ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DEL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO POR IRRADIACIÓN Y DE LA CALIDAD POSCOSECHA DURANTE EL ALMACENAMIENTO REFRIGERADO DE LA NARANJILLA (Solanum quitoense Lam.) IRRADIADA PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO LUIS GABRIEL MONTENEGRO RIVERA [email protected] DIRECTOR: ING. MARÍA CATALINA VASCO CARRILLO, PhD. [email protected] CO-DIRECTOR: ING. SILVIA AZUCENA VALENCIA CHAMORRO, PhD. [email protected] Quito, Diciembre 2015 © Escuela Politécnica Nacional 2015 Reservados todos los derechos de reproducción DECLARACIÓN Yo, Luis Gabriel Montenegro Rivera, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento. La Escuela Politécnica Nacional puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente. __________________________ Luis Gabriel Montenegro R. CERTIFICACIÓN Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por el Sr. Luis Gabriel Montenegro Rivera, bajo mi supervisión. ___________________________ Ing. Catalina Vasco, PhD. ____________________________ Ing. Silvia Valencia Chamorro, PhD. DIRECTORA DE PROYECTO CODIRECTORA DE PROYECTO AUSPICIO La presente investigación contó con el auspicio financiero del proyecto interno PIIDCN-2013-001: “Estudio de la inhibición del pardeamiento enzimático por irradiación y de la calidad poscosecha de la naranjilla (Solanum quitoense Lam.) durante el almacenamiento refrigerado posterior”, que se realizó en el Departamento de Ciencias Nucleares. AGRADECIMIENTO Ante todo, a Dios por su infinito amor y por todas las bendiciones derramadas sobre mí y los míos. A mi familia entera por ser lo más importante en mi vida. A mi esposa e hija, a mis padres, a mis hermanas y por su puesto a mis sobrinos y sobrinas. Al Departamento de Ciencias Nucleares DCN, al Departamento de Ciencia de Alimentos y Biotecnología DECAB y a la Escuela Politécnica Nacional EPN, por la apertura, por los laboratorios facilitados para la ejecución de esta investigación, y por el apoyo económico concedido. A las ingenieras, Catalina Vasco y Silva Valencia por su apoyo incondicional, su paciencia y su guía oportuna. A Jeiny por compartirme su experiencia y a todos quienes estuvieron ayudándome en el desarrollo experimental de este estudio, entre ellos: a la Sra. Rosalía por proveerme de naranjilla y a mi hermana Gilmy por ayudarme a cosecharla; a Gaby, Pao, Evelin, Anita, Oscar, Carlos, Natalia, Ruth, Luis y a Isa por darme una manito en los laboratorios. Al personal docente, técnico y administrativo del Laboratorio de Química Orgánica e Investigaciones Aplicadas por todo el tiempo de calidad compartido. A mis amigos Xavy, Luchito, Danny e Iván y a mis amigas Gaby A., Caro, Grace y Geovanna, porque de una u otra manera me alentaron para seguir. DEDICATORIA Al motor de mi vida, Emmily Gabriela A mis padres Luis y Fanny A mi compañera de vida y apoyo incondicional, Laurita Katerine i ÍNDICE DE CONTENIDOS RESUMEN INTRODUCCIÓN 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA PÁGINA xi xii 1 1.1 Naranjilla (Solanum quitoense Lam.) 1.1.1 Generalidades 1.1.2 Variedades 1.1.2.1 Variedades comunes tradicionales 1.1.2.2 Naranjilla de jugo mejorada 1.1.2.3 Híbridos comerciales 1.1.3 Características fisicoquímicas y nutricionales 1.1.4 Usos y beneficios 1.1.5 Fisiología de los frutos 1.1.5.1 Respiración 1.1.5.2 Transpiración 1.1.6 Manejo poscosecha 1.1.6.1 Recolección o cosecha 1.1.6.2 Selección y Clasificación 1.1.6.3 Pre enfriamiento 1.1.6.4 Limpieza y Desinfección 1.1.6.5 Secado y encerado 1.1.6.6 Empaque y transporte 1.1.6.7 Almacenamiento 1.1.7 Estadísticas de producción y exportación 1 1 3 3 3 4 4 6 7 7 8 9 10 10 12 12 13 13 14 14 1.2 Pardeamiento enzimático en frutos frescos 1.2.1 Pardeamiento por polifenoloxidasa (PPO) 1.2.2 Modo de acción de las polifenoloxidasas 1.2.3 Factores medioambientales relacionados con la acción enzimática 1.2.4 Factores precosecha y poscosecha que afecta al pardeamiento enzimático 1.2.5 Control del pardeamiento enzimático 17 17 19 22 22 1.3 Irradiación de frutas 1.3.1 Generalidades 1.3.2 Ventajas y desventajas 1.3.3 Efectos y objetivos 1.3.4 Irradiación combinada con otros tratamientos poscosecha 1.3.5 irradiadores 1.3.5.1 Fuente de isótopos 1.3.5.2 Irradiador de la escuela politécnica nacional 1.3.6 Legislación 27 27 28 29 32 33 33 34 36 21 ii 2 3 PARTE EXPERIMENTAL 38 2.1 Determinación del rango de dosis de irradiación y el efecto de la radiación sobre la calidad global de la naranjilla 2.1.1 Caracterización inicial de la naranjilla 2.1.2 Preparación de la fruta para la irradiación 2.1.3 Diseño experimental 2.1.4 Análisis fisico químico, sensorial y bioquímico 38 38 40 42 42 2.2 Determinación de la dosis de irradiación necesaria para inhibir el pardeamiento enzimático en la naranjilla 43 2.3 Estudio del efecto de los procesos de irradiación y refrigeración sobre la calidad poscosecha y la actividad de la polifenoloxidasa (PPO) de la naranjilla irradiada 2.3.1 Preparación de la fruta para la irradiación y almacenamiento 2.3.2 Diseño experimental 2.3.3 Análisis físico, químico, sensorial, fisiológico y bioquímico 2.3.3.1 Acidez titulable 2.3.3.2 Pérdida de peso 2.3.3.3 Calidad visual 2.3.3.4 Calidad sensorial 2.3.3.5 Tasa de respiración (TR) 44 44 45 45 46 46 47 48 49 2.4 Diseño básico de un proceso de elaboración de pulpa de naranjilla irradiada 50 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51 3.1 Determinación del rango de dosis de irradiación y el efecto de la radiación sobre la calidad global de la naranjilla 3.1.1 Caracterización inicial de la materia prima 3.1.2 Apariencia y calidad sensorial global 3.1.3 Propiedades fisicoquímicos 3.1.4 Actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO) 51 51 54 56 59 3.2 Determinación de la dosis de irradiación necesaria para inhibir el pardeamiento enzimático en la naranjilla 61 3.3 Estudio del efecto de los procesos de irradiación y refrigeración sobre la calidad poscosecha y la actividad de la polifenoloxidasa (PPO) de la naranjilla irradiada 3.3.1 Propiedades fisicoquímicas 3.3.2 Calidad visual 3.3.3 Calidad sensorial 3.3.4 Tasa de respiración 3.3.5 Actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO) 64 65 74 81 84 86 iii 4 3.4 Diseño básico de un proceso de elaboración de pulpa de naranjilla irradiada 3.4.1 Definición del producto 3.4.2 Capacidad de producción 3.4.3 Materia prima e insumos 3.4.4 Descripción del proceso y definición del diagrama de bloques (BFD) 3.4.5 Balances de masa y energía y definición del diagrama de flujo del proceso (PFD) 3.4.6 Selección de los equipos principales 96 100 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 110 4.1 Conclusiones 4.2 Recomendaciones 110 111 91 91 92 92 93 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 112 ANEXOS 124 iv ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la naranjilla PÁGINA 1 Tabla 1.2. Composición nutricional de la naranjilla 5 Tabla 1.3. Composición química y nutricional de las variedades comerciales de naranjilla en el Ecuador 5 Tabla 1.4. Composición fisicoquímica de la naranjilla de jugo mejorada, INIAP Quitoense-2009 6 Tabla 1.5. Clasificación de la naranjilla en función del calibre 11 Tabla 1.6. Clasificación de la naranjilla en función de su categoría 11 Tabla 1.7. Total de exportaciones de naranjilla ecuatoriana por país de destino, para los años 2013 y 2014 16 Tabla 1.8. Dosis de radiación aplicadas para diferentes objetivos 31 Tabla 1.9. Resultados de la irradiación de alimentos combinada con otros tratamientos poscosecha 32 Tabla 2.1. Escala de valoración para a evaluación de la calidad visual de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009, durante el almacenamiento refrigerado 47 Tabla 2.2. Escala de valoración de la calidad visual final de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009, durante el almacenamiento refrigerado 48 Tabla 3.1. Caracterización fisicoquímica y bioquímica inicial de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 51 Tabla 3.2. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla recién cosechada irradiada a las dosis de estudio 62 Tabla 3.3. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en los extractos enzimáticos de naranjilla irradiados a las dosis de estudio 62 Tabla 3.4. Firmeza, pH, sólidos solubles totales y acidez titulable de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 irradiada a 500 Gy y almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR 65 v Tabla 3.5. Evaluación de la calidad visual de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 74 Tabla 3.6. Índice de calidad visual de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 80 Tabla 3.7. Evaluación sensorial de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 82 Tabla 3.8. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 87 Tabla 3.9. Resumen del balance de masa para el proceso de elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada 96 Tabla 3.10. Simbología de los equipos principales utilizados para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada 99 Tabla 3.11. Hoja de especificaciones técnicas de la balanza industrial 101 Tabla 3.12. Hoja de especificaciones técnicas de la banda transportadora 102 Tabla 3.13. Hoja de especificaciones técnicas de la lavadora de frutas 103 Tabla 3.14. Hoja de especificaciones técnicas de las canastillas plásticas 104 Tabla 3.15. Hoja de especificaciones técnicas de la fuente de Co60 105 Tabla 3.16. Hoja de especificaciones técnicas de la cámara de maduración 106 Tabla 3.17. Hoja de especificaciones técnicas de la despulpadora de frutas 107 Tabla 3.18. Hoja de especificaciones técnicas de la envasadora al vacío 108 Tabla 3.19. Hoja de especificaciones técnicas del cuarto frío 109 Tabla AII.1. Formulario para la evaluación de la calidad global de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 125 Tabla AV.1. Formulario para la evaluación de la calidad visual de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 133 vi ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA Figura 1.1. Naranjilla de jugo (Solanum quitoense Lam.), variedad INIAP Quitoense-2009 2 Figura 1.2. Producción de naranjilla a nivel nacional 15 Figura 1.3. Principales sustratos fenólicos de la polifenoloxidasa presente en los productos hortofrutícolas 18 Figura 1.4. Mecanismo simplificado de la acción de las polifenoloxidasas 20 Figura 1.5. Esquema de las instalaciones del irradiador batch de la EPN 35 Figura 1.6. Símbolo internacional de irradiación “radura” 36 Figura 2.1. Disposición física de la naranjilla en las canastillas plásticas, alrededor de la fuente de Co60 41 Figura 3.1. Gráfico de medias e intervalos LSD para la apariencia externa de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiadas a las dosis de estudio 54 Figura 3.2. Gráfico de medias e intervalos LSD para la calidad sensorial global de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio 55 Figura 3.3. Gráfico de medias e intervalos LSD para los sólidos solubles totales de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio 57 Figura 3.4. Gráfico de medias e intervalos LSD para el pH de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio 57 Figura 3.5. Gráfico de medias e intervalos LSD para la firmeza de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio 58 Figura 3.6. Gráfico de medias e intervalos LSD para la actividad enzimática de la PPO en la naranjilla fresca sin irradiar (0 Gy) y en la naranjilla irradiada a las dosis de estudio 60 Figura 3.7. Gráfico de medias e intervalos LSD para la actividad enzimática de la PPO en los extractos de naranjilla sin irradiar (0 Gy) y en los extractos irradiados a las dosis de estudio 60 vii Figura 3.8. Gráfico de medias e intervalos LSD de la firmeza de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 66 Figura 3.9. Firmeza de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 67 Figura 3.10. Gráfico de medias e intervalos LSD de la firmeza de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 67 Figura 3.11. pH de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 69 Figura 3.12. Sólidos solubles totales de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 69 Figura 3.13. Gráfico de medias e intervalos LSD del pH de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 70 Figura 3.14. Gráfico de medias e intervalos LSD de los sólidos solubles totales de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 70 Figura 3.15. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez titulable de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 71 Figura 3.16. Acidez titulable de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 72 Figura 3.17. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez titulable de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 72 Figura 3.18. Pérdida de peso de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 73 Figura 3.19. Turgencia de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 75 Figura 3.20. Gráfico de medias e intervalos LSD de la turgencia de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 76 viii Figura 3.21. Gráfico de medias e intervalos LSD de los daños físicos en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 76 Figura 3.22. Daños físicos en la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 77 Figura 3.23. Gráfico de medias e intervalos LSD de los daños en la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 77 Figura 3.24. Gráfico de medias e intervalos LSD de la marchitez del cáliz de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 78 Figura 3.25. Marchitez del cáliz de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 79 Figura 3.26. Gráfico de medias e intervalos LSD de la marchitez del cáliz de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 79 Figura 3.27. Gráfico de medias e intervalos LSD de la dureza de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 83 Figura 3.28. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 83 Figura 3.29. Corte transversal de frutos de naranjilla A) naranjilla sin irradiar y B) naranjilla irradiada 84 Figura 3.30. Tasa de respiración de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 85 Figura 3.31. Gráfico de medias e intervalos LSD de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 86 ix Figura 3.32. Actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 87 Figura 3.33. Diagrama de bloques para la elaboración de pulpa de naranjilla irradiada a una dosis de 500 Gy 95 Figura 3.34. Diagrama de flujo para la elaboración de pulpa de naranjilla irradiada a una dosis de 500 Gy 98 Figura AI.1. Tabla de color para la recolección de naranjilla de jugo variedad INIAP Quitoense-2009 125 Figura AIV.1. Escala para evaluar la turgencia en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 130 Figura AIV.2. Escala para evaluar los daños físicos en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 131 Figura AIV.3. Escala para evaluar la marchitez del cáliz en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 132 x ÍNDICE DE ANEXOS ANEXO I Tabla de color para la cosecha de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 125 ANEXO II Formulario de registro para la evaluación de la calidad global de la naranjilla 126 ANEXO III Determinación de la actividad polifenoloxidasa 127 ANEXO IV Escala para la evaluación de la calidad visual de naranjilla 130 ANEXO V Formulario de registro para la evaluación de la calidad visual de naranjilla 133 ANEXO VI Formulario de registro para el análisis sensorial de naranjilla 134 xi RESUMEN El objetivo de esta investigación fue estudiar la inhibición del pardeamiento enzimático por irradiación y la calidad poscosecha durante el almacenamiento refrigerado de la naranjilla (Solanum quitoense Lam.) irradiada. En el desarrollo experimental se utilizó naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009 cosechada en madurez fisiológica (75 % de coloración amarilla). Se evaluaron las propiedades físico, químico y bioquímicas de la naranjilla de jugo en el rango de dosis de 250 a 3 000 Gy. La naranjilla irradiada se almacenó hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR, realizando muestreos cada 15 días más un tiempo de 7 días de almacenamiento a 20 °C y 80 %HR para simular el tiempo de vida en estante, y se determinó la firmeza, pH, SST (°Brix), acidez titulable, pérdida de peso (%), actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO), la calidad sensorial y la apariencia de los frutos. Como control se usó naranjilla sin irradiar. Finalmente se planteó un diseño básico para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla, en el que se incluyó a la irradiación como una operación unitaria alternativa para mitigar el pardeamiento enzimático en la pulpa. Se determinó que la dosis de 500 Gy permite conservar las propiedades: pH, sólidos solubles totales (SST), firmeza y apariencia y calidad sensorial global de los frutos; e inhibir la actividad de la PPO en un 38,37 %. Durante el estudio poscosecha, el tratamiento con radiación gamma inhibió la actividad enzimática en un 29,31 %, sin hallarse diferencias estadísticas significativas en el pH, SST, acidez titulable y la pérdida de peso; a pesar que hubo una pérdida total de la firmeza de la naranjilla tratada. La irradiación permitió inhibir parcialmente (> 30%) el pardeamiento enzimático, conservando las características propias de la naranjilla y pudiéndole procesar para obtener una pulpa congelada de naranjilla irradiada que cumpliría con los requisitos físico, químico y sensoriales establecidos por la norma técnica ecuatoriana INEN 2337:2008, para pulpas de fruta. xii INTRODUCCIÓN La naranjilla (Solanum quitoense Lam.) es una fruta climatérica originaria del Ecuador que posee gran aceptación en los mercados nacionales e internacionales por considerarse una fruta exótica de alto valor nutritivo y de sabor y aroma característicos (FAO, 2006). En nuestro país se produce naranjilla a nivel comercial en la región amazónica, donde se cultivan las variedades comunes: agria, Baeza dulce y espinosa; los híbridos: Puyo, Palora y Mera; y la naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009 que se caracteriza por ser más resistente al ataque de plagas y enfermedades, presentar alta productividad y reunir buenas características de calidad que le hacen apetecida para el consumo en fresco e industrializado (Revelo et al., 2010, pp. 27-30). Sin embargo, esta fruta es altamente perecible por lo que su tiempo de consumo en fresco es corto, debiéndosele comercializar principalmente procesada en forma de jugo o pulpa. Además, durante su procesamiento presenta una marcada tendencia al pardeamiento enzimático, proceso oxidativo que genera cambios en las características organolépticas y pérdidas del valor nutricional (Mejía et al., 2014, p. 108). Las reacciones del pardeamiento enzimático, están catalizadas esencialmente por las polifenoloxidasas (PPO), enzimas caracterizadas por tener dos átomos de cobre en su centro activo. Las PPO y los sustratos fenólicos de hallan en compartimientos celulares autónomos y separados dentro del tejido vegetal, es por esto que en las frutas sanas no tienen lugar los procesos oxidativos; por el contrario cuando estas experimentan algún daño mecánico, las polifenoloxidasas entran en contacto con los sustratos fenólicos y en presencia del oxígeno molecular catalizan la hidroxilación de monofenoles a orto-difenoles que se oxidan enzimáticamente a orto-quinonas, las cuales polimerizan rápidamente para formar melaninas con pigmentaciones pardas (Astiasarán y Martínez, 2000, p. 205; De la Rosa, Alvarez, y Gonzáles, 2010, p. 110; González, Gardea, y Cuamea, 2005, p. 156; Simpson, 2012, p. 51). xiii La irradiación es una pasteurización en frío cuyos propósitos en las frutas frescas son: desinfestación de insectos, control fitosanitario, retraso de los procesos de maduración y senescencia e inhibición de las reacciones enzimáticas (Arvanitoyannis, 2010, p. 518; Bello, 2008, p. 450; Díaz, 2009, p. 324; Rahman y Ahmed, 2012, p. 967). En Ecuador se han estudiado diversas metodologías de inhibición del pardeamiento enzimático en la naranjilla, entre ellas: tratamiento térmico (Oquendo, 1980, p. 121); tratamiento químico con el uso de ácido ascórbico y preservantes (Mosquera, 2008, p. 76); aplicación de pulsos eléctricos de alta intensidad (Vilcaguano, 2013, pp. 65-67); y uso de radiación ultravioleta (Samaniego, 2014, p. 72). Todos estos estudios se realizaron ya se en el jugo o en el néctar de la naranjilla; sin embargo no se ha estudiado la posibilidad de inhibir el pardeamiento enzimático en la naranjilla, mediante el tratamiento con radiación gamma previo a su procesamiento. Por ello, el objetivo de esta investigación fue estudiar el efecto de la irradiación sobre la actividad enzimática de la polifenoloxidasa y la calidad poscosecha de la naranjilla durante el almacenamiento refrigerado a condiciones de temperatura y humedad relativa establecidas; además se diseñó un proceso de elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada. 1 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 NARANJILLA (Solanum quitoense Lam.) 1.1.1 GENERALIDADES La naranjilla (Solanum quitoense Lam.) es una planta semisilvestre perteneciente a la familia de las Solanáceas (FAO, 2006); su desarrollo y producción se da favorablemente en zonas con clima tropical y subtropical húmedo; la naranjilla común o de jugo se cultiva a altitudes de entre 800 y 1 700 msnm, a temperaturas comprendidas entre 17 y 29 °C; con precipitaciones óptimas de 2 500 mm/año, a humedades relativas comprendidas entre 78 y 92 % y a pH entre 5,3 y 6,0 (Revelo et al., 2010, pp. 13, 14). La clasificación taxonómica de la naranjilla se presenta en la Tabla 1.1. Tabla 1.1. Clasificación taxonómica de la naranjilla Reino Vegetal División Angiosperma Subdivisión Dicotiledónea Clase Simpétala Subclase Pentacíclica Orden Tubifloras Familia Solanácea Sección Lasiocarpa Género Solanum Especie quitoense Variedad quitoense (sin espinas); septentrionale (con espinas) Nombres comunes Naranjilla en Ecuador y Perú; lulo en Colombia; naranjilla de castilla en España; quito orange en Estados Unidos; morelle de Quito en Francia; gele terong en Holanda y berenjena de olor en Costa Rica (FAO, 2007; Revelo et al., 2010, p. 24) 2 Morfológicamente la naranjilla se describe como una planta con una raíz principal fibrosa de hasta 50 cm; el tallo es robusto, semileñoso, cilíndrico y velloso con o sin espinas; la naranjilla común alcanza una altura de hasta 2,0 m y los híbridos hasta 1,3 m; las hojas son de forma oblonga y ovaladas de 30 a 40 cm de largo; las flores son de color blanco con forma estrellada; los frutos son bayas esféricas, globosas o levemente achatadas, con un diámetro comprendido entre 4 a 8 cm y un peso entre 80 a 100 g, de color amarillo intenso, amarillo rojizo o naranja en la madurez y cubiertos de una suave y tupida pilosidad; la pulpa es verdosa y de sabor agridulce; y las semillas son dicotiledóneas, lisas y redondas de 2 a 3 mm de diámetro de color blanquecino cremoso (ASOHOFRUCOL, 2012; FAO, 2006; Heiser y Anderson, 1999, p. 381; INEN, 2009, p. 1; Revelo et al., 2010, pp. 24-27). En la Figura 1.1, se muestra la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009. Figura 1.1. Naranjilla de jugo (Solanum quitoense Lam.), variedad INIAP Quitoense-2009 La naranjilla es originaria de los bosques húmedos subtropicales de Ecuador, Colombia y Perú, localizados a lo largo de la Cordillera de los Andes, a una altura comprendida entre los 1 200 y 2 500 msnm (Angulo, 2006, p. 7; FAO, 2006). La diversidad primaria de esta solanácea se encuentra distribuida en Colombia, Ecuador y Perú, con presencia de taxones relacionados en Venezuela, Centro América, Brasil y una especie en Asia (Heiser y Anderson, 1999, p. 381; Lobo, 2006, p. 46). 3 1.1.2 VARIEDADES En general se distinguen dos variedades principales de naranjilla; la Solanum quitoense Lam. var. quitoense que no posee espinas, y la Solanum quitoense Lam. var. septentrionale o espinosa (Angulo, 2006, p. 12; Medina, Sanchéz, Camayo, Lobo, y Martínez, 2008, p. 5). En el Ecuador se cultivan y comercializan las siguientes variedades de naranjilla e híbridos: 1.1.2.1 Variedades comunes tradicionales En nuestro país se cultivan las variedades: agria, Baeza dulce y espinosa; estas tienen gran aceptabilidad en el mercado, sin embargo la superficie cultivada es únicamente del 5 % de un total de 9 450 ha cultivadas; debido a la susceptibilidad al ataque de enfermedad y plagas, tales como; el nemátodo del nudo de la raíz, perforadores del tallo y fruto y a la marchitez vascular. La naranjilla común tiene una importante acogida en el mercado local por su calidad, y se considera una fruta promisoria en el mercado internacional, pero los altos costos de producción, la reducida oferta y los altos niveles residuales de pesticidas en la fruta, reducen el consumo interno y las posibilidades de exportación como fruta fresca (Revelo et al., 2010, pp. 27, 28). 1.1.2.2 Naranjilla de jugo mejorada Ante la problemática de la naranjilla común, el Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias INIAP, dentro de su Programa de Fruticultura desarrolló un plan de mejoramiento de la naranjilla, y purificó mediante varios ensayos realizados entre los años 2008 y 2009 una nueva variedad de naranjilla de jugo, denominada como INIAP Quitoense-2009, misma que proviene de una selección de la variedad Baeza. Esta nueva variedad de naranjilla es más 4 resistente al ataque de enfermedades y plagas; sus plantas alcanzan alturas de hasta 2 m, con tallos y hojas sin espinas, frutos redondos de buen tamaño y pulpa verde con bajos niveles oxidativos. Además presenta alta productividad y buenas características de calidad que le hace muy apetecida para el consumo en fresco e industrializado (Revelo et al., 2010, p. 28). 1.1.2.3 Híbridos comerciales Revelo et al. (2010) indican que en el Ecuador se cultivan y comercializan los híbridos: Puyo, Palora y Mera (pp. 29, 30). - Híbrido Puyo; proveniente del cruzamiento entre la naranjilla común variedad “agria” y la naranjilla jíbara del Oriente o cocona. Se estima que alrededor del 50 % de la producción nacional corresponde a este híbrido. - Híbrido Palora; resultado del cruzamiento entre la naranjilla común variedad Baeza roja y la variedad cocona Yantzaza. Aproximadamente el 40 % de la superficie cultivada pertenece a este híbrido. - Híbrido Mera o espinuda; posee características similares al híbrido Palora, pero es susceptible a marchitez vascular. Este híbrido se cultiva principalmente en la región Amazónica con un 93 % de la producción nacional. 1.1.3 CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS Y NUTRICIONALES La naranjilla posee un importante contenido de vitamina C, hierro, fosforo, vitamina A, potasio y calcio (FAO, 2006). En la Tabla 1.2 se detalla la composición nutricional promedio en 100 g de pulpa de naranjilla y en la Tabla 1.3 se especifica la composición química y nutricional de las variedades comerciales de naranjilla en el Ecuador. 5 Tabla 1.2. Composición nutricional de la naranjilla Componente Promedio en 100 g de pulpa Valor energético (cal) 28,0 Humedad (%) 91,6 Carbohidratos (g) 6,8 Proteína (g) 0,7 Fibra (g) 0,4 Ceniza (g) 0,6 Grasa (g) 0,1 Vitamina A (mg) 50,0 Ácido ascórbico (mg) 65,0 Tiamina (mg) 0,6 Niacina (mg) 1,5 Calcio (mg) 8,0 Fósforo (mg) 14,0 Hierro (mg) 0,4 (Cálix y Duarte, 2007, p. 33) Tabla 1.3. Composición química y nutricional de las variedades comerciales de naranjilla en el Ecuador Característica Variedad Híbrido Palora Híbrido Puyo Agria Humedad (%) 91,62 90,18 85,90 Ceniza (%) 0,52 0,51 0,82 Proteínas (%) 0,41 0,66 1,31 Fibra (%) 1,22 1,69 3,25 Acidez (%) 2,22 1,56 0,95 Alcaloides (%) 0,05 0,05 0,05 Sólidos solubles (%) 5,70 5,00 6,00 Sólidos totales (%) 8,93 14,12 9,82 Azucares totales (%) 1,93 2,83 2,19 Vitamina C (mg/100g) N/D 83,50 3,70 (Revelo et al., 2010, p. 38) 6 A continuación se detallan las propiedades fisicoquímicas de la naranjilla de jugo mejorada, INIAP Quitoense-2009. Tabla 1.4. Composición fisicoquímica de la naranjilla de jugo mejorada, INIAP Quitoense-2009 Característica Promedio Peso del fruto (g) 109,50 Largo del fruto (cm) 58,60 Díametro (cm) 55,60 Pulpa (%) 58,80 Corteza (%) 24,70 Semilla (%) 16,40 pH 2,72 Acidez Titulable (% ácido cítrico) 2,51 Sólidos soluble (oBrix) 9,60 Color de pulpa Verde (Revelo et al., 2010, p. 39) 1.1.4 USOS Y BENEFICIOS Los frutos de la naranjilla se pueden consumir en fresco o procesados; y son principalmente utilizados para la elaboración de pulpas, néctares, jugos, helados, mermeladas, conservas, salsas y postres (Bone, Coronel, y Ramírez, 2001, p. 61; Lim, 2013, p. 420). En la cocina Ecuatoriana la naranjilla es usada como ingrediente exótico en la preparación de salsas de platos gourmet, ensaladas de frutas y vegetales y también como decoración (Revelo et al., 2010, p. 98). En Colombia en Cauca y Valle, un plato conocido como “champús” es preparado fundamentalmente con jugo de naranjilla poco fermentado (Angulo, 2006, p. 13). La naranjilla a nivel mundial poseen gran aceptación por considerarse una fruta exótica, de sabor y aroma agradables (FAO, 2006). 7 La naranjilla tiene un alto contenido de vitamina C, inclusive mayor que el de los cítricos comunes, su consumo evita la anemia gracias a la fijación del hierro en el cuerpo, previene enfermedades respiratorias y además tiene propiedades antioxidantes (Revelo et al., 2010, p. 39). El importante contenido de hierro en la naranjilla, le atribuye propiedades tonificantes y diuréticas; el jugo de naranjilla ayuda a disolver ciertas toxinas del organismo y también facilita la eliminación del ácido úrico en la sangre (Angulo, 2006, p. 13; FAO, 2006). El fósforo y vitamina A presente en la naranjilla, favorece la formación de uñas, huesos y cabello. El fruto de naranjilla es refrescante, concilia el sueño, alivia enfermedades nervisosas, mejora los casos de arteriosclerosis y también regula la hipertensión (Tamayo, Bernal, Hincapié, y Londoño, 2001, p. 1). 1.1.5 FISIOLOGÍA DE LOS FRUTOS Los frutos de naranjilla al cosecharse y separarse de la planta continúan con sus procesos metabólicos (respiran, transpiran, maduran), hasta que se deterioran o envejecen en la senescencia. La fruta luego de ser cosechada vive a expensas de la cantidad de nutrientes que haya acumulado durante las etapas de formación, crecimiento y desarrollo de la planta; es por tanto que su vida útil depende directamente de la reservas alimenticias propias de la fruta (Garcia y Garcia, 2001, p. 15). 