma esférica o elipsoidal como se observa en la Figura 3.6. Esta descripción coincide con los autores Elad et al., (2005, p. 6) y Pitt y Hocking (2009, p. 68) en el aspecto microscópico de Botrytis spp. 55 Figura 3.6. Aspecto microscópico de un conidióforo de Botrytis spp (× 40) 3.1.4 Colletotrichum spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC las colonias de la cepa HM14 formaron agrupaciones algodonosas de color blanquecino inicialmente que con el paso de los días se tornaron verdes. En el reverso de las placas las colonias eran de color verde oscuro y blanco en los bordes. Estas características se pueden observar en la Figura 3.7. La descripción coincide con los autores Pitt y Hocking (2009, p. 81) en el desarrollo de Colletotrichum spp en medio de cultivo PDA. 56 Figura 3.7. Colletotrichum spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Los acérvulos de este hongo eran cerosos, tenían forma de disco y presentaban setas en los bordes. Dentro de estas estructuras reproductivas se encontraban las conidias hialinas que eran planas y fusiformes. Algunas esporas tenían forma cilíndrica con los extremos redondeados como se puede observar en la Figura 3.8. Esta descripción coincide con lo indicado por Aszú (2015) Pitt y Hocking (2009, p. 81) y en el aspecto microscópico de Colletotrichum spp. 57 Figura 3.8. Aspecto microscópico de las conidias de Colletotrichum spp (× 40) 3.1.5 Fusarium spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM16 cubrió la placa entera en 6 días. El micelio aéreo de las colonias era abundante, algodonoso y de color blanquecino o ligeramente rosa. En el reverso de las placas las colonias presentaban una coloración púrpura. Estas características se pueden observar en la Figura 3.9. La descripción coincide con los autores Pitt y Hocking (2009, p. 89) y Prats (2007, p. 286) en el desarrollo de Fusarium spp en medio de cultivo PDA. 58 Figura 3.9. Fusarium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Los micelios de este hongo eran hialinos y septados. Tenía conidióforos que algunas veces estaban ramificados y agrupados. Fusarium spp presentó dos tipos de conidias, las macroconidias estaban aisladas en grupos y eran hialinas, fusiformes y presentaban múltiples septos. Las microconidias se encontraban en cadena o en racimos y tenían forma cilíndrica como se observa en la Figura 3.10. La misma descripción hicieron los autores Tapia et al. (2014, p. 86) en el aspecto microscópico de Fusarium spp. 59 Figura 3.10. Aspecto microscópico de macroconidias y microconidias de Fusarium spp (× 40) 3.1.6 Geotrichum spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM1´ creció rápidamente. El micelio aéreo era escaso y las colonias eran planas y de color blanco. En el reverso de las placas las colonias eran de color crema. Estas características se pueden apreciar en la Figura 3.11. Las descripciones coinciden los autores Pitt y Hocking (2009, p. 122) en el desarrollo de Geotrichum spp en medio de cultivo PDA. 60 Figura 3.11. Geotrichum spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Este hongo presentaba hifas que se ramificaban. Los conidióforos en la madurez se fragmentaban lateralmente para formar artroconidias en forma cilíndrica que salían perpendicularmente de la hifa principal como se aprecia en la Figura 3.12. La descripción coincide con Pitt y Hocking (2009, p. 122) en el aspecto microscópico de Geotrichum spp. 61 Figura 3.12. Aspecto microscópico de hifas de Geotrichum spp (× 40) 3.1.7 Cladosporium spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM9´ tuvo crecimiento lento. Las colonias alcanzaron un tamaño de 1,50 – 3,00 cm de diámetro en 7 días, eran de color verde oliva y de aspecto aterciopelado. En el reverso de las placas las colonias tenían una coloración verde oscura y negruzca. Estas características se pueden observar en la Figura 3.13. Las descripciones coinciden con Samson (2000, p. 300) en el desarrollo de Cladosporium spp en medio de cultivo PDA. 62 Figura 3.13. Cladosporium spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Este hongo presentaba conidióforos que poseían de 1 a 3 septos transversales, poco ramificados y de superficie lisa. Las conidias eran fusiformes o de forma esférica y aparecían solitarias o formando cadenas como se aprecian en la Figura 3.14. Las mismas características se encontraron en lo descrito por Pitt y Hocking (2009, p. 75) en el aspecto microscópico de Cladosporium spp. 63 Figura 3.14. Aspecto microscópico de hifas y conidias de Cladosporium spp (x 40) 3.1.8 Mucor spp Aspecto macroscópico En medio PDA y a una temperatura de incubación de 25 oC la cepa HM13´ creció rápidamente, en 5 días abarcó la totalidad de la placa. El micelio aéreo era abundante, de aspecto algodonoso, de color blanco y de 15 - 22 mm de longitud. En el reverso de las placas las colonias presentaban una coloración ligeramente amarillenta. Estas características se pueden observar en la Figura 3.15. Las descripciones coinciden con Prats (2007, p. 242) en el desarrollo de Mucor spp en medio de cultivo PDA. 64 Figura 3.15. Mucor spp aislado de mora de Castilla y sembrado en medio de cultivo PDA anverso (izquierda) y reverso (derecha) de la placa Aspecto microscópico Este hongo presentaba esporangios ramificados de tamaño variable y sin apófisis. Tenía columelas hialinas bien desarrolladas de forma elipsoidal y eran truncadas en la base. Las esporas eran lisas y tenían forma elipsoidal o esférica como se puede observar en la Figura 2.16. Microscópicamente se diferencia de Rhizopus spp en que este género no posee estolones. Estas características coinciden con lo que indicaron Pitt y Hocking (2009, p. 151) en el aspecto microscópico de Mucor spp. 65 Figura 3.16. Aspecto microscópico de esporangio y esporas de Mucor spp (× 40) 3.2 DETERMINACIÓN DEL GÉNERO DE HONGO MÁS AGRESIVO Los 3 géneros de hongos más patogénicos en mora de Castilla según fuentes bibliográficas y pruebas preliminares (resultados no mostrados) fueron Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp HM14 (Ramírez et al., 2013, p. 180). Se prepararon suspensiones de estos tres hongos a diferentes concentraciones (103 y 105 conidias mL-1) para la inoculación artificial en estos frutos. La determinación del mejor método de inoculación artificial se efectuó mediante la prueba de dos metodologías. El primer método consistió en realizar una herida en el centro de los frutos y una posterior inoculación de un volumen conocido de la suspensión de esporas de los hongos patógenos. El segundo método se realizó mediante la inmersión de los frutos en las suspensiones de esporas. El diseño factorial de cada metodología de inoculación fue 3 × 2, donde los factores fueron tipo de hongo (Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp 66 HM14) y concentración del inóculo (103 y 105 conidias mL-1). Se inocularon artificialmente 432 frutos, 216 mediante el primer método y 216 mediante el segundo. Los dos métodos de inoculación aplicados fueron efectivos y causaron distintos grados de pudrición en las moras. En ambas técnicas de inoculación las características de las podredumbres provocadas por los mismos hongos fueron iguales. Botrytis spp HM11 descompuso los frutos y los cubrió de un moho de color pardo como se puede observar en la Figura 3.17. Las lesiones inicialmente se presentaron en lugares puntuales de la fruta y posteriormente provocaron una pudrición generalizada. Estos síntomas concuerdan con lo indicado por Dominguez et al., (2009, p. 82) en la enfermedad conocida como moho gris. Figura 3.17. Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Botrytis spp HM11 Los frutos infectados con Rhizopus spp HM8 perdieron humedad, se arrugaron, momificaron y cubrieron con un moho de color blanquecino como se puede observar en la Figura 3.18. Esta podredumbre blanda coincide con lo descrito por UNAD (2013). 67 Figura 3.18. Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Rhizopus spp HM8 Colletotrichum spp HM14 ocasionó la enfermedad conocida como Antracnosis en las moras, los frutos presentaron necrosis, pudriciones húmedas, deshidratación y se cubrieron de un moho gris oscuro como se observa en la Figura 3.19. Esta pudrición coincide con lo indicado por Gavira et al. (2013, p. 70). Figura 3.19. Podredumbre de mora de Castilla ocasionada por Colletotrichum spp HM14 68 El género de hongo más agresivo para cada método de inoculación se determinó por medio del cálculo del índice de incidencia de enfermedad (IIE) durante los 14 días posteriores a la inoculación. 3.2.1 IIE DE LOS FRUTOS INOCULADOS ARTIFICIALMENTE MEDIANTE UNA HERIDA EN EL CENTRO En los frutos inoculados artificialmente por medio de una herida en el centro se observó que el IIE ocasionado por todos los microorganismos evaluados incrementó de forma exponencial durante el transcurso del tiempo de estudio, tanto en los frutos inoculados a 103 conidias mL-1 como en aquellos inoculados a 105 conidias mL-1 como se puede observar en la Figura 3.20. Después de 14 días de conservación a 4 oC y 90 % de HR, las moras inoculadas con 103 conidias mL-1 presentaron valores significativamente diferentes del IIE (p < 0,05) al evaluar el factor tipo de hongos patógenos. Botrytis spp HM11 causó un IIE del 79,17 %, Colletotrichum spp HM14 un IIE del 75,46 % y Rhizopus spp HM8 un IIE del 62,50 % como se puede observar en la Figura 3.20A. Los valores del IIE para los frutos inoculados con 105 conidias mL-1 también fueron significativamente diferentes (p < 0,05), siendo del 81,94 % en Botrytis spp HM11, 77,31 % en Colletotrichum spp HM14 y 71,76 % en Rhizopus spp HM8 como se puede observar en la Figura 3.20B. En cambio, en la evaluación del factor concentración de los inóculos no se obtuvieron diferencias significativas entre las concentraciones 10 3 y 105 conidias mL-1 (p > 0,05) entre los diferentes hongos evaluados. 69 90 A 75 LSD: 0,0456 IIE (%) 60 45 30 15 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Días de almacenamiento Botrytis Rhizopus Colletotrichum 90 B 75 LSD: 0,0791 IIE (%) 60 45 30 15 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Días de almacenamiento Botrytis Rhizopus Colletotrichum Figura 3.20. IIE (%) de Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp HM14 inoculados artificialmente en mora de Castilla mediante una herida en el centro de los frutos con 103 conidias mL-1 (A) y 105 conidias mL-1 (B). Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD 70 3.2.2 IIE DE LOS FRUTOS INOCULADOS ARTIFICIALMENTE MEDIANTE INMERSIÓN EN LAS SUSPENSIONES DE ESPORAS En el caso de los frutos inoculados por inmersión en las suspensiones de esporas de cada cepa de hongo patógeno de estudio, el crecimiento microbiano fue similar al que se presentó en los frutos inoculados mediante una herida. El IIE de los hongos incrementó exponencialmente según aumentaba el tiempo de almacenamiento en refrigeración a 4 oC y 90 % de HR tanto en los frutos inoculados a 103 conidias mL-1 como en aquellos inoculados a 105 conidias mL-1 como se puede observar en la Figura 3.21. Después de 14 días de conservación a 4 oC y 90 % de HR, las moras inoculadas con 103 conidias mL-1 presentaron valores significativamente diferentes del IIE (p < 0,05) al evaluar el factor tipo de hongos. Botrytis spp HM11 causó un IIE del 81,94 %, Colletotrichum spp HM14 un IIE del 77,31 % y Rhizopus spp HM8 un IIE del 71,76 % como se puede observar en la Figura 3.21C. Los valores del IIE para los frutos inoculados con 105 conidias mL-1 también fueron significativamente diferentes (p < 0,05), siendo del 88,43 % en Botrytis spp HM11, 79,17 % en Colletotrichum spp HM14 y 75,46 % en Rhizopus spp HM8 como se puede observar en la Figura 3.21D. En esta metodología de inoculación los resultados presentaron una diferencia estadísticamente significativa tanto en el factos concentración de microorganismos inoculados en los frutos como en el factor tipo de hongos (p < 0,05). Botrytis spp ocasionó un IIE estadísticamente mayor a Rhizopus spp y Colletotrichum spp en los frutos inoculados con 103 y 105 conidias mL-1. Además, los frutos sumergidos en las suspensiones de esporas con una concentración de 105 conidias mL-1 tuvieron un IIE significativamente mayor a los frutos sumergidos en las suspensiones de esporas con 103 conidias mL-1. 71 90 C 75 LSD: 0,0496 IIE (%) 60 45 30 15 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Días de almacenamiento Botrytis Rhizopus Colletotrichum 90 D 75 LSD: 0,0859 IIE (%) 60 45 30 15 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Días de almacenamiento Botrytis Rhizopus Colletotrichum Figura 3.21. IIE (%) de Botrytis spp HM11, Rhizopus spp HM8 y Colletotrichum spp HM14 inoculados artificialmente en mora de Castilla mediante la inmersión de los frutos en suspensiones con 103 conidias mL-1 (C) y 105 conidias mL-1 (D). Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD 72 En los dos métodos de inoculación artificial estudiados en la mora de Castilla el IIE provocado por Botrytis spp HM11 fue significativamente mayor al que el ocasionaron Colletotrichum spp HM14 y Rhizopus spp HM8 durante el almacenamiento. Siendo Botrytis spp HM11 el hongo responsable de la podredumbre más severa de la mora de Castilla durante el período poscosecha. Generalmente en la inoculación artificial se utilizan suspensiones de esporas de hongos patógenos con concentraciones entre 10 3 y 106 conidias mL-1 para la inoculación artificial de frutos pequeños como la mora de Castilla o la frutilla (Chaves y Wang, 2004, p. 75; López, Castaño, Marulanda y López, 2013, p. 150). Los resultados del ensayo indicaron que los frutos inoculados con una concentración de 105 conidias mL-1 presentaron un IIE estadísticamente mayor a los frutos inoculados con una concentración de 10 3 conidias mL-1. Esta concentración es la que provocó un óptimo desarrollo del microorganismo patógeno en los frutos y consecuentemente un alto grado de pudrición. La metodología de inoculación artificial que más se utiliza en frutas es mediante una herida con un punzón en un lugar puntual de los frutos y el posterior depósito del inóculo en su interior (Farrera, Zambrano y Ortiz, 2007, p. 274). Sin embargo, los resultados del ensayo demostraron que no existió una diferencia significativa entre los dos métodos de inoculación probados, el recomendado en bibliografía y la inmersión de los frutos en la suspensión de esporas de los hongos. Durante la primera metodología (herida en el centro de los frutos) se tuvo complicaciones en la inoculación debido al reducido tamaño de los frutos, su delicada textura y su color oscuro. La fruta se maltrataba y no era posible visualizar fácilmente la herida. Por estas razones, y al no existir una diferencia significativa entre las dos pruebas de inoculación, se escogió la segunda metodología (inmersión de los frutos en las suspensiones de patógenos) como el método de inoculación más apropiado, rápido y sencillo. Los hongos del género Botrytis son los responsables de las pérdidas más graves 73 en la producción de mora de Castilla y otros frutos pequeños como frutillas. La enfermedad de moho gris que provoca este patógeno es la más limitante y frecuente debido a que ataca a cualquier parte del cultivo (principalmente flores y frutos de la mora) y en cualquier estado fenológico (Molina, La Rotta y Torres, 2004, p. 106). Las conidias de Botrytis spp pueden contaminar a los frutos en cualquier fase del cultivo y permanecer en estado de latencia hasta que se presenten las mejores condiciones para su desarrollo y proliferación, generalmente durante la poscosecha. La temperatura óptima para el desarrollo de Botrytis spp es de 17 – 21 oC, pero puede vivir en temperaturas de refrigeración (4oC) por lo que es común encontrarlo durante el período poscosecha, es decir en el almacenamiento y la comercialización de los frutos (Elad et al., 2007, p. 7). La mora de Castilla es más susceptible a Botrytis spp que a Colletotrichum spp y Rhizopus spp ya que estos dos patógenos no se desarrollan adecuadamente a bajas temperaturas. El estudio realizado por López et al. (2013, p. 150) manifiesta resultados similares a los obtenidos en este estudio. 3.3 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE QUITOSANO EN LA CALIDAD DE MORA DE CASTILLA INOCULADA ARTIFICIALMENTE CON Botrytis spp Para la evaluación de diferentes concentraciones de quitosano en el control de podredumbre de mora de Castilla se desinfectaron 5 kg de frutos y se inocularon artificialmente con Botrytis spp HM11 con una concentración de 105 conidias mL-1 mediante inmersión de los frutos en la suspensión de esporas. Se prepararon soluciones de quitosano a 3 concentraciones diferentes: 0,5, 1,0 y 2,0 % y una solución con Imazalil (concentración 5 cm3 L-1) y se pulverizaron sobre los frutos inoculados para probar su efectividad. 74 Los frutos fueron almacanedos en refrigeración a 4 oC y 90 % de humedad relativa hasta 14 días. El diseño factorial que se utilizó en el ensayo fue simple con 4 niveles, donde el factor fue la concentración de quitosano de las soluciones (0,0; 0,5; 1,0 y 2,0 %). Se utilizaron 72 réplicas por tratamiento. 3.3.1 IIE DE LOS FRUTOS El IIE de cada fruto se calculó durante los 14 días posteriores a la inoculación de los frutos y aplicación de los recubrimientos. La Figura 3.22, representa la tendencia del IIE de los frutos inoculados con 105 conidias mL-1 de Botrytis spp y recubiertos con las diferentes soluciones. Después de 14 días de almacenamiento, los valores del IIE fueron 72,68 % para los frutos control, 57,86 % para los frutos recubiertos con la solución al 0,5 % de quitosano, 56,48 % para los frutos recubiertos con la solución al 1,0 % de quitosano, 50,92 % para los frutos recubiertos con la solución al 2,0 % de quitosano y 60,65 % para los frutos recubiertos con la solución de Imazalil (concentración de 5 cm3 L-1). Tal y como muestran los resultados obtenidos, la solución al 2,0 % de quitosano presentó un valor estadísticamente menor a las demás soluciones aplicadas a los frutos (p < 0,05), incluso a los frutos recubiertos con el fungicida de síntesis química Imazalil al 0,5 %. Por lo tanto, se concluyó que esta fue la concentración más efectiva para controlar la podredumbre en mora de Castilla provocada por Botrytis spp durante el almacenamiento en refrigeración. No se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa en el valor del IIE entre el fungicida de síntesis química y los recubrimientos al 0,5 y 1,0 % de quitosano, por lo que, su efecto en el período poscosecha no es suficientemente efectivo para el control de podredumbres ocasionadas por Botrytis spp HM11 como se puede apreciar en la Figura 3.22. 75 90 75 LSD: 0,0784 IIE (%) 60 45 30 15 0 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Días de almacenamiento C Q 0,5 % Q1% Q2% I Figura 3.22. IIE (%) de frutos inoculados con Botrytis spp HM11 (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC. Cada punto representa la media de 36 frutos analizados con el test LSD La Figura 3.23, representa el gráfico de medias de los distintos tratamientos aplicados a los frutos inoculados con Botrytis spp HM11. Se puede comprobar que efectivamente el valor del IIE que se obtuvo con los frutos recubiertos con la solución al 2,0 % de quitosano fue estadísticamente menor a todos los demás tratamientos aplicados a los frutos. Al igual que Bautista et al. (2005, p. 123) en este estudio se comprobó que la inhibición en el desarrollo de Botrytis spp estuvo ligada a la dosis de quitosano utilizada en los recubrimientos. A mayor concentración utilizada en el recubrimiento mayor inhibición del hongo se tuvo en las frutas. 76 Medias y 95,0% de Fisher LSD 0,8 IIE 0,6 0,4 0,2 0 C I Q 0,5 % Tratamiento Q1% Q2% Figura 3.23. Gráfico de medias con el método de la diferencia significativa mínima de Fisher (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) La actividad del quitosano es más efectiva sobre las conidias que sobre las hifas de algunos hongos patógenos (Palma, Jansson, Salinas y Lopez, 2008, p. 548), es por eso que el polisacárido retardó el desarrollo de las esporas de Botrytis spp inoculadas en los frutos. Además, la actividad fungicida de este biopolímero está asociada al carácter catiónico de la molécula. La interacción electrostática de los grupos amino libres (carga positiva) con los residuos de las paredes celulares de los hongos (carga negativa) cambia la permeabilidad de la membrana plasmática e impide el flujo normal de nutrientes y desechos, lo que ocasionó la muerte de los hongos (Chung y Chen, 2008, p. 2812). Otra de las razones por las que el recubrimiento inhibió el desarrollo de Botrytis spp en los frutos, se relaciona con el impedimento de la síntesis de algunas enzimas presentes en el hongo y las alteraciones citológicas que provoca (Lárez, 2008, p. 17). Los autores Barka, Eullaffroy, Climent y Vernet (2004) reportaron estas alteraciones en células de Botrytis cinerea carentes de citoplasma después de 77 haber tratado uvas con soluciones acuosas al 1,75 % de quitosano (p. 610). Existen múltiples investigaciones que prueban la efectividad biocida del quitosano en hongos patógenos. Los estudios realizados por López et al, (2012) demostraron que el quitosano aplicado a una concentración de 50 ppm controla la enfermedad conocida como moho gris ocasionada por Botrytis spp en pepino (p. 38). Los autores Bautista et al. (2005) encontraron que los tratamientos con quitosano al 2 y 3 % de concentración tienen efectos fungicidas en Colletotrichum gloeosporioides (p. 128). En la investigación realizada por Kurzawińska (2007) se demostró que el tratamiento con quitosano favorece la germinación y crecimiento de semillas de lechuga en medios infectados con Pythium debaryanum (p. 174). Estos trabajos respaldan los resultados favorables del efecto de la solución de quitosano al 2 % en la reducción significativa del IIE causada por Botrytis spp en mora de Castilla obtenidos en este estudio. 3.3.2 EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS Y SENSORIALES DE LA MATERIA PRIMA (DÍA 0) Los parámetros físico-químicos determinados en este estudio fueron peso, diámetro, longitud, pH, sólidos solubles totales (SST) y acidez de los frutos. El análisis sensorial se realizó mediante una prueba descriptiva de calificación, con una escala hedónica de 5 puntos a 12 panelistas semi entrenados. 3.3.2.1 Análisis físico-químicos El resumen de los parámetros físico-químicos evaluados a 36 moras a la llegada al laboratorio del DECAB se presenta en la Tabla 3.2. Los frutos presentaron un índice de madurez 4 según la escala de madurez de la mora de Castilla de la Norma técnica ecuatoriana INEN 2427 (2010). 