1.1.5.1 Respiración La respiración no es más que una serie de reacciones catalizadas por enzimas, en donde las reservas alimenticias de la fruta (azucares, almidones, ácidos orgánicos, etc.), son oxidadas en presencia de oxigeno (O2) y consecuentemente se tiene la producción de agua (H2O), dióxido de carbono (CO2) y la liberación de energía, la que puede ser almacenada en las moléculas adenosín trifosfato (ATP) o bien se libera en forma de calor. La producción de energía permite el desarrollo 8 de las actividades fisiológicas necesarias para que la fruta pueda vivir después de ser cosechada (Astiasarán y Martínez, 2000, pp. 196, 197; Paull y Duarte, 2010, p. 104). La tasa de respiración es un índice de la vida útil de las frutas, que expresa la cantidad de CO2 que un kilogramo de fruta produce en una hora, debido al proceso de respiración, e indica la rapidez con la cual son gastadas las reservas alimenticias de la fruta. La naranjilla recolectada en estado pintón (75 % de coloración amarilla) tiene una tasa de respiración de 56,5 mg CO2/kg-h a 20 °C (Garcia y Garcia, 2001, pp. 17, 81). Según la intensidad de respiración y la producción de etileno durante la maduración organoléptica, se distinguen dos tipos de frutas, las climatéricas y las no climatéricas. Los procesos fisiológicos de respiración, producción de etileno y el desarrollo de características organolépticas (salor, color, aroma, textura) se intensifican en los frutos climatéricos; mientras que en los no climatéricos, lo niveles de respiración y producción de etileno son bajos y los frutos maduran organolépticamente en la planta (Arias y Toledo, 2000, pp. 12, 13; Ulloa, 2007, pp. 36-38). La naranjilla es una fruta climatérica por lo cual debe cosecharse en madurez fisiología (fruto pintón) para que alcance su madurez comercial durante la poscosecha (FAO, 2006). 1.1.5.2 Transpiración El agua es el principal componente de las frutas (80% a 95%); después de su recolección, estas pierden agua en estado de vapor a través del área expuesta al ambiente, dándose así el proceso de transpiración. Cuando la presión de vapor del medio circundante es menor que la de la fruta, se produce la transferencia de agua desde la fruta hacia el medio, ocasionado deshidratación y pérdida de peso. Estos efectos se traducen en el deterioro de la calidad de la fruta y decremento de su valor comercial (Fennema, 2000, p. 1122). 9 1.1.6 MANEJO POSCOSECHA La poscosecha es el periodo comprendido entre la cosecha y la llegada de la fruta al consumidor final, ya sea como fruta fresca o como producto procesado. Un adecuado manejo poscosecha de la fruta, requiere un vasto conocimiento de sus características físicas y además de las técnicas de recolección, selección y limpieza, almacenamiento, empaque y transporte del producto hasta que llega al consumidor final (Reina, Araujo, y Manrique, 1998, p. 13). La norma técnica ecuatoriana NTE INEN 2303:2009 establece los requisitos específicos que debe cumplir la naranjilla para su consumo en fresco (INEN, 2009, p. 3). Los frutos de naranjilla deben poseer las siguientes características físicas: - Frutos enteros. - Tener la forma característica de la naranjilla. - Presentar la base del pedúnculo (cáliz). - Frutos sanos (libres de ataques de plagas y/o enfermedades, que demeriten la calidad interna del fruto). - Estar libres de humedad externa anormal producida por mal manejo en las etapas poscosecha (recolección, acopio, selección, clasificación, adecuación, empaque, almacenamiento y transporte). - Estar exentos de cualquier olor y/o sabor extraño (provenientes de otros productos, empaques o recipientes y/o agroquímicos, con los cuales hayan estado en contacto). - Presentar aspecto fresco y consistencia firme. - Estar exentos de materiales extraños (tierra, polvo, agroquímicos y cuerpos extraños) visibles en el producto o en su empaque. El correcto manejo poscosecha de la naranjilla está dado por la realización acertada de las siguientes operaciones: 10 1.1.6.1 Recolección o cosecha La cosecha de naranjilla se inicia entre los 8 y 9 meses luego del trasplante; sin embargo se alcanza su máxima producción después de los 12 meses de edad; la producción de la fruta es permanente y su recolección se realiza en lapsos de 8 a 15 días en función de la demanda del mercado. La naranjilla se cosecha en estado pintón (3/4 madurez, 75% de color anaranjado). La forma de cosecha y el índice de madurez influyen en el tiempo de vida útil de los frutos (Revelo et al., 2010, pp. 38, 96). La recolección de las frutas se realiza en forma manual con el uso de guantes y tijeras para conservar el pedúnculo y el cáliz; esto evita la deshidratación y el ataque de microorganismo y hongos en el punto de abscisión. Además es aconsejable utilizar recipientes poco profundos y reducir la excesiva manipulación a fin de disminuir los daños mecánicos (golpes, magulladuras, etc.). La cosecha se inicia en horas de la mañana con buena luminosidad, bajas temperaturas y humedades relativas altas (sin condensación), y se recolectan los frutos en estados de madurez homogéneos según la tabla de color mostrada en el Anexo I (Garcia y Garcia, 2001, pp. 39, 81) 1.1.6.2 Selección y Clasificación La selección es la primera operación de la poscosecha cuyo objetivo es separar los frutos idóneos para la comercialización y desechar las frutas descompuestas, enfermas o con residuos de pesticidas. La clasificación de la naranjilla se realiza generalmente por calibre y por color (Paull y Duarte, 2012, p. 351). Según la norma técnica ecuatoriana NTE INEN 2303:2009, el calibre de la naranjilla se determina en función del diámetro de la sección ecuatorial de la fruta, la longitud y la masa. En la Tabla 1.5 se muestra la clasificación de la naranjilla en función de su calibre. 11 Tabla 1.5. Clasificación de la naranjilla en función del calibre Calibre Masa (g) Diámetro ecuatorial (mm) Longitud (mm) Naranjilla Hibrido Puyo Grande > 80 > 50 > 47 Mediana 80 - 50 45 - 50 47 - 43 Pequeña < 50 < 45 < 43 Naranjilla de jugo Grande > 130 > 68 > 55 Mediana 130 - 80 60 - 68 55 - 45 Pequeña < 80 < 60 < 45 (INEN, 2009, p. 2) Independientemente del tamaño y color, la clasificación de la naranjilla admite tres grados con sus respectivas tolerancias, y que se detallan en la Tabla 1.6. Tabla 1.6. Clasificación de la naranjilla en función de su categoría Categoría Características Tolerancia Grado Extra La naranjilla debe tener buenas características físicas; su calibre y color deben ser característicos de la variedad. No deben tener defectos superficiales, únicamente defectos leves que no afecten su calidad global y su estado de conservación. Máximo 5% en número o en peso de naranjilla que no corresponda a los requisitos de este grado. Grado I Los frutos deben tener el color y la forma característicos de la variedad; pudiéndose aceptar los siguientes defecto leves que no afecte la calidad global de la naranjilla; estos son: - Defectos leves de forma (alargamientos o deformaciones); - Defectos leves de color provocados por el sombreamiento producido por el contacto entre los frutos en el arbusto y cicatrices superficiales ocasionadas por plagas. Estos defectos no deber ser más del 5% del área total del fruto. Máximo 10% en número o en peso de naranjilla que no corresponda a los requisitos de esta categoría. 12 Tabla 1.6. Clasificación de la naranjilla en función de su categoría (continuación…) Grado II Comprenden las naranjilla que no pueden clasificarse en los grados anteriores, pero que se halla en buen estado. Se admiten los siguientes defectos leves: - Defectos leves de forma (alargamientos o deformaciones); - Defectos leves de color provocados por el sombreamiento producido por el contacto entre los frutos en el arbusto y cicatrices superficiales ocasionadas por plagas. Estos defectos no deber ser más del 10% del área total del fruto. Se admite hasta el 10% en número o en peso de los frutos que no cumplan los requisitos de esta grado, ni los requisitos generales, con excepción de las productos con daños mecánicos severos. (INEN, 2009, pp. 2, 3) 1.1.6.3 Pre enfriamiento Esta operación se puede realizar ya sea por inmersión en agua limpia y fría (4 °C), o corriente durante 15 a 30 min. Luego es necesario escurrir y dejar secar a la sombra las frutas a fin de evitar el ataque por hongos y el recalentamiento de las mismas. El pre enfriamiento es necesario cuando la fruta se cosecha madura o sobremadura y también cuando va a ser transportada por largos trayectos. La recolección a primeras horas de la mañana puede reducir la requerimiento del pre enfriamiento, debido a que se tiene baja temperatura y humedad relativa alta, con lo cual se evita también la deshidratación de la naranjilla (Garcia y Garcia, 2001, pp. 43, 86; Kitinoja y Kader, 2003) 1.1.6.4 Limpieza y Desinfección La limpieza de la naranjilla se realiza con el objetivo de remover impurezas visibles (polvo, residuos agroquímicos, etc.) y pelusas de la superficie de la fruta; esta operación se hace con métodos en seco o en húmedo. La limpieza en húmedo se lleva a cabo mediante operaciones como el tamizado y la abrasión 13 con el respectivo uso de zarandas y costales; en los dos casos se usan aproximadamente 8 kg de fruta y mediante movimientos longitudinales y laterales se desprenden la pelusas de la superficie de la fruta, durante este proceso se debe cuidar de no provocar daño mecánico por golpes con la zaranda o maltrato brusco en el costal; mientras que la limpieza en húmedo se hace por inmersión o aspersión; aquí la fruta se frota con un cepillo giratorio o se hace frotar las naranjillas entre sí con el uso de chorros de agua (Cálix y Duarte, 2007, p. 28). La desinfección de naranjilla se hace por inmersión de los frutos en una solución de tego 51 al 1% y tiabendazol a 1 500 ppm, o en una solución de hipoclorito de sodio de 50 ppm; que se lleva a cabo durante un tiempo de 10 a 15 minutos y posteriormente se enjuaga. Este proceso permite disminuir la carga microbiana y mitigar el ataque de hongos y bacterias (FAO, 2006; Garcia y Garcia, 2001, p. 85). 1.1.6.5 Secado y encerado Luego de la limpieza y desinfección es imprescindible que se remueva el agua superficial de la naranjilla. Esta operación se realiza con aire forzado y preferiblemente con aire caliente a 40 °C; los frutos se colocan en bandejas o en la mismas canastilla en un máximo de dos capas y se hace circular el aire con un ventilador (Garcia y Garcia, 2001, p. 85). Con el encerado se restablece la cera natural de la corteza que se pierde en las operaciones anteriores, además permite mejorar la apariencia visual de los frutos. La formulación y concentración de la cera al igual que su fluidez debe ser probada antes de aplicarse al producto final (FAO, 2006). 1.1.6.6 Empaque y transporte Existen diversos tipos de empaques, entre ellos: cajas de madera, costales de fique, cajas plásticas y de cartón. En Ecuador se empaca normalmente la fruta en 14 cajas de madera de 17 a 20 kg para los mercados mayoristas, en cajas plásticas de 30 kg para los supermercados y en fundas plásticas de 2,0 a 2,5 lb para el consumidor final (Revelo et al., 2010, p. 97). Las canastillas plásticas son recomendadas para el transporte de naranjilla puesto que facilita el estibaje y manejo y además son reutilizables (Garcia y Garcia, 2001, p. 86). El transporte comprende el desplazamiento de la fruta desde la zona de cultivo hacia los canales de distribución y comercialización. La fruta debe transportarse sola, sin productos que puedan contaminarla. El transporte de preferencia se realiza a primeras horas de la mañana y en vehículos con carpa, previamente lavados y desinfectados. El estibaje se hace a una altura máxima de 1,5 m para evitar daños de la fruta y el empaque (FAO, 2006). 1.1.6.7 Almacenamiento El almacenamiento de naranjilla depende directamente del estado de madurez en el cual se haya recolectado, puesto que es una fruta climatérica y sus procesos metabólicos continúan en forma rápida luego de la cosecha; sin embargo, estudios de poscosecha recomiendan almacenar naranjilla cosechada en estado pintón (3/4 madurez, 75% de color amarillo) a 8 °C y 90 % de humedad relativa (Revelo et al., 2010, p. 98; Thompson, 2008, p. 278). 1.1.7 ESTADÍSTICAS DE PRODUCCIÓN Y EXPORTACIÓN En Ecuador se cultiva y produce naranjilla a nivel comercial en la región amazónica especialmente en las provincias de Pastaza, Napo y Morona Santiago; y en menor escala en Sucumbíos, Orellana y Zamora Chinchipe. También se hallan cultivos en las provincias de Tungurahua, Pichincha, Imbabura, Cotopaxi, Chimborazo, Carchi y Santo Domingo de los Tsáchilas (Revelo et al., 2010, pp. 12-22). 15 Según el III Censo Agropecuario Nacional realizado por el Instituto Nacional de Estadística y Censos (INEC), para el año 2000 la superficie total sembrada fue de 9 459 ha, con una producción de 16 014 t y un rendimiento de 2,73 t/ha. En la Figura 1.2 se presenta el comportamiento de la producción de naranjilla a nivel nacional desde el año 2000 al 2010. 25000 Producción (t) 20000 15000 10000 5000 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Año Figura 1.2. Producción de naranjilla a nivel nacional (SINAGAP, 2014) Los principales países de destino de la naranjilla ecuatoriana son: Estados Unidos y España; sin embargo también se registran exportaciones en menores cantidades a: Holanda (países bajos), Emiratos Árabes Unidos, Suiza, Francia, Italia, Alemania, Canadá, Bélgica, Rusia, Singapur y Azerbaidjan, tal como se aprecia en la Tabla 1.7. Para el año 2013 el total de exportaciones de naranjilla fue de 7,15 t, mientras que para el año 2014 fue de 17,42 t, lo cual implicó un incremento en las exportaciones en más del 100% (BCE, 2015). 16 Tabla 1.7. Total de exportaciones de naranjilla ecuatoriana por país de destino, para los años 2013 y 2014 Año 2013 País de destino Total exportaciones (t) España 2,73 Estados Unidos 3,89 Emiratos Árabes Unidos 0,30 Francia 0,09 Holanda (Países Bajos) 0,05 Italia 0,08 Suiza 0,02 Alemania 0,01 Canadá 0,01 Bélgica 0,01 Total (t) 7,15 Año 2014 País de destino Total exportaciones (t) España 5,41 Estados Unidos 11,44 Holanda (Países Bajos) 0,34 Rusia 0,12 Singapur 0,07 Azerbaijan 0,06 Total (t) (BCE, 2015) 17,42 17 1.2 PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO EN FRUTOS FRESCOS 1.2.1 PARDEAMIENTO POR POLIFENOLOXIDASA (PPO) El pardeamiento enzimático es un proceso oxidativo que genera importantes cambios en las características físicas, químicas y nutricionales de los productos hortofrutícolas. La presencia de este fenómeno en los frutos frescos, se debe ya sea a procesos fisiológicos desarrollados en la maduración o bien a operaciones tecnológicas equivocas, realizadas durante la recolección y la poscosecha de los mismos. Un efecto directo del pardeamiento enzimático a parte de la pérdida de la calidad del color; es la reducción de la aceptabilidad en el consumidor (Damodaran, Parkin, y Fennema, 2010, p. 407; Simpson, 2012, p. 56). Las reacciones del pardeamiento enzimático, en general, conducen a cambios indeseados en la textura, sabor y valor nutricional de las frutas, que disminuyen su calidad y vida útil; y originan además pérdidas económicas. Se estima que alrededor de un 50 % de pérdidas en algunas frutas tropicales se producen como resultado de estas reacciones (González et al., 2005, p. 290; Lozano, 2006, p. 163; Yildiz, 2009, pp. 342, 343). Las enzimas relacionadas con el pardeamiento enzimático reciben los nombres de polifenoloxidasas, fenoloxidasas, tirosinasas, cresolasa o catecolasas denominadas en forma general como fenolasas; las que se hallan ampliamente distribuidas en las frutas. Estas enzimas se caracterizan por tener la misma estructura del centro activo, conformado por un núcleo de dos átomos de cobre. Las fenolasas pertenecen al grupo de las oxidorreductasas y están conformadas por la monofenol monooxigenasa (EC 1.14.18.1) y la catecol oxidasa (EC 1.10.3.1) (Damodaran et al., 2010, p. 405; Yildiz, 2009, p. 322). Los compuestos químicos insaturados con estructuras de monofenoles, ortodifenoles y polifenoles son los sustratos naturales más comunes de las polifenoloxidas; entre ellos: catecol, tirosina, ácido cafeico, ácido protocatéquico, ácido gálico, ácido clorogénico, dopamina, flavonoles, entre otros. En la Figura 1.3 18 se muestra la estructura de algunos sustratos que se caracterizan por contener un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo junto con un número determinado de otros sustituyentes (Badui, 2013, pp. 322, 324; Bello, 2008, pp. 323-325; Damodaran et al., 2010, pp. 407, 408; González et al., 2005, p. 157; Simpson, 2012, pp. 58, 59). O OH OH HOOC OH HO NH2 HO HO OH COOH HO Ácido protocatéquico Ácido cafeico Tirosina Catecol HO OH OH HO OH OH HO O HC CH C O COOH Ácido gálico O CH2 CH2 NH2 C OH Dopamina HO OH HO Ácido clorogénico Figura 1.3. Principales sustratos fenólicos de la polifenoloxidasa presente en los productos hortofrutícolas La polifenoloxidasa (PPO) y los sustratos fenólicos de hallan en compartimientos celulares autónomos y separados dentro del tejido vegetal, es por eso que en frutas sanas no tienen lugar los procesos oxidativos; por lo contrario cuando las frutas son peladas, cortadas, golpeadas o sufren algún tipo de infección; las polifenoloxidasas entran en contacto con los sustratos fenólicos y en presencia del oxígeno del aire producen la oxidación enzimática de los compuestos fenólicos a orto-quinonas, que rápidamente se polimerizan y forman melaninas con pigmentaciones pardas. Al parecer la polimerización de estos compuestos ayuda a la cicatrización de heridas provocadas por patógenos invasores; y sirve por tanto como medio de defensa de las plantas (Astiasarán y Martínez, 2000, p. 205; De la Rosa et al., 2010, p. 110; González et al., 2005, p. 156; Simpson, 2012, p. 51). 