78 El peso promedio de los frutos fue de 3,92 g. El diámetro y la longitud promedios de los frutos fueron de 1,78 cm y 2,08 cm respectivamente. Estas características indicaron que las moras tenían un calibre mediano (INEN, 2010). El pH promedio de los frutos fue de 2,77, los SST y la acidez titulable promedios fueron de 7,81 y 2,10 respectivamente. Estos valores están dentro del rango mínimo permitido para la madurez comercial de la mora de Castilla y son bastante similares a los valores que encontraron Ayala et al. (2013) en mora de Castilla con índice de madurez 4 (p. 15). Tabla 3.2. Características físico-químicas de la mora de Castilla (t = 0 días) Parámetro Físico Químicos Valor promedio Peso (g) 3,92 ± 0,06 Diámetro (cm) 1,88 ± 0,02 Longitud (cm) 2,28 ± 0,03 pH 2,77 ± 0,00 SST 7,81 ± 0,68 Acidez (%) 2,10 ± 0,02 bc ± dF?e = fgB 3.3.2.2 Análisis sensorial Según los atributos evaluados se obtuvieron valores de 4,08 ± 0,11 en olor, 3,58 ± 0,25 en color, 3,83 ± 0,25 en textura y 3,50 ± 0,12 en apariencia general, además no se presentaron olores extraños. Los frutos se encontraron en óptimas condiciones para la aplicación de los distintos tratamientos. Los atributos físicos, químicos y sensoriales que presentó la mora de Castilla fueron aceptables para su consumo, procesamiento y comercialización. 79 3.3.3 EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS Y SENSORIALES DE LOS FRUTOS TRATADOS DURANTE EL ALMACENAMIENTO La evaluación de los parámetros físicos, químicos y sensoriales de los frutos inoculados por inmersión con 105 conidias mL-1 de Botrytis spp y pulverizados con los distintos tratamientos se realizaron a salida 1 (día 7) y salida 2 (día 14) del almacenamiento. Se evaluaron los parámetros de calidad de los frutos control (frutos inoculados con Botrytis spp pero sin la aplicación de ningún tratamiento), frutos recubiertos con soluciones de quitosano al 0,5; 1 y 2 % y de los frutos recubiertos con Imazalil (concentración 5 cm3 L-1). 3.3.3.1 Análisis físicos Los análisis físicos que se estudiaron en las moras de Castilla inoculadas con 105 conidias mL-1 de Botrytis spp HM11 y aplicadas los distintos tratamientos para el control de podredumbre fueron peso, diámetro y longitud. En cada parámetro de calidad se aplicó un diseño factorial 3 × 5, donde los factores fueron tiempo de almacenamiento (días 0, 7 y 14) y tratamientos aplicados (C, Q 0,5 %, Q 1 %, Q 2 %, I). Los resultados de los análisis físicos se presentan en la Tabla 3.3. 80 Tabla 3.3. Parámetros físicos evaluados en la mora de Castilla en las salidas 1 (día 7) y 2 (día 14) almacenadas a 4 oC y 95 % de HR. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD Tratamientos Salida 1 (7 días) Salida 2 (14 días) Parámetro C Q 0,5 % Q1% Q2% I Peso (g) 3,45 ± 0,86a 3,63 ± 0,91ab 3,67 ± 0,86ab 3,88 ± 0,86b 3,05 ± 0,86a Diámetro (cm) 1,46 ± 0,21a 1,58 ± 0,29ab 1,62 ± 0,21ab 1,72 ± 0,27b 1,53 ± 0,17ab Longitud (cm) 1,85 ± 0,34a 1,95 ± 0,29b 1,98 ± 0,19b 2,02 ± 0,24b 2,00 ± 0,23b Peso (g) 2,94 ± 0,84a 3,02 ± 0,81a 3,05 ± 0,85a 3,66 ± 0,92b 2,92 ± 0,85a Diámetro (cm) 1,43 ± 0,21a 1,52 ± 0,21ab 1,56 ± 0,20ab 1,67 ± 0,19b 1,50 ± 0,14ab Longitud (cm) 1,72 ± 0,36a 1,88 ± 0,28b 1,92 ± 0,26b 1,96 ± 0,33b 1,87 ± 0,23b bc ± dF?e = fgB C: Control (Sin tratamiento) Q 0,5 %: Quitosano al 0,5 % Q 1 %: Quitosano al 1 % Q 2 %: Quitosano al 2 % I: Imazalil (5 cm3 L-1) 3.3.3.1.1 Peso Según los resultados obtenidos, el peso de los frutos tiene una diferencia significativa entre los diferentes factores, tratamientos aplicados y en tiempo de almacenamiento (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.3. En comparación con el peso de los frutos en la entrada de la materia prima (día 0), durante la primera salida (día 7), se tuvo una pérdida de peso del 13,31 % para los frutos control, del 8,79 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 7,78 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 2,51 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 23,36 % para los frutos recubiertos con Imazalil. En la segunda salida (día 14), se tuvo una pérdida de peso del 25 % para los frutos control, del 22,96 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 22,19 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 6,63 % para los 81 frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 26,00 % para los frutos recubiertos con Imazalil como se puede observar en la Figura 3.24. En las dos salidas la menor pérdida de peso en los frutos se obtuvo con el tratamiento de Q 2 %, seguido de Q 1 %, Q 0,5 %, control y finalmente Imazalil. Pese a que todas las concentraciones de quitosano probadas fueron efectivas, no hubo diferencia significativa en la disminución de la pérdida de peso hasta el día 7 de almacenamiento entre los tratamientos (p < 0,05). Sin embargo, el día 14 los frutos que menor pérdida de peso significativa presentaron fueron los tratados con quitosano al 2,0 %. Durante todo el tiempo de almacenamiento, los frutos recubiertos con Imazalil presentaron la mayor pérdida de peso, este fungicida al ser un compuesto hidrofílico, posiblemente se unió a las moléculas de agua de los frutos, no formó ninguna barrera y permitió fácilmente la respiración, transpiración y pérdida de humedad de la mora. La humedad relativa a la que se almacenaron los frutos fue de 90 % y el contenido de humedad de la mora es alrededor del 95 %, probablemente este gradiente provocó un déficit en la presión de vapor de agua en el interior de los frutos, lo que ocasionó migración del vapor de agua desde el interior hacia el exterior de las moras y se tradujo en pérdida de peso. 82 30% Pérdida de peso (%) 25% 20% C Q 0,5 % 15% Q1% Q2% I 10% 5% 0% 7 14 Días de almacenamiento Figura 3.24. Pérdida de peso de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC y evaluados con el test LSD Normalmente, los frutos durante el período de almacenamiento en frío se deshidratan y pierden peso debido a los procesos de transpiración y respiración. Los recubrimientos en base de quitosano modifican la atmósfera interna de los frutos y reducen significativamente las pérdidas de peso por deshidratación (Bautista et al., 2005, p. 1). Estos recubrimientos se han aplicado en una gran variedad de frutas como papaya, mango, pera, mandarina, fresa, frambuesa y carambola, y, efectivamente en todos los estudios se han observado resultados positivos en la disminución de la pérdida de peso, conservación de firmeza y aumento de vida útil (Velázquez y Guerrero, 2014, p. 8). 83 El quitosano al formar una barrera semipermeable al O 2, CO2 y H2O en los frutos, disminuyó lentamente la respiración y retrasó la transpiración y pérdida de humedad de los frutos manteniendo la textura inicial (Lárez, 2008, p. 20). Los frutos que presentaron menor pérdida de peso durante las salidas 1 y 2 fueron los del tratamiento Q 2 %. Estos resultados coinciden con Tezotto, Fargoni, Geerdink y Kluge (2014), que aplicaron recubrimientos de quitosano con diferentes concentraciones en frambuesas y obtuvieron menores pérdidas de peso con quitosano al 2 % (p/p) (p. 74). Debido a que este parámetro es determinante en la calidad de los frutos es muy importante seleccionar el tratamiento que menor pérdida de peso presente durante el almacenamiento. Así, se mantendrá la apariencia y frescura requerida en el producto y se evitará el estrés hídrico que induce a cambios hormonales perjudiciales para la vida útil de la mora. 3.3.3.1.2 Diámetro En la evaluación del factor tratamiento, durante las dos salidas el diámetro de los frutos control fue significativamente menor al diámetro de los frutos recubiertos con quitosano al 2 % (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.3. Entre los demás tratamientos a pesar de que hay una disminución en el diámetro con el paso de los días, esta no es significativa. En el factor tiempo de almacenamiento no se tuvo una diferencia significativa entre el diámetro de los frutos los días 0 y 7 (p > 0,05). Sin embargo, el día 14 los frutos presentaron un diámetro significativamente menor al de los días 0 y 7 (p < 0,05). En comparación con el diámetro de los frutos en la entrada (t = 0 días), durante la primera salida (día 7), se tuvo una pérdida de este parámetro del 22,34 % para los frutos control, del 15,96 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 13,83 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 8,51 % para los 84 frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 18,62 % para los frutos recubiertos con Imazalil. En la segunda salida (día 14), se presentaron pérdidas en el diámetro de 23,94 % para los frutos control, del 19,15 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 17,02 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 11,17 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 20,21 % para los frutos recubiertos con Imazalil como se puede apreciar en la Figura 3.25. La disminución del diámetro de los frutos se debe a la pérdida de peso por deshidratación durante el almacenamiento. En esta etapa los frutos pierden firmeza, se marchitan y arrugan y por lo tanto se encogen (Ávila, Cuspoca, Fischer, Ligarreto y Quicazán, 2007, p. 4182). 30% Pérdida de diámtro (%) 25% 20% C Q 0,5 % 15% Q1% Q2% 10% I 5% 0% 7 14 Días de almacenamiento Figura 3.25. Pérdida de diámetro de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC y evaluados con el test LSD 85 3.3.3.1.3 Longitud En la evaluación del factor tratamiento, durante las dos salidas (días 7 y 14) de cámara la longitud de los frutos control fue significativamente menor a la longitud de los frutos recubiertos con todos los demás tratamientos (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.3. En el factor tiempo de almacenamiento no se tuvo una diferencia significativa entre el diámetro de los frutos los días 7 y 14 (p > 0,05), sin embargo, el día 0 los frutos presentaron un diámetro significativamente mayor al de los días 7 y 14 (p < 0,05). En comparación con la longitud de los frutos en la entrada (t = 0 días), durante la primera salida (día 7), se tuvo una pérdida de este parámetro del 18,86 % para los frutos control, del 14,47 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 13,16 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 11,40 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 12,28 % para los frutos recubiertos con Imazalil. En la segunda salida (día 14), se presentaron pérdidas en el diámetro de 46,49 % para los frutos control, del 17,54 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 15,79 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 14,03 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 17,98 % para los frutos recubiertos con Imazalil como se puede apreciar en la Figura 3.26. Al igual que la disminución del diámetro, la reducción en la longitud de los frutos está ligada con la pérdida de peso por deshidratación durante el almacenamiento. Los frutos se marchitaron y arrugaron disminuyendo considerablemente la longitud, el diámetro o ambos parámetros. 86 30% Pérdida de longitud (%) 25% 20% C Q 0,5 % 15% Q1% Q2% I 10% 5% 0% 7 14 Días de almacenamiento Figura 3.26. Pérdida de longitud de los frutos recubiertos con los distintos tratamientos. (C: control, Q 0,5 % quitosano, Q 1 % quitosano, Q 2 % quitosano, I Imazalil) almacenados hasta 14 días a 4 oC y evaluados con el test LSD 3.3.3.2 Análisis químicos Los análisis químicos que se realizaron a las moras de Castilla inoculadas con Botrytis spp HM11 (105 conidias mL-1) y aplicadas los distintos tratamientos para el control de podredumbre fueron pH, sólidos solubles totales (SST) y acidez titulable. En cada parámetro químico de calidad se aplicó un diseño factorial 3 x 5, donde los factores fueron tiempo de almacenamiento (días 0, 7 y 14) y tratamientos aplicados (C, Q 0,5 %, Q 1 %, Q 2 %, I). Los resultados de los análisis químicos se presentan en la Tabla 3.4. 87 Tabla 3.4 Parámetros químicos evaluados en la mora de Castilla en las salidas 1 (día 7) y 2 (día 14) almacenadas a 4 oC. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD Tratamientos Parámetro C Q 0,5 % Q1% Q2% I pH 2,88 ± 0,11ab 2,92 ± 0,07bc 2,90 ± 0,05b 2,95 ± 0,08c 2,85 ± 0,09a SST 7,08 ± 1,08ab 7,44 ± 0,80bc 7,83 ± 0,65cd 8,28 ± 0,40d 6,52 ± 0,71a Acidez (%) 1,78 ± 0,25a 1,71 ± 0,34a 1,66 ± 0,24a 1,60 ± 0,18a 1,70 ± 0,16a pH 2,90 ± 0,07a 2,94 ± 0,15a 3,03 ± 0,05b 3,08 ± 0,05b 2,92 ± 0,09a SST 7,00 ± 1,00a 7,08 ± 0,79a 7,76 ± 0,84b 8,40 ± 0,73c 6,88 ± 0,80a Acidez (%) 1,78 ± 0,41c 1,69 ± 0,10bc 1,61 ± 0,14ab 1,56 ± 0,12a 1,68 ± 0,09bc Salida 1 (Día 7) Salida 2 (Día 14) bc ± dF?e = fgB C: Control (Sin tratamiento) Q 0,5 %: Quitosano al 0,5 % Q 1 %: Quitosano al 1 % Q 2 %: Quitosano al 2 % I: Imazalil (5 cm3 L-1) 3.3.3.2.1 pH El pH de los frutos tiene una diferencia significativa entre los diferentes tratamientos aplicados y en el tiempo de almacenamiento (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.4. A pesar de que el pH de los frutos aumentó durante el almacenamiento, este siempre se mantuvo ácido (pH < 7). En comparación con el pH de los frutos en la entrada (t = 0 días), durante la primera salida (día 7), se tuvo un aumento de este parámetro del 3,97 % para los frutos control, del 5,42 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 4,70 % para los frutos recubiertos con 1 % de quitosano, del 6,50 % para los frutos recubiertos con 2 % de quitosano y del 2,89 % para los frutos recubiertos con Imazalil. En la segunda salida (día 14), se presentaron aumentos en el pH del 4,69 % para los frutos control, del 6,14 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 88 9,39 % para los frutos recubiertos con 1 % de quitosano, del 11,19 % para los frutos recubiertos con 2 % de quitosano y del 5,41 % para los frutos recubiertos con Imazalil. Las vacuolas de las células de mora de Castilla ocupan cerca del 90 % del volumen celular, y al poseer estos organelos un pH ácido (pH < 5), hacen que el pH de la fruta se mantenga ácido (Ávila et al., 2007, p. 4188). En este estudio, el aumento de este parámetro durante el almacenamiento probablemente se debió a la disminución de la acidez titulable total, a la transformación de los ácidos cítrico y málico en azúcares y a la translocación de carbohidratos de reserva en sacáridos simples (Ayala et al., 2013, p. 4184). Además, el quitosano también contribuyó en el incremento del pH. Estos resultados difieren de los resultados encontrados por Cruañes y Locaso (2011) en recubrimientos de quitosano al 1 % aplicados en arándanos y almacenados a 4 oC durante 7 días, en los cuales el pH no presentó diferencias significativas con respecto a los frutos testigo (p. 59). 