19 1.2.2 MODO DE ACCIÓN DE LAS POLIFENOLOXIDASAS Las polifenoloxidasas habitualmente catalizan dos tipos de reacciones a través de las cuales se inicia el pardeamiento enzimático; estas se muestran a continuación: OH OH OH + O2 + + 2H PPO + R R OH O OH H2 O [1.1] O + 1/2O2 PPO + H2 O R [1.2] La primera reacción constituye la actividad fenol hidroxilasa o cresolasa, que hidroxila los sustratos fenólicos en posición orto y produce fenoles ortohidroxilados o difenoles; mientras que la segunda es la base de la actividad polifenoloxidasa o catecolasa, que oxida los difenoles producidos y los convierte en ortoquinonas; esta últimas son altamente reactivas y se polimerizan no enzimáticamente para producir macromoléculas de estructura química compleja denominadas como melaninas, las cuales originan pigmentos de color marrón rojizo o pardos y además son las responsables de la pérdida de calidad visual y nutricional de las frutas (Badui, 2013, p. 323; Damodaran et al., 2010, p. 405; González et al., 2005, pp. 156, 157; Simpson, 2012, p. 57). En la Figura 1.4 se presenta el mecanismo de reacción simplificado, mediante el cual las polifenoloxidasa catalizan las reacciones del pardeamiento enzimático. 20 PPO OH PPO OH OH O2 O 1/2O2 O Melaninas H2O Actividad cresolasa R R Monofenol o-Difenol Polimerización R o-Quinona Actividad catecolasa Reacciones de la actividad cresolasa proteína-Cu 2 proteína-Cu 2 + + O2 proteína-Cu 2 + O2 + monofenol + 2H proteína-Cu 2 +2 proteína-Cu 2 - +2 proteína-Cu 2 + 2e O2 + o-Difenol + H2O + Reacciones generales de la actividad catecolasa +2 proteína-(Cu 2 )n + ne + proteína-(Cu 2 )n + O2 + proteína-(Cu )n O2 activación +2e o-Difenol - +2e Monofenol o-Difenol - o-Difenol o-Quinona o-Quinona + proteína-(Cu )nO + OH n=2 cuando predomina la actividad cresolasa n=1 cuando predomina la actividad cresolasa Figura 1.4. Mecanismo simplificado de la acción de las polifenoloxidasas (Simpson, 2012, p. 58) - 21 1.2.3 FACTORES MEDIOAMBIENTALES RELACIONADOS CON LA ACCIÓN ENZIMÁTICA El proceso de pardeamiento enzimático está limitado por varios factores, dentro de los que se enfatizan el pH del medio de reacción, la temperatura, la concentración del sustrato y de la enzima y la disponibilidad de agua; estos factores tienen influencia directa sobre la actividad enzimática (Badui, 2013, pp. 285-290; Laurila, Kervinen, y Ahvenainen, 1998, p. 54). La actividad de PPO depende del pH, ya que la concentración de iones hidronio afecta el grado de ionización de los aminoácidos de la enzima, del sitio activo, del sustrato o del complejo enzima-sustrato y además influye en la estructura tridimensional de la enzima y por ende la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. La PPO presenta pH estrechos de actividad óptima, generalmente de entre 5 y 7; y se desactiva a pH menores a 3 (Badui, 2013, p. 285; Battaner, 2013, p. 155). En forma general la velocidad de toda reacción e incluso de las enzimáticas incrementa con la temperatura al aumentar la energía cinética de las moléculas; sin embargo, incrementos excesivos en la temperatura favorecen la desnaturalización progresiva de las enzimas y con ello la pérdida su capacidad catalítica. La temperatura sobre la actividad enzimática tiene efectos de activación e inactivación; definiéndose el óptimo de temperatura como aquel donde la velocidad de reacción es máxima. La mayoría de las enzimas tienen una temperatura óptima de entre 30 y 45 °C y a temperaturas superiores a los 60 °C se desnaturalizan (Badui, 2013, p. 287; Damodaran et al., 2010, pp. 387, 388). Las enzimas actúan de forma más eficiente si la concentración del sustrato está en exceso con relación a la concentración de la enzima, esto ya que bajo estas circunstancias existe mayor probabilidad de colisiones entre las moléculas de la enzima y el sustrato (Badui, 2013, p. 289; Battaner, 2013, pp. 135-140). 22 La disponibilidad de agua afecta a la velocidad de las reacciones enzimáticas ya que está, actúa como medio de difusión, y dilución o concentración de solutos; proporciona estabilidad y plasticidad a las proteínas; y además funciona como cosustrato en las reacciones hidrolíticas. Es por tanto que el control de la disponibilidad de agua afecta a la actividad y estabilidad de las enzimas (Damodaran et al., 2010, p. 397). 1.2.4 FACTORES PRECOSECHA Y POSCOSECHA QUE AFECTA AL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO Son varios los parámetros precosecha que influyen en el desarrollo del pardeamiento enzimático de las frutas; entre ellos: las prácticas agrícolas, el tipo suelo, la fertilización, las condiciones climáticas y la forma de cosecha. Excesos en la cantidad de agua y de nitrógeno, o una baja contribución de calcio implican una mayor susceptibilidad al pardeamiento y reducción del tiempo de vida útil (Garcia y Barrett, 2002, p. 4; González et al., 2005, p. 163). Durante la poscosecha y el procesamiento de las frutas y hortalizas, la intensidad del pardeamiento enzimático depende de factores como: la especie y variedad, la madurez, la naturaleza y contenido de sustratos fenólicos, la actividad de las enzimas endógenas, la disponibilidad de oxígeno y la compartimentalización de las enzimas y los sustratos. En frutos en crecimiento el contenido de sustratos fenólicos es más alto que en frutos maduros, por lo que la actividad enzimática en estos también es mayor (González et al., 2005, pp. 160, 163). 1.2.5 CONTROL DEL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO Para que las reacciones del pardeamiento enzimático se produzcan es necesario tres componentes: un enzima activa, un sustrato fenólico adecuado y disponibilidad de oxígeno; por lo cual si se limita o excluye alguno de estos tres 23 componentes se inhibe potencialmente los procesos enzimáticos del pardeamiento (Herrera, Bolaños, y Luts, 2003, p. 40). Badui (2013), Bello (2008) y Damodaran et al. (2010) señalan que el control del pardeamiento enzimático se lo puede realizar por métodos físico y químicos o una combinación de ambos (pp. 288, 331, 408). Entre ellos: tratamiento térmico, deshidratación, refrigeración y/o congelación, exclusión de oxígeno, tratamientos químicos y alternativamente la aplicación de radiaciones ionizantes Los tratamientos térmicos, la deshidratación y la refrigeración y/o la congelación son alternativas viables, siempre y cuando el tiempo para su aplicación no cause efectos adversos en las frutas o sus derivados; tales como pardeamientos intolerables, cambios en la textura y modificaciones en las características organolépticas, que alteren la calidad global del fruto. De forma general se conoce que las enzimas se inactivan a temperaturas de entre 70 a 90 °C en tiempos cortos, sin embargo; al calentar los frutos se producen cambios indeseables, por lo tanto el tratamiento térmico no siempre es recomendable. Con la refrigeración y/o congelación se retarda la velocidad de reacciones enzimáticas, sin embargo incluso en frutas congeladas pueden presentarse procesos oxidativos pero a velocidades muy bajas (Badui, 2013, pp. 288, 324; Herrera et al., 2003, p. 40; Hui et al., 2006, p. 60; Orrego, 2003, p. 255). La deshidratación es un método convencional de conservación de alimentos; cuyo objetivo principal es reducir la actividad de agua (aw) de las frutas, hasta valores críticos donde la actividad y estabilidad de las enzimas puedan verse afectadas. La disminución de forma controlada de la aw se realiza generalmente por deshidratación osmótica, que consiste en la inmersión de frutas enteras o cortadas en jarabes de maíz o soluciones concentradas de sacarosa; bajo estas condiciones se tiene dos flujos en contracorriente; un flujo de agua y solutos desde la fruta hacia el medio y otro flujo del medio a la fruta con una posible incorporación de agentes conservantes, antimicrobianos y antipardeamiento (Alzamora, Guerrero, Nieto, y Vidales, 2004, p. 11; Ibarz y Barbosa, 2005, pp. 621, 622). 24 La exclusión de oxígeno se realiza mediante el uso de recubrimientos o películas comestibles que limitan la disponibilidad de O2. La eliminación del O2 se la debe realizar hasta niveles tales en los que no se dé un metabolismo anaeróbico que conlleve a alteraciones de las propiedades organolépticas. Adicionalmente se puede emplear empaques en atmósferas modificas (MAP) que se utilizan principalmente para alimentos mínimamente procesados; este método busca reducir la tasa de respiración y las reacciones enzimáticas, al empacar los productos con bajas concentraciones de O2 y altas de CO2 (Bhat, Alias, y Paliyath, 2011, p. 51; Damodaran et al., 2010, p. 408; Merodio y Escribano, 2003, p. 196). Los tratamientos químicos son los más habituales dentro del estudio de la inhibición del pardeamiento enzimático; estos incluyen el uso de agentes reductores, acidulantes, inhibidores enzimáticos, agentes quelantes e inactivadores de la polifenoloxidasa (Damodaran et al., 2010, p. 408; Simpson, 2012, p. 60). Los agentes reductores como los sulfitos (se incluye el SO2, los bisulfitos y los metasulfitos), los tioles, el ácido ascórbico y la cisteína; actúan ya sea reduciendo las o-quinonas a difeonoles o bien, conjugando químicamente las o-quinonas retardando así su polimerización y consecuente formación de melaninas; sin embargo, su acción es limitada debido a que se consumen durante en el proceso inhibitorio. Otro efecto importante de estos agentes, es la inactivación completa de las polifenoloxidasas, debida a la reacción de los sulfitos con las o-quinonas que forman sulfoquinonas, las que inhiben irreversiblemente las PPO. El uso de los sulfitos en los alimentos es multipropósito, ya que actúan como agentes antimicrobianos e inhibidores enzimáticos y no enzimáticos, pero su uso se halla restringido por la FDA (Food and Drug Administration) porque genera efectos adversos sobre la salud. Además, la adición de sulfitos está limitada a 500 ppm puesto que promueven sabores desagradables (Bello, 2008, pp. 331, 332; Cameán y Repetto, 2012, pp. 472-473; Damodaran et al., 2010, pp. 408-410; De la Rosa et al., 2010, p. 209; González et al., 2005, pp. 292, 293). 25 La adición de acidulantes tales como el ácido cítrico, málico, ascórbico o fosfórico; inhibe el pardeamiento enzimático gracias a que se reduce el pH óptimo de acción de las polifenoloxidasas (pHൎ7). Mejores resultados se obtiene mediante la adición de ácido ascórbico puesto que como ya se explicó, tiene además capacidad reductora. A pH menores a 3 se inhibe completamente la acción de las fenolasas, sin embargo es poco práctico alcanzar este pH, debido a que bajo estas condiciones se alteran las propiedades sensoriales y la calidad de las frutas (Badui, 2013, p. 325; Hui et al., 2006, p. 79; Simpson, 2012, pp. 60-62). Los inhibidores enzimáticos análogos a los sustratos naturales, ocupan competitivamente el sitio de los compuesto fenólicos con lo cual inhibe la actividad de las polifenoloxidasas; entre estos se tiene: el ácido cinámico, p-cumárico, ferúlico y benzoico. Otros inhibidores como las sales de haluros, el cianuro, el monóxido de carbono y ciertos reactivos tiólicos, se coordinan al sitio activo de la polifenoloxidasa inhibiendo competitivamente su actividad. Inhibidores como la tropolona y el 4-hexilresorcinol, también se asemejan a los sustratos nativos y se coordinan vigorosamente con el cobre del sitio activo; sin embargo su uso aún no está regulado para alimentos. El 4-hexilresorcinol es efectivo a bajas concentraciones, no blanquea los pigmentos y es estable químicamente; pero no inhibe completamente el pardeamiento, por lo que se emplea en combinación con ácido ascórbico incrementado así su efectividad. Otro inhibidor potencial es el ácido kójico que se identificó en cultivos de Aspergillus y Penicillium spp, este se coordina con el centro activo de la polifenoloxidasa, su uso está limitado a productos fermentados con estos organismos (Damodaran et al., 2010, pp. 408410; González et al., 2005, pp. 165, 300). Los agentes quelantes como el etilendiamino tetraacético (EDTA), los ácidos oxálicos y los cítricos incluidos los zumos de estos ácidos, se coordinan con el cobre del sito activo de la polifenoloxidasa y ocasionalmente eliminan el cobre. El EDTA es además, un agente acomplejante con eficaz acción sobre la inhibición enzimática de varias frutas y hortalizas que tiene la ventaja de no conferir sabor al alimento (Damodaran et al., 2010, p. 408; González et al., 2005, p. 299; Laurila et al., 1998, p. 55). 26 Comúnmente, el control eficaz del pardeamiento enzimático se logra mediante una combinación de agentes antipardeamiento. Una combinación típica consiste de un agente químico tal como el ácido ascórbico, un acidulante, tal como ácido cítrico, y el agente quelante como EDTA (Simpson, 2012, p. 60). Las enzimas pueden ser inactivadas por la exposición a las radiaciones ionizantes (rayos gamma y electrones acelerados), sin embargo las dosis requeridas para este efecto, son al menos 10 veces mayor que las necesarias para la eliminación de microorganismos. Las actividades enzimáticas residuales luego de la aplicación de radiaciones ionizantes, pueden poner en riesgo las propiedades organolépticas y el valor nutritivo del alimento. Por otro lado, la aplicación de irradiación puede provocar cambios bioquímicos indeseables. De hecho, el pardeamiento enzimático puede agravarse por los tratamientos de irradiación, puesto que puede alterar la permeabilidad de los compartimientos celulares favoreciendo el contacto entre la polifenoloxidasa y sus sustratos. De forma general se conoce que el control del pardeamiento enzimático por irradiación está condicionado por la clase y concentración de enzima que se desee inactivar, la actividad de agua, la pureza del extracto enzimático empleado, la relación de los efectos in vitro (enzimas purificadas) frente a los in situ (sistemas alimentarios), la disponibilidad de oxígeno, el pH y la temperatura (Fennema, 2000, p. 582; Garcia y Barrett, 2002, p. 16). En varias ocasiones es aconsejable aplicar tratamientos combinados para control del pardeamiento enzimático. Por ejemplo, utilizar un tratamiento térmico moderado para inactivar las enzimas, seguido por irradiación para esterilizar; o también refrigeración de las frutas luego de ser irradiadas. Estas estrategias tienen efectos sinérgicos sobre la eficacia de la inhibición del pardeamiento enzimático en los frutos frescos (Fennema, 2000, p. 583). 