3.3.3.2.2 Sólidos solubles totales (SST) Según los resultados obtenidos, el contenido de SST de los frutos es significativamente diferente entre los diferentes tratamientos aplicados (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.4. En la evaluación del factor tiempo de almacenamiento no se tuvo una diferencia significativa entre el contenido de SST de los frutos en las salidas 1 y 2 (días 7 y 14) (p > 0,05), sin embargo, el día 0 los frutos presentaron un contenido de SST significativamente menor al de los días 7 y 14 (p < 0,05). En comparación con los SST de los frutos en la entrada (t = 0 días), durante la primera salida (día 7), se tuvo una disminución de este parámetro del 9,35 % para 89 los frutos control, del 4,73 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano y del 16,52 % para los frutos recubiertos con Imazalil. Por el contrario, se tuvo un aumento del contenido de oBrix del 0,27 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano y del 6,02 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano. En la segunda salida (día 14), se presentaron disminuciones de los oBrix del 10,37 % para los frutos control, del 11,90 % para los frutos recubiertos con Imazalil, 0,64 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano y la disminución de oBrix para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano se mantuvo en 9,35 %. En cambio, el aumento de oBrix para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano fue del 7,55 %. La disminución del contenido de SST durante el almacenamiento en los frutos control, en los frutos recubiertos con quitosano al 0,5 y 1,0 % y en los frutos recubiertos con Imazalil se produjo debido a la falta de conversión de los almidones presentes en los azúcares de las moras y debido al consumo de azúcares como substratos para realizar los procesos biológicos como la respiración durante el almacenamiento en refrigeración a 4 oC (Chitarra y Chitarra, 2005, p. 116). La disminución de SST de los frutos es normal una vez que empiezan el proceso de senescencia (Vargas, Vargas, Centurió, Tamayo y Sauri, 2005, p. 18). El contenido del 2,0 % de quitosano en el recubrimiento aplicado a los frutos provocó un aumento significativo en el contenido de sólidos solubles totales durante el almacenamiento, incrementando los oBrix y mejorando las características organolépticas de los frutos (Vázquez y Guerrero, 2013, p. 7). Resultados similares en el aumento del contenido de SST obtuvieron los autores López et al. (2012, p. 158) al recubrir frutillas con soluciones de quitosano al 1 y 2 % y aceite de canela al 3 % y almacenarlas en refrigeración a 5 oC hasta 15 días. 90 3.3.3.2.3 Acidez titulable total El contenido de acidez de los frutos presentó una diferencia significativa entre los tratamientos con quitosano al 1,0 y 2,0 % y los demás tratamientos aplicados en las salidas 1 y 2 (días 7 y 14) (p < 0,05) como se puede observar en la Tabla 3.5. En la evaluación del factor días de almacenamiento no se tuvo una diferencia significativa entre el contenido de acidez de los frutos los días 7 y 14 (p > 0,05), sin embargo, el día 0 los frutos presentaron un contenido de acidez significativamente mayor al de los días 7 y 14 (p < 0,05). En comparación con la acidez de los frutos en la entrada (t = 0 días), durante la primera salida (día 7), se tuvo una pérdida de este parámetro del 15,24 % para los frutos control, del 18,57 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 20,95 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 14,03 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 17,98 % para los frutos recubiertos con Imazalil. En la segunda salida (día 14), se presentaron disminuciones en la acidez del 18,10 % para los frutos control, del 19,52 % para los frutos recubiertos con 0,5 % de quitosano, del 23,33 % para los frutos recubiertos con 1,0 % de quitosano, del 23,81 % para los frutos recubiertos con 2,0 % de quitosano y del 19,05 % para los frutos recubiertos con Imazalil. El contenido de acidez de los frutos durante el almacenamiento es inversamente proporcional al valor de su pH. La acidez valorable total en la mora de Castilla se presenta como porcentaje de ácido cítrico por ser el ácido orgánico predominante. La disminución de este parámetro se debe principalmente al consumo de los ácidos orgánicos durante la respiración y demás procesos bioquímicos que se producen durante el almacenamiento (Del Pilar, Fischer y Corredor, 2007, p. 87). Resultados similares en la disminución de acidez obtuvieron los autores Cruañes y Locaso (2011) al aplicar recubrimientos de quitosano al 1 % en arándanos y 91 almacenarlos a 4 oC durante 7 días. Los arándanos recubiertos con quitosano presentaban una acidez significativamente menor a la de los frutos testigo (p. 58). 3.3.3.3 Análisis sensorial Los parámetros sensoriales que se evaluaron a las moras de Castilla inoculadas con 105 conidias mL-1 de Botrytis spp y aplicadas los distintos tratamientos para el control de podredumbre fueron olor, color, textura y apariencia en general del fruto. En este primer análisis sensorial no se evaluó el aroma de los frutos debido a que estaban inoculados con el agente patógeno. Solamente se realizó una evaluación visual del efecto de los distintos recubrimientos en los atributos de las moras y en el control de podredumbres. En cada salida se aplicó un diseño factorial 4 × 5, donde los factores fueron atributos sensoriales y tratamientos aplicados. Los resultados de los análisis sensoriales se presentan en la Tabla 3.5. Durante la primera salida (día 7), se tuvo una diferencia significativa al evaluar los puntajes de los atributos sensoriales de los frutos aplicados los distintos tratamientos (p < 0,05). Los puntajes de los parámetros olor y color de los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 % fueron significativamente mayores a los puntajes de olor y color de los demás frutos con los distintos tratamientos (p < 0,05). Los puntajes de los parámetros de textura y apariencia en general de los frutos recubiertos con quitosano al 1,0 y 2,0 % fueron significativamente mayores a los puntajes de los demás tratamientos (p < 0,05), pero no fueron estadísticamente diferentes entre sí como se puede observar en la Tabla 3.5 (salida 1). 92 Tabla 3.5. Atributos sensoriales evaluados en la mora de Castilla almacenada hasta 14 días a 4 oC. Las letras minúsculas corresponden al factor tratamiento analizados con el test LSD Tratamientos Parámetro C Q 0,5 % Q1% Q2% I Olor 3,42 ± 1,11a 3,58 ± 0,90a 3,83 ± 0,67b 4,42 ± 0,73c 3,33 ± 0,84a Salida 1 Color 3,67 ± 1,00a 3,42 ± 0,89a 3,58 ± 0,87a 4,50 ± 0,85b 3,25 ± 0,80a (Día 7) Textura 3,17 ± 0,98a 3,33 ± 0,99a 4,00 ± 0,80b 4,17 ± 0,92b 3,08 ± 0,82a Apariencia 3,33 ± 1,20a 3,42 ± 1,10a 4,08 ± 0,80b 4,33 ± 0,75b 3,33 ± 0,85a Olor 3,25 ± 1,00a 2,83 ± 1,02b 2,83 ± 0,66b 3,58 ± 0,57c 2,33 ± 0,65d Salida 2 Color 2,00 ± 0,90a 2,08 ± 1,20a 2,92 ± 0,60b 3,58 ± 0,75c 2,25 ± 0,60a (Día 14) Textura 3,08 ± 0,90a 1,83 ± 1,01b 2,83 ± 0,70c 3,67 ± 0,60d 2,25 ± 0,60e Apariencia 1,83 ± 0,90a 1,75 ± 1,25a 3,58 ± 0,72b 3,58 ± 0,82b 2,33 ± 0,85c bc ± dF?e = 1>B C: Control (Sin tratamiento) Q 0,5 %: Quitosano al 0,5 % Q 1 %: Quitosano al 1 % Q 2 %: Quitosano al 2 % I: Imazalil (5 cm3 L-1) Durante la segunda salida (día 14) también se presentaron diferencias significativas entre los puntajes del factor tratamientos aplicados a los frutos (p < 0,05). Los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 % presentaron puntajes significativamente mayores a los demás tratamientos en todos los atributos sensoriales evaluados como se puede observar en la Tabla 3.5 (salida 2). Los frutos recubiertos con quitosano al 2 % presentaron mayor calidad sensorial durante los 14 días de almacenamiento. Esto se debió a que la barrera formada por el quitosano en los frutos les permitió disminuir la pérdida de peso, el atributo esencial para preservar la calidad organoléptica de las moras. Además, inhibió el desarrollo de Botrytis spp aumentando su vida útil (Márquez, Cartagena y Pérez, 2009, p. 106). 93 3.4 ANÁLISIS DEL EFECTO DE LA MEJOR CONCENTRACIÓN DE QUITOSANO EN LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA Y SENSORIAL DE MORA DE CASTILLA Los resultados obtenidos en las evaluaciones físico-químicas y sensoriales indicaron que el mejor tratamiento poscosecha para mora de Castilla fue el recubrimiento con quitosano al 2 % debido a que preservó la calidad de los frutos durante el almacenamiento y disminuyó considerablemente las podredumbres. Este tratamiento se escogió para su aplicación en frutos desinfectados y una posterior evaluación de la calidad microbiológica y sensorial. La evaluación de la calidad microbiológica y sensorial de los frutos se realizó los días 0 (salida 1), 7 (salida 2) y 14 (salida 3). Se evaluaron los parámetros de calidad de los frutos control (sin la aplicación de ningún tratamiento) y de los frutos recubiertos con quitosano al 2 %. 3.4.1 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Los resultados de los análisis microbiológicos de los frutos control y los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 %, almacenados hasta 14 días a 4 oC y 90 % de humedad relativa se presentan en la Tabla 3.6. En las salidas 1, 2 y 3 (días 0, 7 y 14) los resultados microbiológicos de aerobios y coliformes totales para los frutos control y los frutos recubiertos con quitosano fueron inferiores a los límites máximos permitidos para frutas semiprocesadas y refrigeradas, (1,00E+06 UFC/g y 1,00E+02 UFC/g respectivamente) según la Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para alimentos y bebidas de consumo humano, (2003). 94 Tabla 3.6. Análisis microbiológico de la mora de Castilla recubierta con quitosano al 2 % y de los frutos control en las salidas 1 (día 0), 2 (día 7) y 3 (día 14) almacenada a 4 oC Tratamientos Salidas 1 (Día 0) 2 (Día 7) 3 (Día 14) Microorganismos C Q2% Aerobios totales (UFC/g) 4,00E+01 < 1,00E+01 Mohos y levaduras (UFC/g) < 1,00E+01 < 1,00E+01 Coliformes totales (UFC/g) < 1,00E+01 < 1,00E+01 Aerobios totales (UFC/g) 4,50E+02 7,00E+01 Mohos y levaduras (UFC/g) 1,28E+03 1,70E+02 Coliformes totales (UFC/g) < 1,00E+01 < 1,00E+01 Aerobios totales (UFC/g) 2,80E+03 9,80E+02 Mohos y levaduras (UFC/g) 2,30E+03 4,70E+02 Coliformes totales (UFC/g) < 1,00E+01 < 1,00E+01 bc ± dF?e = fgB C: Control Q 2 %: Quitosano al 2 % Los resultados de los análisis de mohos y levaduras de los frutos control y de los frutos recubiertos de la salida 1 (día 7), fueron inferiores al límite máximo permitido (1,00E+02 UFC/g). Sin embargo, en las salidas 2 y 3 (días 7 y 14) los frutos control excedieron los límites máximos permitidos. Los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 % se mantuvieron dentro de los límites permitidos los 15 días de almacenamiento. Los frutos tratados con quitosano al 2,0 % no presentaron incidencia de coliformes totales durante todo el almacenamiento. El contaje de las colonias de aerobios totales y mohos y levaduras de estos frutos siempre se mantuvieron por debajo de los límites permitidos. Estos resultados demostraron que el quitosano es un tratamiento efectivo para el control de podredumbres durante la poscosecha (Cruañes y Locaso, 2011, p. 60). 95 Los autores López et al. (2012) demostraron que el crecimiento de mesófilos aerobios de frutillas recubiertas con quitosano al 2 % y aceite de canela fue significativamente menor a los frutos control durante los 14 días de almacenamiento refrigerado a 5 oC (p. 40). 3.4.2 ANÁLISIS SENSORIAL Los parámetros sensoriales que se evaluaron a las moras de Castilla aplicadas la concentración de quitosano más efectiva para el control de podredumbre (2,0 %) fueron color, firmeza, apariencia en general y aroma del fruto. En cada salida se aplicó un diseño factorial 4 × 2, donde los factores fueron atributos sensoriales y tratamientos aplicados. Los resultados de los análisis sensoriales se presentan en la Tabla 3.7. Durante la primera salida (día 7), no hubo diferencias significativas entre los puntajes de los panelistas en el factor de atributos sensoriales evaluados (p > 0,05). Sin embargo, se tuvo una diferencia significativa al evaluar los puntajes de los distintos tratamientos (p < 0,05). Los puntajes de los parámetros color, firmeza y apariencia general de los frutos recubiertos con quitosano fueron significativamente mayores a los puntajes de los frutos control (p < 0,05). Sin embargo, el puntaje del atributo aroma de los frutos recubiertos con quitosano fue significativamente menor al puntaje de los frutos control. (p < 0,05). Durante la segunda (día 7) y tercera salidas (día 14), se presentaron diferencias significativas entre los puntajes del factor de tratamientos aplicados a los frutos (p < 0,05), como se puede observar en la Tabla 3.7. Los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 % presentaron puntajes significativamente mayores en todos los atributos sensoriales evaluados (color, firmeza, apariencia en general y aroma) a los frutos control. 96 Tabla 3.7. Atributos sensoriales evaluados en la mora de Castilla recubierta con quitosano al 2 % y de los frutos control en las salidas 1 (día 0), 2 (día 7) y 3 (día 14), almacenada a 4 oC, analizados con el test LSD Tratamientos Salidas Parámetros C Q2% Color 4,00 ± 0,87a 4,67 ± 0,82b Firmeza 3,75 ± 0,92a 4,75 ± 0,90b Apariencia general 3,50 ± 0,85a 4,67 ± 0,85b Aroma 4,17 ± 0,99a 3,58 ± 0,85b Color 3,50 ± 1,01a 4,58 ± 0,68b Firmeza 3,08 ± 0,92a 4,00 ± 0,75b Apariencia general 2,92 ± 0,90a 4,00 ± 0,70b Aroma 3,25 ± 0,85a 4,25 ± 0,80b Color 2,33 ± 0,68a 4,08 ± 0,78b Firmeza 2,92 ± 0,68a 3,75 ± 0,76b Apariencia general 2,92 ± 0,75a 3,67 ± 0,83b Aroma 2,75 ± 0,70a 3,83 ± 0,90b 1 (Día 0) 2 (Día 7) 3 (Día 14) bc ± dF?e = fgB C: Control Q 2 %: Quitosano al 2 % Los frutos recubiertos con quitosano al 2,0 % presentaron mayor calidad sensorial durante los 14 días de almacenamiento en todos los parámetros evaluados excepto el aroma durante la primera salida. Los panelistas identificaron un sabor amargo residual durante el análisis sensorial, esto se debió a la diferencia de pH y sólidos solubles totales entre el recubrimiento y los frutos. Este sabor amargo inicial desapareció rápidamente, no se detectó en los días siguientes y no afectó los demás atributos sensoriales (Lárez, 2008, p. 19). 97 Los autores Huaqiang, Liangying, Jiahou y Kunwang (2004) demostraron que recubrimientos de quitosano al 1, 2 y 3 % aplicados en frutillas mantuvieron los atributos de la calidad sensorial de los frutos almacenados durante 9 días a 5 oC (p. 355). Contreras, Pérez, Salvador, Bermejo y Rojas (2012) demostraron que recubrimientos de quitosano al 0,6, 1,2 y 1,8 % aplicados en naranjas valencianas mantuvieron sus características organolépticas durante el almacenamiento hasta 5 semanas a 5 oC. (p. 448) 3.5 ESTIMACIÓN DE COSTOS TRATAMIENTO POSCOSECHA DE APLICACIÓN DEL El análisis de los costos de la aplicación de recubrimientos en base a quitosano proporciona información económica y permite tomar decisiones sobre la factibilidad de ejecutar el proyecto a nivel industrial. El tratamiento poscosecha que se evaluó en el proyecto consiste en la aplicación de un recubrimiento de quitosano al 2 % en mora de Castilla fresca. La fruta provino de la asociación de productores de mora de Castilla de la provincia de Tungurahua en la ciudad de Ambato. La estimación de los costos de aplicación de este tratamiento poscosecha se realizó para 100 kg de mora. Los productores comercializan aproximadamente 100 kg de fruta semanalmente. Después de la aplicación del tratamiento las frutas se empacarían en evases de polieileno tereftalato (PET) de 250 gramos. Los costos de los equipos y su implementación se presentan en la tabla 3.8. 