27 1.3 IRRADIACIÓN DE FRUTAS 1.3.1 GENERALIDADES La aplicación de radiaciones ionizantes (irradiación) a productos hortofrutícolas se realiza por varios propósitos, entre ellos: desinfestación de insectos, disminución de la carga microbiana, inhibición o retraso de los procesos de maduración y senescencia e inhibición de las reacciones enzimáticas. La irradiación de alimentos se considera también, como una pasteurización en frío cuyo objetivo es extender el tiempo de vida útil de los productos que se comercializan y consumen en fresco (Arvanitoyannis, 2010, p. 518; Bello, 2008, p. 450; Díaz, 2009, p. 324; Rahman y Ahmed, 2012, p. 967). Los rayos gamma (ߛ), rayos-X o un haz de electrones de alta energía (partículas ߚ), son los tipos de radiaciones ionizantes que potencialmente se usan para la conservación de alimentos (Brennan y Almudí, 2008, p. 149). Los rayos gamma y el haz de electrones de alta energía, son los más usados en aplicaciones alimenticias; diferenciándose entre ellos, por su capacidad de penetración y su poder de ionización; es así que, los rayos gamma son más penetrantes que los electrones acelerados, sin embargo estos últimos tienen mayor poder de ionización. Los rayos-X al igual que los rayos gamma tienen buena capacidad de penetración; sin embargo la conversión de electricidad a rayos-X es ineficiente y costosa por lo cual esta tecnología es la menos usada (Korkmaz y Polat, 2005, pp. 389-391; Tucker, 2008, pp. 236, 237). Las radiaciones ionizantes se caracterizan por tener la capacidad de producir ionización y excitación en los átomos del alimento tratado, pero su nivel de energía está restringido para que no interaccionen con el núcleo y no se induzca radioactividad; es así que los rayos-X se pueden emplear hasta una energía de 5 MeV; los electrones acelerados hasta una energía de 10 MeV; y los rayos gamma provenientes de fuentes de cobalto-60 producen dos ondas de radiación con energías comprendidas entre 1,17 y 1,33 Mev (Fan, 2010, pp. 427, 428; Ladaniya, 2008, p. 404). 28 1.3.2 VENTAJAS Y DESVENTAJAS Las ventajas de la irradiación de frutas y en general de los alimentos, son las siguientes: - Se considera un proceso en frío, por lo que se puede tratar alimentos envasados y congelados (Díaz, 2009, p. 320). - Los alimentos pueden ser irradiados luego del envasado, evitándose una contaminación ulterior (Roca y Almela, 2004, p. 28) - Los alimentos irradiados exhiben características organolépticas similares a los productos frescos (Bello, 2008, p. 456). - En las frutas, a dosis bajas (1 kGy) las pérdidas nutricionales son mínimas (Brennan y Almudí, 2008, p. 171). - Su aplicación no genera cambios químicos nocivos, por tanto es una alternativa de sustitución a los tratamientos químicos convencionales (Bello, 2008, p. 456; Casp y Abril, 2003, p. 485). - No deja ningún tipo de residuos en los alimentos. - La apariencia de las frutas no varía visiblemente. No todos los efectos de la irradiación son positivos, y se presentan algunos inconvenientes: - Ciertos frutos fresco presentan mayor radiosensibilidad que otros, y se pueden desarrollar modificaciones sensoriales inaceptables (Fellows, 2000, pp. 233, 234). - El elevado costo de la instalación, los aspectos de regulación y seguridad del proceso y limitada aceptabilidad del consumidor; hacen que la comercialización de alimentos irradiados sea aun restringida (Casp y Abril, 2003, p. 485). 29 1.3.3 EFECTOS Y OBJETIVOS Según Brennan y Almudí (2008) y Díaz (2009), el mecanismo de acción de la irradiación se desarrolla a través de tres etapas: la acción física primaria sobre los átomos; los cambios químicos provocados por la acción física; y los efectos biológicos sobre las células vivas de los alimentos (pp. 150, 323). Los electrones de alta energía inciden sobre los átomos, ocasionando un aumento de energía en los electrones orbitales; de esta forma estos electrones pueden ser o bien expulsados completamente, o bien movidos a orbitales de mayor energía; dando como resultado global la ionización y excitación de los átomos respectivamente. Los electrones acelerados ceden su energía dentro de pocos centímetros en la superficie del alimento por lo que el límite práctico de penetración en alimentos es de alrededor de 4 cm empleando su energía máxima autorizada (10 Mev). Los rayos gamma y los rayos-X en cambio; son considerados fotones y su interacción más relevante con los átomos y/o moléculas, es el efecto Compton. Los fotones inciden sobre los átomos expulsando electrones orbitales, cediendo parte de su energía y cambiando de dirección, de esta manera un fotón logra ocasionar varios efectos Compton y puede penetrar profundamente dentro del alimento. Los electrones expulsados con suficiente energía consiguen ocasionar más ionizaciones y excitaciones en los átomos vecinos. El resultado global de los efectos físicos es la formación de moléculas e iones excitados con cantidades anómalas de energía (Brennan y Almudí, 2008, pp. 150-153; Rahman y Ahmed, 2012, pp. 973, 974). La ruptura de los iones y moléculas excitadas y de su reacción con moléculas vecinas, desencadena una serie de reacciones químicas que conllevan a la formación de compuestos químicamente estables; a este proceso se denomina radiólisis y a los radicales resultantes, productos radiolíticos. En las frutas y vegetales los productos radiolíticos del agua que los conforma, toman vital importancia, ya que son los responsables de las alteraciones químicas de proteínas, carbohidratos, grasas, ácidos nucleicos y de los componentes minoritarios tales como las vitaminas. Estas alteraciones pueden deberse a los 30 efectos directos de la incidencia de las radiaciones y en caso de las soluciones acuosas, a los efectos de los productos radiolíticos del agua (Brennan y Almudí, 2008, p. 154; Díaz, 2009, pp. 323, 324). El objetivo principal de la irradiación es generar cambios en las células vivas de los agentes contaminantes como microorganismos, bacterias, insectos y parásitos; o en las células de frutas y vegetales frescos. Este objetivo se da por acción de los efectos biológicos de la irradiación, que ocasionan daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) de los contaminantes. Los cambios en la composición celular del ADN se facilitan ya sea por la acción directa de la radiación sobre el material genético; o por los efectos indirectos, a través de la producción de radicales libres, esencialmente de agua, que dañan el ADN (Bello, 2008, pp. 453, 454; Brennan y Almudí, 2008, p. 155; Fellows, 2000, p. 239; Tucker, 2008, p. 239). Los efectos de la irradiación sobre los componentes de los alimentos son importantes por su influencia en la calidad y el valor comercial. Los principales parámetros de calidad afectados por las radiaciones ionizantes son la apariencia, la textura, el sabor y los valores nutricionales. Los cambios en la calidad debido a la irradiación o almacenamiento son a menudo influenciados por actividades fisiológicas y enzimáticas en respuesta a las acciones ambientales (Sommers y Fan, 2013, pp. 271-284). Las enzimas son proteínas, y por lo tanto, todos los efectos de la irradiación sobre las proteínas también son aplicables a las enzimas. El efecto de la irradiación sobre las enzimas se puede medir por cambios en la actividad de la enzima, y en las frutas frescas, la irradiación a dosis bajas puede causar cambios en la actividad enzimática, debido principalmente a los cambios metabólicos (Sommers y Fan, 2013, p. 82) La irradiación de las proteínas resultan en desaminación, descarboxilación, reducción del enlace disulfuro, la oxidación de grupos sulfhidrilo, modificaciones de restos de aminoácidos, y la escisión (ruptura) del péptido de cadena y 31 agregaciones. Por lo tanto, el efecto directo de la irradiación sobre las enzimas es también la desaminación y descarboxilación, afectando así a la actividad enzimática; e indirectamente se afecta la integridad de las membranas celulares permitiendo que los sustratos entren en contacto con las enzimas previamente compartimentadas, dando paso a las reacciones de pardeamiento y cambios en la textura (Komolprasert y Morehouse, 2004, p. 98; Korkmaz y Polat, 2005, p. 397). La dosis de radiación aplicada a un alimento, depende directamente del propósito deseado; es así que, en función de la dosis se pueden lograr distintos objetivos, tal como se aprecia en la Tabla 1.8. Tabla 1.8. Dosis de radiación aplicadas para diferentes objetivos Rango Dosis (kGy) 0,02 – 0,15 Productos Objetivos Inhibición de la Papas, cebollas, ajos, raíz de germinación durante el jengibre, etc. almacenamiento Retraso de fisiológicos (maduración) procesos 0,10 – 1,0 Frutas y hortalizas frescas 0,20 – 1,0 Cereales, legumbres, granos de café, especias, frutas Desinfección de insectos frescas y secas, nueces, y parásitos pescado y carne frescos y secos, cerdo fresco 0,15 – 1,0 Frutas y hortalizas frescas Bajo Control fitosanitario 1 – 10 Cárnicos frescos, mariscos, Extensión de la vida útil verduras y frutas 2–8 Carne cruda de aves y carne Reducción microbiana o molida pasteurización Medio 10 – 30 Especias secas, hierbas y Descontaminación otros condimentos vegetales microbiana secos 25 – 75 Carne, aves, mariscos, alimentos procesados, dietas hospitalarias y para astronautas estériles Alto Esterilización industrial (combinada con tratamiento térmico suave) (Rahman y Ahmed, 2012, pp. 969, 970; Santamaria, 2003, p. 110) 32 1.3.4 IRRADIACIÓN COMBINADA CON OTROS TRATAMIENTOS POSCOSECHA Sommers y Fan (2013) presentan una revisión de los estudios realizados en relación a la combinación de la irradiación con otros tratamientos (pp. 284-288); y en la Tabla 1.9 se muestra un resumen de lo expuesto. Tabla 1.9. Resultados de la irradiación de alimentos combinada con otros tratamientos poscosecha Producto Lechuga fresca cortada Lechuga Iceberg cortada Melones frescos cortados Tratamientos Resultados Reducción de la población Cloración e irradiación a dosis de microbiana sin afectación en la 0,15 - 0,5 kGy firmeza Almacenamiento en MAP irradiación a 0,5 y 10 kGy Reducción del pardeamiento del e tejido de la lechuga por el decremento de la cantidad de O2 en los empaques Sumersión en agua caliente a 47 °C por 2 minutos seguida de irradiación a 0; 0,5; 1,0 y 2,0 kGy A dosis de 0,5 y 1,0 kGy con sumersión a 47 °C, la lechuga tiene mejor calidad visual y menor pardeamiento que la tratada a 5 °C Desinfección del melón entero con cloro (200 ppm), combinada con un tratamiento en un haz de electrones a dosis de 0,7 y 1,4 kGy Extensión del tiempo de vida útil del melón en rodajas y reducción de la carga microbiana, sin afectación en el color, el sabor y la textura de los trozos de melón Reducción de la carga microbiana y Pasteurización superficial de la la calidad de los melones cortados se fruta (76 °C, 3 min) antes de mantuvo durante el almacenamiento cortarse e irradiación a 0,5 kGy a4°C Manzanas “Galas” frescas cortadas Inmersión en ascorbato de calcio al 7% combinada con irradiación a 0,5 y 1,0 kGy y posterior almacenamiento a 10 °C Mejoramiento de la seguridad microbiologica, manteniendo la calidad de los trozos de manzana fresca recién cortada Cebollas verdes frescas cortadas Decremento del recuento de Tratamiento con agua caliente aerobios totales y extensión de la (50 °C, 20 s) con irradiación a vida útil, manteniendo la calidad bajas dosis (0,5 – 1,5 kGy) visual y el color verde de las cebollas (Sommers y Fan, 2013, pp. 284-288) 33 La irradiación de alimentos por sí sola, no siempre permite lograr los objetivos deseados, ya sea por la severidad del tratamiento o por el encarecimiento de los costos. Es así que, la combinación con otros tratamientos poscosecha es una alternativa viable y eficaz para alcanzar los resultados esperados. La irradiación a dosis bajas, se puede combinar con refrigeración, tratamiento térmico leve, altas presiones, envasado en atmosfera modificadas (MAP) o tratamientos químicos. La combinación de estos tratamientos pueden generar en ocasiones efectos aditivos y en otras sinérgicos (Brennan y Almudí, 2008, pp. 169, 171). 1.3.5 IRRADIADORES Las instalaciones que se usan industrialmente para la irradiación de alimentos son las fuentes de cobalto-60 y los aceleradores de electrones. Alrededor del 90 % de las instalaciones corresponden a fuentes de isótopos y el 10 % restante a los aceleradores (Díaz, 2009, p. 327; Fellows, 2000, p. 236). 1.3.5.1 Fuente de isótopos Los rayos gamma se generan a partir de radioisótopos de cobalto-60 (Co60) y alternativamente de cesio-137 (Ce137). El Co60 se desintegra en forma controlada a Ni60 estable, con la emisión de rayos gamma en dos longitudes de onda con niveles de energía de 1,17 y 1,33 Mev; y una vida media de 5,26 años, resultando en una disminución de su actividad en aproximadamente un 1,1 % por mes. La actividad promedio del Co60 y del Ce137 es de 222 - 370 x 1010 becqerel (Bq), donde cada Bq equivale a una desintegración por segundo, pero generalmente se emplean los curies (Ci) donde un Ci equivale a 3,7 x 1010 Bq (Rahman y Ahmed, 2012, p. 976; Sommers y Fan, 2013, pp. 30-32). El radioisótopo de Co60 se halla encapsulado en fuentes con forma de tubos (lápices), que se disponen en un diseño geométrico determinado (p. ej. cilindros, placas) y están soportados en un portafuentes (rack). Una fuente de Co 60 emite 34 radiación de forma continua e ininterrumpida por tanto los tubos deben reemplazarse periódicamente para mantener una actividad relativamente constante (Brennan y Almudí, 2008, p. 156). Las plantas de irradiación se diseñan para operación en batch o en continuo. En la configuración por lotes, los productos alimenticios son expuestos a la radiación durante un determinado período de tiempo, hasta que el alimento haya absorbido la dosis requerida para el propósito deseado. En los sistemas continuos, los alimentos pasan a través del recinto de radiación a una velocidad específica, que asegura que el alimento recibe la dosis de radiación requerida; este modo de operación es más conveniente para el procesamiento a gran escala (Tucker, 2008, p. 237). Los irradiadores de categoría IV son de tipo panorámico y cuentan con una cámara de irradiación, una piscina de almacenamiento, un sistema transportador, un panel de control automático y depósitos para los productos irradiados y no irradiados. La cámara de irradiación es un recinto constituido por paredes de hormigón gruesas y puertas con blindajes de plomo para evitar la liberación de radiación al ambiente. En la piscina de agua se almacena la fuente cuando no se usa; el agua absorbe completamente la radiación a la superficie, resguardando así, al personal que entra y sale de la cámara. El sistema de control permite al personal operar la fuente y además cuenta con un sistema de interbloqueo y alarma que evita que la fuente suba a la cámara cuando las puertas no estén completamente cerradas (Díaz, 2009, p. 328; Sommers y Fan, 2013, pp. 32, 33) 1.3.5.2 Irradiador de la Escuela Politécnica Nacional La Escuela Politécnica Nacional (EPN) cuenta con un irradiador de tipo panorámico con almacenamiento de la fuente radioactiva en húmedo y donde el radioisótopo utilizado es el Co60 que se halla encapsulado en 12 fuentes (lápices de 1x2x35 cm3) soportadas en un rack cilíndrico de 12 lápices. 35 Las instalaciones disponen de un sistema automático de elevación de la fuente; una piscina de almacenamiento en agua de 4,5 m de profundidad; un sistema de control e interlock que se opera de forma manual; y una cámara de irradiación con paredes de hormigón y una puerta de blindaje de plomo. Las paredes y la puerta son 1,5 cm de espesor y el techo de 1,4 cm. En el diseño original del irradiador la actividad máxima de la fuente fue de 150 000 Ci (curies); y la actividad actual es de 1 626 Ci (Luna y Santos, 2011, pp. 14-17). En la Figura 1.5 se muestra un esquema de las facilidades con las que cuenta el irradiador de la EPN. Figura 1.5. Esquema de las instalaciones del irradiador batch de la EPN 36 1.3.6 LEGISLACIÓN La irradiación de alimentos está limitada por la legislación vigente en cada país donde se ha autorizado su uso. Actualmente la irradiación se usa de forma comercial en 40 países dentro de límites específicos de dosis de radiación. En Estados Unidos la FDA regula las fuentes de radiación que se utilizan para irradiar alimentos, y aprueba una fuente luego de que se haya determinado que es seguro irradiar un alimento determinado. La FDA exige que los alimentos irradiados sean etiquetados con el símbolo internacional de irradiación (Figura 1.6). El símbolo radura debe fijarse con la declaración “tratado con irradiación” o “tratado por irradiación”. Los alimentos al granel, como los producto hortofrutícolas, deben estar etiquetados de forma individual o tener una etiqueta al lado del envase de comercialización (Brennan y Almudí, 2008, p. 165; FDA, 2014). Figura 1.6. Símbolo internacional de irradiación “radura” Para frutas y hortalizas frescas, la FDA autorizó el uso de radiaciones ionizantes hasta 1 kGy; y el Comité Conjunto de Expertos en Irradiación de Alimentos (JECFI) constituido por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO); la Organización Mundial de la Salud (OMS); y el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA), concluyó luego de varios estudios, que la aplicación de una dosis de hasta 10 kGy permite garantizar la inocuidad de los alimentos tratados. Sin embargo, el Codex Alimentarius de la FAO, en su norma estándar: CODEX STAN 106-1983, REV. 1-2003, manifiesta 37 que se podrá irradiar alimentos a dosis superiores a los 10 kGy para lograr una finalidad tecnológica legítima (Díaz, 2009, pp. 316-317; Fellows, 2000, pp. 234, 235; Kader, 2002, pp. 42, 295). En Ecuador la legislación en materia de irradiación de alimentos es escasa, estableciéndose únicamente directrices generales del etiquetado, en la Ley Orgánica de Consumo, Nutrición y Salud Alimentaria y en la Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1324-1; en ambas se establece que el proveedor y expendedor de alimentos procesados debe etiquetar los productos alimenticios que hayan sido tratados con radiación ionizante de acuerdo a las regulaciones internacionales vigentes (COPISA, 2014, p. 22; INEN, 2014, pp. 8, 9). 38 2 PARTE EXPERIMENTAL 2.1 DETERMINACIÓN DEL RANGO DE DOSIS DE RADIACIÓN Y EL EFECTO DE LA IRRADIACIÓN SOBRE LA CALIDAD GLOBAL DE LA NARANJILLA 2.1.1 CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LA NARANJILLA Se caracterizaron de forma individual 40 frutos de naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009, procedentes de una plantación ubicada en la Parroquia Santa Rosa, Cantón El Chaco, Provincia de Napo. Los frutos cosechados en madurez fisiológica (frutos pintones, 3/4 madurez, 75% de color amarillo) se clasificaron y seleccionaron en función de las especificaciones de la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 2303 (2009) (INEN, 2009, pp. 2-4); luego se lavaron y desinfectaron por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio de 100 ppm durante 15 min, se enjuagaron con agua corriente y se secaron al ambiente. Los parámetros físico-químicos analizados fueron: peso, diámetro, longitud, firmeza, pH y contenido de sólidos solubles totales (SST); y el parámetro bioquímico, actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO). - Peso: Se midió la masa de cada fruto incluido su cáliz y pedúnculo, usando una balanza electrónica marca BOECO, modelo BBA-51, capacidad de 4 100 g, y apreciación de 0,01 g. - Diámetro: Se midió el diámetro de la sección ecuatorial de la fruta, con un calibrador para frutas marca CRANSTON, capacidad de 100 mm, y apreciación de 0,25 mm. - Longitud: Se midió la longitud de cada naranjilla, con un calibrador marca Mc CORMICK, capacidad de 152 mm y apreciación de 12,7 mm. 39 - Firmeza: Se determinó la firmeza con la ayuda de un penetrómetro manual, marca McCormick, Fruit Preasure Tester, modelo FT 327, capacidad de 5 N, y apreciación de 0,05 N; provisto de un punzón de 6 mm de diámetro. Se retiró la cáscara en dos lados opuestos a la zona ecuatorial de la fruta, luego se insertó el punzón perpendicularmente a la superficie de la fruta sin cáscara, ejerciendo un presión constante y uniforme, finalmente se registró el valor obtenido. Los resultados se expresaron en Newton (N). - Sólidos solubles totales y pH: Para la determinación de los SST y el pH, se obtuvo el jugo de cada naranjilla; para lo cual la fruta se peló, cortó, y licuó, enseguida se tamizó la pulpa obtenida para separar las semillas. En el jugo obtenido; se midió los SST en un refractómetro portable, marca BOECO, modelo VBR32, capacidad de 32 °Brix, y apreciación de 0,2 °Brix; según el método AOAC 932.12 (AOAC, 2005). Se colocaron dos gotas de jugo sobre el prisma del refractómetro y se reportó la lectura en °Brix. El pH se midió en un pH-metro calibrado en el rango de 4 a 7, marca Hanna Instruments, modelo HI3220, según el método AOAC 981.12 (AOAC, 2005). Se sumergió el electrodo del pH-metro en aproximadamente 50 mL de jugo, se esperó que el pH se estabilice y se reportó directamente la lectura obtenida. - Actividad enzimática de la polifenoloxidasa: La actividad enzimática se determinó en extractos enzimáticos preparados con la naranjilla entera (pulpa + corteza); para esto se homogenizaron 100 g de fruta en 100 mL de buffer fosfato 0,2 M; pH 6 durante 30 s; se tamizó para separar la cáscara y las semillas, se centrifugó el jugo obtenido a 3 500 rpm durante 15 min, se filtró el sobrenadante y se recolectó el filtrado en viales de vidrio de 20 mL, constituyendo este último, el extracto enzimático que fue almacenado en congelación hasta su uso. La determinación de la actividad enzimática se realizó mediante un monitoreo espectrofotométrico, según el método de Potig & Joslyn 1948, citado por Avallone, Cravzon, Montenegro, y Pellizzari 40 (2001), con ciertas modificaciones (pp. 1-4). Se atemperó 19,2 mL de buffer fosfatos 0,2 M y 0,6 mL de catecol 0,1 M en un baño termostático a 30 °C durante 30 min, luego se adicionaron 0,2 mL de extracto enzimático, se homogenizó rápidamente y se midió la absorbancia de la muestra a 420 nm durante 5 minutos a intervalos de 30 s. Con las lecturas obtenidas se construyó una curva de absorbancia en función del tiempo y a partir de la pendiente de la parte lineal de la curva se determinó la actividad enzimática de la PPO en U/g según se detalla en el Anexo III. 2.1.2 PREPARACIÓN DE LA FRUTA PARA LA IRRADIACIÓN Para esta etapa de la experimentación se utilizaron un total de 160 naranjillas de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009 con un peso total aproximado de 28 kg. La fruta se cosechó en madurez fisiológica (frutos pintones), a primeras horas de la mañana; y se trasportaron a las instalaciones del Laboratorio de Química Orgánica del Departamento de Ciencias Nucleares (DCN), donde los frutos se seleccionaron en función de la calidad y apariencia externa, descartando aquellos con daño físico, sin cáliz y pedúnculo, con manchas y todos los que no cumpliesen con los estándares de calidad establecidos en la NTE INEN 2303 (2009): Frutas frescas. Naranjilla. Requisitos. Una vez seleccionados los frutos, estos se clasificaron en relación a su calibre, es decir todos cuyo diámetro ecuatorial sea mayor a 68 mm (naranjilla gruesa); seguidamente los frutos se lavaron en agua corriente y se desinfectaron por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio de 100 ppm, durante 15 minutos; se enjuagaron con agua limpia, se secaron con toallas absorbentes y se identificaron con marcador de tinta permanente. Finalizado el proceso de desinfección e identificación, las naranjillas dispuestas en 7 lotes de 20 frutos se colocaron en canastillas plásticas previamente desinfectadas con una solución de hipoclorito de sodio al 2 %, y se irradiaron en la fuente de Co60 del Laboratorio de Tecnología de Radiaciones (LTR) del DCN. 41 Ubicadas las naranjillas dentro de la cámara de irradiación, esta se cerró de acuerdo a los procedimientos de seguridad establecidos por el LTR; y se subió la fuente a la cámara, donde las frutas se irradiaron durante los tiempos de exposición determinados para cada dosis de radiación requerida. La disposición física de las canastillas alrededor del castillo de lápices de la fuente, dentro de la cámara de irradiación, se muestra en la Figura 2.1. Transcurrido el tiempo de exposición a la radiación correspondiente a la primera dosis de estudio (250 Gy), se retiraron 20 frutos a los que se les realizó los análisis físicos, químicos y sensoriales establecidos. La naranjilla restante se irradió hasta completar los tiempos de exposición de las dosis de radiación de 500, 1 000, 1 500, 2 000 y 3 000 Gy respectivamente. Para cada dosis, se muestreo un total de 20 naranjillas, considerándose dosis de radiación aditivas. Figura 2.1. Disposición física de la naranjilla en las canastillas plásticas, alrededor de la fuente de Co60 42 2.1.3 DISEÑO EXPERIMENTAL El ensayo se realizó con un diseño experimental completamente al azar de un solo factor; donde el factor de estudio fue la dosis de radiación a niveles de 250, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 y 3 000 Gy respectivamente; y las variables de respuesta del experimento fueron la calidad sensorial global de la fruta, apariencia del fruto, firmeza, sólidos solubles totales (SST), pH y la actividad enzimática de la PPO. Se usó 1 lote de 20 naranjillas sin irradiar como control. 2.1.4 ANÁLISIS FISICO QUÍMICO, SENSORIAL Y BIOQUÍMICO Para evaluar el efecto de la radiación gamma sobre la calidad global de la naranjilla se midieron los parámetros que se describen a continuación, ejecutándose cada medición por triplicado. - Apariencia general de la fruta: La apariencia se evaluó con base en la calidad visual global externa de la naranjilla; para ello se estableció una escala de valoración del 1 al 5. Donde 5 se asignó a todas las naranjillas que mantuvieron las características propias de la fruta, turgentes y con cáliz firme; y 1 se asignó a las frutas con daños físicos extremos, presencia de manchas y severamente deshidratadas. Se utilizó en el formulario presentado en el Anexo II, para el registro de datos. - Calidad sensorial global: La calidad sensorial se valoró en función de la presencia o ausencia de sabor y aroma extraños a la fruta. Por lo cual, se asignó una escala arbitraria del 1 al 5; donde 5 se asignó a las frutas con sabor y aroma característicos y 1 a las frutas con pérdida total de sabor y aroma propios de la naranjilla. Los datos se registraron en el formulario presentado en el Anexo II. - Firmeza: Se determinó la firmeza, como se describe en el acápite 2.1.1; y los resultados se reportaron en Newton (N). 43 - Sólidos solubles totales (SST) y pH: La determinación de los SST y el pH se realizó en el jugo de 3 naranjillas; para esto, las frutas se pelaron, cortaron y licuaron y seguidamente se tamizó la pulpa obtenida para separar las semillas. En el jugo obtenido se midieron los SST y el pH según la metodología descrita en el acápite 2.1.1. - Actividad enzimática de la polifenoloxidasa: Se determinó la actividad enzimática de la PPO, utilizando la metodología descrita en el acápite 2.1.1. Para este caso el extracto enzimático se preparó con 2 naranjillas y las mediciones se realizaron en 5 réplicas. 2.2 DETERMINACIÓN DE LA DOSIS DE RADIACIÓN NECESARIA PARA INHIBIR EL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO EN LA NARANJILLA Esta etapa de la experimentación se ejecutó al mismo tiempo que la etapa anterior, y se determinó la actividad enzimática de la polifenoloxidasa tanto en la fruta fresca como en los extractos enzimáticos reservados de la caracterización inicial de la naranjilla. Esto se realizó debido a la amplia variabilidad en los resultados de la actividad enzimática encontrados en la caracterización inicial de la materia prima. Las dosis de estudio fueron 250, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 y 3 000 Gy; para cada dosis se muestrearon aleatoriamente 10 naranjillas, con las cuales se prepararon extractos enzimáticos con 2 naranjillas enteras y se determinó la actividad enzimática con la metodología especificada en el acápite 2.1.1; de igual forma se irradiaron 5 extractos a cada dosis de estudio y se les midió la actividad enzimática. 44 2.3 ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS PROCESOS DE IRRADIACIÓN Y REFRIGERACIÓN SOBRE LA CALIDAD POSCOSECHA Y LA POLIFENOLOXIDASA ACTIVIDAD (PPO) DE LA FRUTA PARA LA DE LA NARANJILLA IRRADIADA 2.3.1 PREPARACIÓN DE LA IRRADIACIÓN Y ALMACENAMIENTO Para este experimento se emplearon 450 naranjillas con un peso total aproximado de 77 kg. La fruta se seleccionó como se indica en el acápite 2.1.2, se lavó de forma manual en agua corriente, se desinfectó por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio de 100 ppm durante 15 minutos, se enjuagó y se secó e identificó. Se irradiaron 225 naranjillas a la dosis de radiación determinada en el acápite 2.2 y las restantes se emplearon como control (naranjilla sin irradiar). La naranjilla preparada se colocó en gavetas plásticas, las cuales se distribuyeron alrededor de la fuente de Co60 y se expuso la fruta a la radiación gamma durante el tiempo requerido para la dosis determinada. Con el objetivo de homogenizar y mejorar la distribución de la radiación sobre la fruta, a la mitad del tiempo, se detuvo la irradiación, se giraron las gavetas y se prosiguió con el tratamiento hasta completar el tiempo total de exposición. Una vez terminado el proceso de irradiación la fruta se almacenó en refrigeración a 8 °C y 90 % HR hasta 60 días; y en forma paralela se almacenó el control a iguales condiciones de temperatura y humedad relativa. Los análisis físico, químico, bioquímico, fisiológico (tasa de respiración) y sensorial se realizaron al inicio del experimento y tras transcurrir 15, 30, 45 y 60 días de almacenamiento refrigerado a las condiciones establecidas más 7 días a 20 °C y 80 % HR, para simular el tiempo de vida en estante. En cada salida se 45 muestrearon aleatoriamente un total de 40 naranjillas, a las cuales se les determinó los parámetros que se detallan abajo. 2.3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL Durante el estudio poscosecha, se empleó un diseño en bloques completos al azar, con el fin de evaluar un posible efecto del factor tiempo sobre las variables de respuesta: firmeza, SST, pH, acidez titulable, pérdida de peso, apariencia, calidad sensorial, tasa de respiración y actividad enzimática de la polifenoloxidasa. El factor principal de interés seguirá siendo la dosis de radiación determinada en el experimento anterior, y el tiempo constituirá el factor de bloque. 