98 Tabla 3.8. Costo total de equipos necesarios para la aplicación de recubrimiento de quitosano en mora de Castilla como tratamiento poscosecha Equipo Cantidad Homogenizador industrial IKA ULTRA TURRAX1 1 2 500,00 Ventilador industrial de circulación 1/3 HP2 2 1 600,00 1 120,00 Tanques de acero inoxidable 3 4 240,00 Destilador de agua manual, comercial 12 gal/día4 1 800,00 Plancha de acero inoxidable (1,20 x 1,20 m) Montaje e instalación 3 Costo (USD) Subtotal 5 260,00 5 1 315,00 Impuestos e importación6 Total 2 630,00 9 205,00 1 : Dutscher Scientific 2 : IndustrialFansDirect.com 3 : DIPAC: productos de acero 4 : APSWATER 5 : 25 % del subtotal 6 : 40 % del precio neto de equipos Los equipos requeridos para la implementación de este tratamiento poscosecha son los mismos que se utilizaron durante el desarrollo del proyecto en el laboratorio pero con mayor capacidad. El homogenizador debe tener una capacidad mínima de 30 kg. Los ventiladores, tanques y plancha de acero inoxidable deben ser industriales. La capacidad para el tanque de lavado de los frutos debe ser de 100 L, y la de los tanques de inmersión de 50 L. Los costos semanales para la implementación del tratamiento poscosecha se presentan en la Tabla 3.9. La estimación semanal de los costos de implementación de este tratamiento poscosecha se realizó en función de los costos de la materia prima e insumos, mano de obra, servicios básicos, mantenimiento y depreciación de equipos. El costo de energía eléctrica se calculó en función del tiempo de uso de los ventiladores y el homogenizador (4 y 2 horas diarias respectivamente). 99 El costo del agua se determinó en función de la cantidad que se utiliza en los procesos de lavado, desinfección y elaboración del tratamiento poscosecha. El costo de mantenimiento se obtuvo del 5 % del costo total de equipos y para la depreciación se consideró un tiempo de 10 años. Tabla 3.9. Costos semanales de la aplicación de un recubrimiento de quitosano en mora de Castilla como tratamiento poscosecha Parámetro Costo unitario (USD) Unidad Cantidad Costo total (USD) Materia prima Mora de Castilla 3,00 kg 100 300,00 Quitosano 1,00 g 400 400,00 Ácido ascórbico 0,01 g 200 1,60 Cloro 0,02 mL 100 2,00 Envases perforados PET 0,15 unidad 200 30,00 Insumos Mallas plásticas 2 0,45 m 1 0,45 85,00 p/semana 2 170,00 225,00 p/semana 1 225,00 Mano de obra directa Trabajadores Mano de obra indirecta Control de calidad Servicios básicos Agua 0,72 m3 0,15 0,11 Energía eléctrica 0,09 kW/h 0,94 0,08 9 205,00 Semanas 52 8,85 9 205,00 Semanas 780 1,18 Mantenimiento Equipos Depreciación de equipos Total equipos TOTAL 1 169,27 El costo por envase de 250 gramos de mora de Castilla con la aplicación del tratamiento en base de quitosano sería $ 2,92. El precio de venta al público con una utilidad del 25 % del envase con 250 g de fruto sería $ 3,65. El precio de venta al público de la mora de Castilla en mercados locales se 100 encuentra aproximadamente en $ 3,00 el kg, y el precio de la fruta envasada en empaques PET de 250 g también está alrededor de $ 3,00 en los supermercados. El precio de venta al público de las moras tratadas no es competitivo con el precio de la fruta en los mercados y supermercados, sin embargo este producto aumenta considerablemente el tiempo de vida útil (hasta 14 días) y mantiene la calidad de los frutos ampliando su campo de comercialización. Por lo tanto, la aplicación de un recubrimiento de quitosano al 2,0 % en mora de Castilla sería un excelente tratamiento poscosecha. 101 4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 4.1 CONCLUSIONES · Los hongos patógenos que afectan a la mora de Castilla proveniente de la provincia de Tungurahua durante el período poscosecha son Botrytis spp, Colletotrichum spp, Rhizopus spp, Mucor spp, Geotrichum spp, Penicillium spp Cladosporium spp y Fusarium spp. · El hongo responsable de la podredumbre más severa de mora de Castilla durante el almacenamiento refrigerado a 4 oC y 90 % de humedad relativa es Botrytis spp. · El tratamiento más efectivo para el control de podredumbres poscosecha en la mora de Castilla almacenada a 4 oC y 90 % de humedad relativa es el recubrimiento de quitosano al 2,0 %. · El mejor tratamiento para preservar la calidad físico-química y sensorial de la mora de Castilla durante el almacenamiento a 4 oC y 90 % de humedad relativa hasta 14 días es la aplicación de la solución de quitosano al 2,0 % en los frutos. · El tratamiento poscosecha con quitosano al 2,0 % preserva la calidad microbiológica de los frutos almacenados hasta 14 días a 4 oC y 90 % de HR manteniendo por debajo de los límites máximos permitidos los aerobios y coliformes totales y los mohos y levaduras. · Los panelistas identificaron un sabor amargo en los frutos tratados con quitosano al 2,0 % durante la primera salida. Este sabor no se detectó durante la segunda y tercera salida. · La mora de Castilla por lo general tiene un tiempo de vida útil de 3 días en refrigeración, los tratamientos con quitosano al 2,0 % extendieron la vida útil de la mora de Castilla hasta 14 días al almacenarla en refrigeración a 4 oC y 90 % 102 de HR, por lo que se aumentó la vida útil de los frutos 11 días. · La implementación del tratamiento poscosecha con quitosano al 2,0 % en mora de Castilla provee un valor agregado a la fruta y aumenta el PVP aumentando considerablemente la rentabilidad a los productores. 4.2 RECOMENDACIONES · Variar la concentración del ácido orgánico (ácido ascórbico) utilizado como solvente para los tratamientos con quitosano. · Utilizar otro ácido orgánico en lugar del ácido ascórbico para disolver los recubrimientos en base a quitosano. · Probar la efectividad en el control de podredumbre de mora de Castilla con tratamientos de quitosano cuyas concentraciones varíen entre 1,0 y 2,0 %. · Elaborar un subproducto con la mora de Castilla recubierta con quitosano para aumentar aún más el valor agregado del tratamiento poscosecha (jugos, pulpas, mermeladas, vinos). 103 BIBLIOGRAFÍA 1. 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APARIENCIA GENERAL 5 4 Me gusta extremadamente 3 2 1 Me gusta No me gusta ni Me disgusta Me disgusta moderadamente me disgusta moderadamente extremadamente Código Código Código Código Código FIRMEZA Código Código Código Código Código 5 4 3 2 1 Considerablemente firme Firme Ni firme ni blando Blando Considerablemente blando 119 COLOR 5 4 3 2 1 Considerablemente intenso Intenso Ni intenso ni opaco Opaco Considerablemente opaco Código Código Código Código Código OLOR 5 Me gusta extremadamente 4 3 2 1 Me gusta No me gusta ni Me disgusta Me disgusta moderadamente me disgusta moderadamente extremadamente Código Código Código Código Código Observaciones _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ GRACIAS POR SU COLABORACIÓN 120 ANEXO IV FORMATO PARA EL ANÁLISIS SENSORIAL DE LOS FRUTOS CONTROL Y DE LOS FRUTOS RECUBIERTOS CON QUITOSANO Escuela Politécnica Nacional Departamento de Ciencia de Alimentos y Biotecnología Evaluación Sensorial Nombre: Producto: mora de Castilla Fecha: Hora: Instrucciones Frente a usted tiene dos muestras de mora de Castilla, por favor coloque los códigos de las muestras y valore los parámetros sensoriales de cada una de acuerdo al puntaje que le parezca colocando una “X” en la casilla que corresponda. APARIENCIA GENERAL 5 4 Me gusta extremadamente 3 2 1 Me gusta No me gusta ni Me disgusta Me disgusta moderadamente me disgusta moderadamente extremadamente Código Código FIRMEZA Código Código 5 4 3 2 1 Considerablemente firme Firme Ni firme ni blando Blando Considerablemente blando 121 COLOR 5 4 3 2 1 Considerablemente intenso Intenso Ni intenso ni opaco Opaco Considerablemente opaco Código Código AROMA 5 Me gusta extremadamente 4 3 2 1 Me gusta No me gusta ni Me disgusta Me disgusta moderadamente me disgusta moderadamente extremadamente Código Código Observaciones _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ GRACIAS POR SU COLABORACIÓN