2.3.3 ANÁLISIS FÍSICO, QUÍMICO, SENSORIAL, FISIOLÓGICO Y BIOQUÍMICO Durante la evaluación de la calidad poscosecha de los frutos irradiados, se determinaron los siguientes parámetros: - Firmeza - Sólidos solubles totales (°Brix) - pH - Acidez titulable (% ácido cítrico) - Pérdida de peso - Calidad visual (apariencia) - Calidad sensorial (sabor, aroma, dureza, acidez, dulzor y presencia o ausencia de sabores extraños) - Tasa de respiración - Actividad enzimática de la PPO 46 La firmeza, sólidos solubles totales, pH y actividad enzimática de la PPO, se evaluaron de acuerdo a lo descrito en el acápite 2.1.1; mientras que los demás parámetros se determinaron como se describe a continuación. 2.3.3.1 Acidez titulable La acidez titulable se determinó usando el método potenciométrico, para lo cual se diluyeron 5 mL de muestra de pulpa hasta 50 mL empleando agua destilada, luego se tituló con una solución de hidróxido de sodio 0,1N hasta alcanzar un pH de 8,2. La acidez titulable se reportó como porcentaje de ácido cítrico, según el método AOAC 942.15 (AOAC, 2005). El cálculo de la acidez titulable se lo realizó con la siguiente formula. ൌ ͳͲͲ ή ݂ ή ܸேைு ή ܰேைு ή [2.1] Donde: - A: acidez del producto en porcentaje en masa de ácido cítrico - fa: factor del ácido cítrico (0,064) - V NaOH: volumen del NaOH utilizado (mL) - N NaOH: normalidad de la solución de NaOH (0,1 N) - f: Factor de corrección del NaOH (0,995) - Vo: volumen de la alícuota de jugo de naranjilla (mL) 2.3.3.2 Pérdida de peso Se determinó el porcentaje de pérdida de peso de toda la fruta almacenada en refrigeración; para lo cual se pesó la naranjilla al inicio del experimento y en cada 47 salida de la cámara de maduración. El cálculo se lo realizó con la ecuación presentada abajo. Ψ± ݏ݁݁݀ܽ݀݅݀ݎൌ ௐ ିௐ ௐ ൈ ͳͲͲ [2.2] Donde: - Wo: peso de la naranjilla al inicio del experimento (g) - Wi: peso de la naranjilla en cada muestreo del experimento (g) 2.3.3.3 Calidad visual En la evaluación de la calidad visual de fruta, se valoraron los atributos: pérdida de turgencia, daño físico, aparición de manchas, y marchitez del cáliz. Se evaluaron 40 frutos en cada muestreo, subdivididos en grupos de 10 unidades. La valoración se realizó bajo los criterios que se presentan en la Tabla 2.1; cuya escala de evaluación se muestra en el Anexo IV y los datos se registraron en el formulario presentado en el Anexo V. Tabla 2.1. Escala de valoración para a evaluación de la calidad visual de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009, durante el almacenamiento refrigerado Atributos Valor Turgencia Daños físicos Marchitez del cáliz 1 Deshidratación extrema > 50 % Extrema 2 Deshidratación severa 30 % - 50 % Severa 3 Deshidratación moderada 10 % - 30 % Moderada 4 Deshidratación leve 0 % - 10 % Leve 5 Fruta fresca Ninguno Ninguna 48 En base a la escala de valoración establecida se calculó el índice de calidad visual para cada atributo con la siguiente fórmula: ܫൌ భ ାଶమ ାଷయ ାସర ାହఱ [2.3] ே Donde: - I: - n1-n5: número de frutos con valoración de 1 a 5 - N: índice de evaluación de la calidad visual número total de frutos evaluados La calificación final de la calidad visual se realizó en base a los rangos del índice de calidad visual como se muestra en la Tabla 2.2. Tabla 2.2. Escala de valoración de la calidad visual final de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009, durante el almacenamiento refrigerado Calificación 4-5 3-4 <3 Categorización I: Conserva características iniciales II: Presenta ligero deterioro, consumible III: No comerciable (Astiasarán y Martínez, 2000, p. 262) 2.3.3.4 Calidad sensorial El análisis sensorial se efectuó a través de una prueba de calificación con escalas no estructuradas (Alzamora et al., 2004, pp. 59-62; Ibarz y Barbosa, 2005, pp. 4754; Lawless y Heymann, 2010, pp. 155, 156). Un panel semientrenado conformado por 12 jueces evaluó los atributos: aroma (sabor + olor), dureza, acidez, dulzor; y presencia y/o ausencia de sabores extraños. Para la preparación de las muestras se tomaron de forma aleatoria 7 naranjillas por cada salida. De las frutas se retiró la cáscara y se eliminaron los extremos 49 para utilizar únicamente la parte central. Cada panelista recibió dos rodajas de fruta (pulpa + mucilago) de 1 cm de grosor; las muestras fueron entregadas en platos desechables, junto con trinches y un vaso de agua para cada panelista. Los panelistas realizaron el análisis sensorial bajo luz natural y reportaron los resultados según su apreciación en el formato presentado en el Anexo VI. 2.3.3.5 Tasa de respiración (TR) La tasa de respiración se determinó en relación a la producción de dióxido de carbono (CO2); usando un sistema dinámico de respiración provisto de un flujo de aire continúo, a las condiciones de almacenamiento establecidas. En las cámaras de respiración se colocó alrededor de 1 kg de naranjilla entera. La determinación de TR se realizó por triplicado tanto para la fruta irradiada como para el control. Las muestras de aire se tomaron al ingreso y a la salida de las cámaras de respiración; el muestreo se lo ejecutó por duplicado empleando jeringuillas de 1 mL. Se determinó el porcentaje de CO2 en las muestras tomadas en un Analizador Rápido de CO2/O2, Post-Harvest Research, VIA- 510. Las determinaciones se realizaron tres veces por semana a lo largo de todo el periodo de almacenamiento previsto. La tasa de respiración se determinó en mg CO2/kg·h, empleando la siguiente ecuación: ܶோ ൌ ǡൈൈሺೞ ିಶ ሻൈೄವ ൈఘೀమ ൈೄವ Donde: - TR: Tasa de respiración (mg CO2/kg·h) [2.4] 50 - 0,6: constante de transformación de unidades - f: flujo de aire de la cámara (mL/min) - LS: medida de CO2 del analizador a la salida de la cámara (cm) - LE: medida de CO2 del analizador a la salida de la cámara (cm) - CSTD: concentración de CO2 en el estándar usado (% vol.) - ρCO2: densidad de CO2 a la presión y temperatura de trabajo (g/L) - m: - LSTD: medida de CO2 del registrador del estándar usado (cm) masa del producto (kg) 2.4 DISEÑO BÁSICO DE UN PROCESO DE ELABORACIÓN DE PULPA DE NARANJILLA IRRADIADA El diseño básico del proceso de elaboración de pulpa congelada de naranjilla de la variedad INIAP Quitoense-2009, incluyó a la irradiación como una operación unitaria alternativa para inhibir el pardeamiento enzimático de la pulpa. Para su planteamiento se fijó una capacidad de producción de 1 228,5 kg de naranjilla por mes; que corresponde al 10 % del promedio de exportaciones de naranjilla ecuatoriana registradas en los años 2013 y 2014 (BCE, 2015). Para el proceso de irradiación se consideró que la fuente de Co60 del Laboratorio de Tecnología de Radiaciones (LTR) de la EPN fue repotenciada hasta una actividad de 100 000 Ci, alcanzando una tasa de dosis de 24 000 Gy/h. Con base a los diagramas de bloques (BFD) y de flujo (PFD) propuestos se realizaron los balances de masa y energía del proceso y se seleccionaron los principales equipos para el procesamiento de la naranjilla. 51 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 DETERMINACIÓN DEL RANGO DE DOSIS DE IRRADIACIÓN Y EL EFECTO DE LA RADIACIÓN SOBRE LA CALIDAD GLOBAL DE LA NARANJILLA 3.1.1 CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LA MATERIA PRIMA Para la caracterización inicial de la materia prima se utilizaron 40 frutos de naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009. Los frutos se cosecharon en madurez fisiológica (3/4 madurez, 75 % de color amarillo), se clasificaron y seleccionaron en función de las especificaciones de la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 2303 (2009) (INEN, 2009, pp. 2-4). Los parámetros fisicoquímicos analizados fueron: peso, diámetro, longitud, firmeza, pH, sólidos solubles totales (SST); y el parámetro bioquímico, actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO). En la Tabla 3.1 se presentan los resultados obtenidos de la caracterización inicial de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009. Tabla 3.1. Caracterización fisicoquímica y bioquímica inicial de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 Parámetro Peso (g) Valor 170,30 ± 13,35 Diámetro (mm) 70,33 ± 1,50 Longitud (mm) 58,44 ± 1,48 Firmeza (N) 35,17 ± 5,33 pH 3,14 ± 0,03 Sólidos solubles totales (° Brix) 8,05 ± 0,31 Actividad enzimática PPO (U/g) 76,59 ± 34,39 ݔҧ ߪሺ݊ ൌ ͶͲሻ 52 El peso promedio de los frutos fue de 170,30 g con una desviación estándar de 7,84 %; el diámetro y la longitud promedios fueron de 70,33 mm y 58,44 mm respectivamente con una desviación estándar de 1,50 %. En la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 2303 (2009), se establece que el calibre de la naranjilla de jugo se determina en relación al diámetro de la sección ecuatorial, la longitud y el peso de la fruta; por tanto, con los resultados obtenidos se estableció que la naranjilla utilizada para la experimentación corresponde a un calibre Grande, puesto que se obtuvo un diámetro mayor 68 mm; una longitud mayor a 55 mm y peso mayor a 130 g (INEN, 2009, p. 2). El pH de 3,4 y los sólidos solubles totales (SST) de 8,05 °Brix obtenidos; son similares a los valores presentados en Revelo et al. (2010), donde se reportan valores de pH de 2,72 ± 0,06 y de SST de 9,55 ± 2,75 °Brix. Sin embargo, cabe indicar que los resultados ahí reportados corresponden a análisis con fruta cosechada madura (100 % de coloración amarilla) (p. 99). La firmeza promedio fue de 35,17 N y presenta un 15,15 % de desviación estándar. Esta dispersión es considerable, lo que probablemente se debe al método de medición empleado; puesto que cuando se usa un penetrómetro manual las mediciones de firmeza se ven influenciadas por la uniformidad de la fuerza que se aplique para penetrar la pulpa de la fruta. Revelo et al. (2010) reportó un valor de firmeza de 5,70 ± 2,51 kgf (55,90 N) para naranjilla de jugo variedad INIAP Quitoense-2009 (p.99); mientras que Proaño (2008) reportó un valor promedio de 22,95 ± 10,11 N para naranjilla de jugo (Solanum quitoense Lam. variedad quitoense) (p.43). Estos resultados presentan desviaciones estándar altas, lo cual podría justificar la incertidumbre existente en las mediciones realizadas con un penetrómetro manual. La determinación de la actividad enzimática se realizó por espectrofotometría en extractos frescos parcialmente purificados, que se prepararon a partir de la pulpa y el pericarpio de la naranjilla. La determinación se realizó cada 30 s por 5 min a 420 nm; y los parámetros de medición fueron: pH 6,0; temperatura 30 °C; concentración del sustrato (catecol) 0,1 M; y 0,2 ml de extracto enzimático. La 53 evaluación de la actividad enzimática de la PPO se hizo al graficar la absorbancia en función del tiempo usando la pendiente de la parte lineal de la curva construida (Avallone et al., 2001, pp. 1, 2; Mejía et al., 2014, pp. 108, 109; Mogollon, Lizarazo, y Quintero, 2010, pp. 114, 115; Ochoa y Guerrero, 2012, pp. 118, 119). La actividad enzimática de la PPO determinada presentó una amplia variación, con valores entre 34,95 U/g y 154,61 U/g, un rango de 119,67 U/g y una desviación estándar del 44,91 %. Mogollon et al. (2010) reportaron diferencias en la evaluación de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en extractos obtenidos a partir de la corteza y la pulpa del lulo o naranjilla. Los valores promedio reportados fueron de 123,50 ± 15,45 U en la pulpa y de 1 333,83 ± 583,33 U en la corteza; con una desviación estándar de 12,51 % y 43,73 % respectivamente; con lo cual concluyeron que la corteza es el material vegetal con mayor actividad enzimática (p. 117). Para Mejía et al. (2014) las variaciones en la actividad enzimática se pueden atribuir a las diferencias en la metodología de extracción, las condiciones de medición de la actividad enzimática, el grado de madurez, la presencia de isoenzimas en relación al desarrollo fisiológico de los frutos, y la diversidad de sustratos fenólicos naturales presentes en las plantas y la afinidad de la polifenoloxidasa por estos. Por otra parte, la composición de los sustratos fenólicos es dependiente del cultivar, la especie, el grado de madurez y las condiciones ambientales predominantes en el cultivo y en el almacenamiento en poscosecha (pp. 111, 115). Para la evaluación de la radiosensibilidad de la naranjilla de jugo variedad INIAP Quitoense-2009, se irradió la fruta a dosis de 250, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 y 3 000 Gy respectivamente; como control naranjilla se usó sin irradiar. Las variables de respuesta analizadas fueron: la calidad sensorial global del fruto, apariencia externa del fruto, firmeza, sólidos solubles totales (SST), pH y actividad enzimática de la PPO. El tratamiento estadístico de los resultados se realizó en el programa STATGRAPHICS Centurión XVI, mediante el análisis de varianza simple (ANOVA), empleando el procedimiento de comparaciones múltiples LSD 54 (Mínima diferencia significativa) de Fisher, con un nivel de significancia (α) de 0,05 y un nivel de confianza del 95 %. 3.1.2 APARIENCIA Y CALIDAD SENSORIAL GLOBAL La radiación gamma tuvo efectos estadísticamente significativos (p < 0,05) sobre la apariencia externa de la naranjilla, para el rango de 1 000 a 3 000 Gy en relación al control, tal como se muestra en la Figura 3.1. Sin embargo, el efecto neto de la irradiación sobre la apariencia no fue considerable, puesto que para dosis de hasta 500 Gy la valoración promedio fue de 5, que representa a la naranjilla fresca recién cosechada y de buena calidad; y para el rango de 1 000 a 3 000 Gy la calificación fue superior a 4 lo que implica que la naranjilla presentó leves daños físicos en su corteza. Por tanto, se estableció que la apariencia general de la naranjilla no varió a consecuencia de la irradiación. 5,3 Apariencia 5,1 4,9 4,7 4,5 4,3 4,1 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.1. Gráfico de medias e intervalos LSD para la apariencia externa de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiadas a las dosis de estudio Abad (2014) concluyó que para el tomate de árbol (fruta perteneciente a la familia de las solanáceas al igual que la naranjilla) la apariencia del tomate no cambia luego de ser irradiado hasta dosis de 3 000 Gy (p. 99). 55 En la Figura 3.2, se aprecia que hubo diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) para las dosis de 1 000, 1 500, 2 000, 2 500 y 3 000 Gy respecto al control y el rango de 250 a 500 Gy, con una pérdida progresiva del sabor y aroma propios de la fruta por arriba de los 1 000 Gy. Hasta los 500 Gy la calidad sensorial global de la naranjilla se conservó; a los 1 000 Gy la valoración promedio fue de 4, que correspondió a cambios leves en el sabor y aroma; en el rango de 1 500 a 2 500 Gy la valoración promedio fue de 3, que representó variaciones moderadas en el sabor y aroma; y finalmente a 3 000 Gy la valoración media fue de 2, que significó una pérdida total del sabor y aroma característicos de la naranjilla. 6 Calidad sensorial 5 4 3 2 1 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.2. Gráfico de medias e intervalos LSD para la calidad sensorial global de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio La calidad sensorial global de tres cultivares de tomate de árbol: “anaranjado”, “anaranjado gigante” y “morado gigante, no experimentaron cambios, luego de exponerse la fruta fresca a radiación gamma a dosis comprendidas entre 250 y 3 000 Gy (Abad, 2014, p. 51). Samaniego (2014) por su parte reportó que la radiación ultravioleta deteriora el sabor a fruta en los zumos de las dos variedades de naranjilla utilizadas en su investigación (Dulce e Híbrida), la afectación superó el 50 % con respecto al zumo fresco de naranjilla para tiempos de tratamiento de 150 min en la variedad Dulce y 270 min en la Híbrida; además evidenció el 56 desarrollo de sabores extraños en los zumos de naranjilla híbrida luego de ser irradiados (p. 111). La alteración del sabor en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 irradiada a dosis superiores a 1 000 Gy se podría atribuir a que la irradiación de frutas a dosis altas puede inducir cambios bioquímicos por efecto de la radiolisis del agua y la formación de radicales libres con elevado potencial reductor y oxidante que probablemente podrían alterar la calidad sensorial global de la fruta. Los efectos negativos de la radiación gamma sobre las propiedades sensoriales de las frutas dependen de varios factores, entre los que destacan, el tipo de fruta y su estado fisiológico, la dosis de radiación y las condiciones bajo las cuales se irradia el alimento (Herrero y Romero, 2006, p. 73). 3.1.3 PROPIEDADES FISICOQUÍMICOS La determinación de los sólidos solubles totales se realizó con un refractómetro de mano de rango bajo (0 – 32 °Brix); obteniéndose un promedio de 8,47 °Brix para el control; un máximo de 9,00 °Brix a 1 000 Gy; y un mínimo de 8,73 °Brix a 250 Gy. La irradiación incrementó ligeramente la cantidad de SST en la naranjilla, con incrementos de 6,26 % y 3,07 % para el máximo y mínimo respectivamente, en relación al control. A pesar de lo mencionado, el efecto de la irradiación sobre los SST fue estadísticamente significativo; hallándose diferencias entre los SST determinados a las dosis de estudio y los obtenidos para el control, tal como se aprecia en la Figura 3.3. Los valores reportados para los SST a todas las dosis de estudio cumplen con los requisitos establecidos en la NTE INEN 2303 para naranjilla de jugo en madurez comercial, ya que los SST son mayores a 6,00 °Brix (INEN, 2009, p. 4); y también son similares a los reportados por Revelo et al. (2010) que determinaron valores promedios de SST de 9,55 ± 0,75 °Brix para la naranjilla cosechada en madurez comercial (madura) (p. 99). 57 Sólidos solubles totales (°Brix) 9,3 9,1 8,9 8,7 8,5 8,3 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.3. Gráfico de medias e intervalos LSD para los sólidos solubles totales de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio El pH se determinó en el jugo fresco de naranjilla recién tratada, con el uso de un pH-metro digital calibrado en el rango de 4,01 y 7,01. Como se muestra en la Figura 3.4, los valores obtenidos difieren estadísticamente entre el control y la dosis de 500 Gy, mientras que con las otras dosis de estudio el valor de pH se mantiene constante. Esto se debe probablemente a la variabilidad de la materia prima y más no, al efecto neto del tratamiento con radiaciones ionizantes. 3,5 3,4 pH 3,3 3,2 3,1 3 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.4. Gráfico de medias e intervalos LSD para el pH de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio 58 Los valores de pH reportados para todas las dosis de estudios son similares a los presentados en la caracterización inicial de la materia prima, por tanto se estableció que el pH no varía con el tratamiento proporcionado. La firmeza de la naranjilla empleada en esta parte de la experimentación, se mantuvo en alrededor de 31,58 N hasta la dosis de 500 Gy, a partir de lo cual disminuyó gradualmente hasta un valor mínimo de 6,81 N a los 3 000 Gy, tal como se aprecia en la Figura 3.5. Con respecto a la naranjilla sin irradiar existe una diferencia estadísticamente significativa para dosis por arriba de los 1 000 Gy; y en el rango de 2 000 a 3 000 Gy las diferencias estadísticas dejaron de ser significativas; pero con un porcentaje de reducción de firmeza que supera el 70 %. 40 Firmeza (N) 30 20 10 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.5. Gráfico de medias e intervalos LSD para la firmeza de la naranjilla sin irradiar (0 Gy) y luego de ser irradiada a las dosis de estudio El ablandamiento o pérdida de firmeza de los frutos es un proceso normal dentro de los procesos fisiológicos de maduración y almacenamiento en poscosecha; conforme avanza este proceso, la degradación de la pared celular primaria de las células vegetales se da por incremento de la actividad enzimática de la celulasa y la hidrólisis de compuestos pécticos (Agustí, 2010, p. 149). La pérdida de firmeza en la naranjilla tratada con radiación gamma puede explicarse, por el hecho que la radiación puede romper los compuestos pécticos y la celulosa, alterando la 59 respuesta fisiológica de los frutos, cuyo efecto directo es el ablandamiento (Fennema, 2000, p. 1189). En estudios realizados para otras frutas, se reportaron resultados similares a los presentados en esta investigación; es así que, Abad (2014) determinó que el tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) del cultivar “morado gigante” experimentó una pérdida de firmeza del 40 % producto de la exposición a radiación gamma a una dosis de 3 000 Gy; y Arévalo, Saucedo, y Bustos (2002) establecieron una pérdida súbita de la firmeza al día 1 y 3 después de tratar aguacate Hass (Persea americana Mill.) con radiación gamma a dosis de 100 y 150 Gy (p. 670). 3.1.4 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) La actividad enzimática de la PPO se determinó al igual que en la caracterización inicial de la materia prima; con el protocolo descrito en el Anexo III y con 5 réplicas de medición para cada dosis; evaluándose la actividad enzimática en los extractos obtenidos inmediatamente después de irradiar la naranjilla recién cosechada y también en los extractos reservados de la caracterización inicial que se almacenaron en congelación previo al tratamiento. En las Figuras 3.6 y 3.7 se puede apreciar que la irradiación tuvo un efecto inhibitorio parcial en la actividad enzimática de la polifenoloxidasa, ya que ésta disminuyó en relación a la actividad determinada en los extractos enzimáticos de naranjilla sin irradiar. En el experimento realizado con la naranjilla fresca, la actividad enzimática de la polifenoloxidasa varió entre un máximo de 147,35 U/g para el control y un mínimo de 74,78 U/g para una dosis de 1 500 Gy; presentándose diferencias estadísticamente significativas entre el control y el rango de dosis comprendido entre 500 y 3 000 Gy, tal como se evidencia en la Figura 3.6. 60 170 Actividad PPO (U/g) 150 130 110 90 70 50 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.6. Gráfico de medias e intervalos LSD para la actividad enzimática de la PPO en la naranjilla fresca sin irradiar (0 Gy) y en la naranjilla irradiada a las dosis de estudio En cambio, en la experimentación realizada con los extractos enzimáticos guardados de la caracterización inicial de la materia prima, la actividad enzimática varió entre un máximo de 72,13 U/g para el control y un mínimo 34,09 U/g para los 3 000 Gy; hallándose diferencias estadísticas significativas entre la actividad enzimática del control y la de las dosis de 500, 1 000, 1 500, 2 500 y 3 000 Gy, tal como se ve en la Figura 3.7. Actividad PPO (U/g) 100 80 60 40 20 0 0 250 500 1000 1500 2000 2500 3000 Dosis (Gy) Figura 3.7. Gráfico de medias e intervalos LSD para la actividad enzimática de la PPO en los extractos de naranjilla sin irradiar (0 Gy) y en los extractos irradiados a las dosis de estudio 61 De los resultados obtenidos, se puedo determinar que el rango de dosis de radiación gamma para tratar naranjilla de jugo variedad INIAP Quitoense-2009, fue el comprendido entre 250 y 500 Gy ya que permitió conservar la calidad global de la fruta y a su vez inhibió parcialmente el pardeamiento enzimático por polifenoloxidasa reduciendo su actividad en al menos un 38 % en comparación con los resultados hallados para la naranjilla sin irradiar. Como la naranjilla tratada con radiación gamma fue destinada para la elaboración de pulpa de fruta; la firmeza no constituyó un parámetro determinante en la selección del rango de dosis de radiación; y la irradiación a dosis superiores de los 500 Gy no fue viable ya que no se hallaron efectos inhibitorios superiores y el costo-beneficio del tratamiento no se justifica. 3.2 DETERMINACIÓN NECESARIA DE PARA LA DOSIS INHIBIR EL DE IRRADIACIÓN PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO EN LA NARANJILLA La determinación de la dosis de radiación gamma necesaria para inhibir la acción enzimática de las polifenoloxidasas, se realizó en base al análisis estadístico de los resultados presentados en el experimento anterior. La dosis seleccionada fue aquella que aparte de inhibir la actividad de la PPO permitió conservar las características fisicoquímicas y sensoriales de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 a niveles aceptables para el consumo en fresco y posterior almacenamiento refrigerado, para el estudio del tiempo de vida útil en postratamiento. De los resultados presentados en el acápite 3.1 se estableció que la calidad sensorial global de la fruta y la actividad enzimática de la PPO, fueron las variables de respuesta determinantes para la selección de la dosis de radiación necesaria para inhibir el pardeamiento enzimático en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009. La calidad sensorial de la fruta disminuyó drásticamente a partir de los 1 000 Gy, con la pérdida progresiva del sabor y aroma característicos de la 62 naranjilla; mientras que la actividad enzimática de la PPO experimentó un porcentaje de inhibición de alrededor del 40% hasta los 500 Gy; y por arriba de esta dosis de radiación el tratamiento no tuvo efectos inhibitorios significativos tal como se aprecia en la Tabla 3.2 y Tabla 3.3 y se comprueba en los gráficos de medias e intervalos LSD de las Figuras 3.6 y 3.7. Tabla 3.2. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla recién cosechada irradiada a las dosis de estudio Tratamiento Dosis (Gy) Control Irradiación Inhibición (%) Actividad PPO (U/g) 250 117,5 20,2 500 90,8 38,4 1 000 90,2 38,8 74,8 49,3 2 000 81,9 44,4 2 500 88,7 39,8 3 000 84,1 42,9 1 500 147,3 Tabla 3.3. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en los extractos enzimáticos de naranjilla irradiados a las dosis de estudio Tratamiento Dosis (Gy) Control Irradiación Inhibición (%) Actividad PPO (U/g) 250 87,2 49,0 43,8 500 71,8 43,1 40,0 1 000 77,7 41,9 46,1 1 500 67,4 36,1 46,5 2 000 92,8 53,2 42,6 2 500 66,1 36,1 45,3 3 000 53,3 34,1 36,1 63 La inactivación de la polifenoloxidasa mediante radiaciones gamma no fue total para el rango de dosis de estudio, sin embargo se pudo alcanzar un porcentaje de inhibición superior al 38 %, que permitió mitigar parcialmente la acción de la polifenoloxidasa, manteniendo la calidad global de la naranjilla y dando la posibilidad de procesar la naranjilla irradiada. La actividad de la polifenoloxidasa disminuyó en respuesta al tratamiento con irradiación gamma, lo cual se debió presumiblemente a la ionización del agua intracelular que conlleva a alteraciones bioquímicas en las enzimas por efecto de los radicales libres sobre ellas; sin embargo, los efectos de la radiación gamma pueden ser también contrarios a la inhibición o inactivación, puesto que las radiaciones ionizantes tienen la capacidad de destruir los compartimientos celulares y tisulares permitiendo de esta forma poner en contacto los sustratos fenólicos naturales con la polifenoloxidasa, dando paso al proceso oxidativo en presencia de oxígeno molecular del ambiente (Chen et al., 2010, pp. 6-8; Mesquita y Queiroz, 2013, pp. 409-410). A pesar que las polifenoloxidasas pueden ser inactivadas por las radiaciones gamma, las dosis requeridas para inactivación total están muy por arriba de las necesarias para la desinfección o estilización, estas son 10 veces mayores a las requeridas para eliminar los microorganismos. La inhibición de la actividad enzimática por radiaciones ionizantes, están influenciada por el tipo de enzima que se trate, la concentración de la enzima, la actividad de agua, la pureza del extracto enzimático utilizado para su determinación, la concentración de oxígeno, el pH, la temperatura y la relación de los efectos in vitro (enzimas purificadas) frente a los in situ (sistemas alimentarios). En general las dosis requeridas para la inactivación enzimática son menores para soluciones diluidas de enzimas, siendo los extractos enzimáticos parcialmente o poco purificados más resistentes a la irradiación frente a las preparaciones purificadas; con esto se pudo explicar el comportamiento de los extractos parcialmente purificados frente al tratamiento con irradiación; como se observa en la Figura 3.7 la disminución de la actividad enzimática de la PPO no tuyo mayor importancia con el aumento de la dosis de 64 radiación, a partir de los 250 Gy manteniéndose la actividad enzimática prácticamente inalterable (Fennema, 2000, pp. 582, 583). En función de los resultados obtenidos, la dosis de radiación seleccionada para el estudio poscosecha fue de la 500 Gy, ya que esta dosis permitió conservar las propiedades fisicoquímicas como pH, SST y firmeza; la apariencia y la calidad sensorial global; e inhibió parcialmente la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla. 3.3 ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS PROCESOS DE IRRADIACIÓN Y REFRIGERACIÓN SOBRE LA CALIDAD POSCOSECHA Y POLIFENOLOXIDASA LA (PPO) ACTIVIDAD DE LA DE LA NARANJILLA IRRADIADA Para el estudio de la calidad poscosecha se emplearon 450 naranjillas, de las cuales la mitad se irradió a una dosis de 500 Gy y la otra mitad se usó como control; todos los frutos se almacenaron hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR, más 7 días a temperatura ambiente (20 °C) y 80 %HR para simular el tiempo de vida en estante. Se muestrearon 40 frutos por cada periodo de almacenamiento (15, 30, 45 y 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR), tanto del tratamiento como del control. Los parámetros analizados durante el estudio poscosecha fueron: firmeza, pH, SST (°Brix), acidez titulable, pérdida de peso, tasa de respiración, actividad enzimática de la PPO, calidad visual de los frutos en base a la turgencia, daños físicos y marchitez del cáliz; y además se realizó un análisis sensorial. El análisis estadístico de los resultados obtenidos se hizo en el programa STATGRAPHICS Centurión XVI, usando un diseño experimental en bloques completos al azar, para evaluar un posible efecto del factor tiempo sobre las variables de respuesta estudiadas. 65 3.3.1 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Se estudió el efecto de la irradiación y el almacenamiento refrigerado sobre las propiedades fisicoquímicas: firmeza, pH, sólidos solubles totales (SST), acidez titulable y pérdida de peso. Al inicio del experimento (0 días de almacenamiento), el tratamiento por irradiación no tuvo efectos estadísticos significativos sobre la firmeza de la fruta en comparación con el control; cuyos resultados concuerdan con lo obtenido en la caracterización inicial de la fruta y en el experimento anterior. Sin embargo; durante todo el periodo de almacenamiento refrigerado, existieron diferencias estadísticas significativas entre la firmeza de la naranjilla sin irradiar y la tratada con una dosis de radiación gamma de 500 Gy, tal como se muestra en la Tabla 3.4 y la Figura 3.8. Tabla 3.4. Firmeza, pH, sólidos solubles totales y acidez titulable de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 irradiada a 500 Gy y almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR TRATAMIENTOS PERIODOS DE ALMACENAMIENTO 0 1 2 3 4 2,12 ± 0,60a Firmeza (N) Control 36,16 ± 2,62a 11,16 ± 2,36a 7,85 ± 1,79a 2,82 ± 1,55a Irradiación 33,22 ± 1,35a 0,00 ± 0,00b 0,00 ± 0,00b 0,00 ± 0,00b 0,00 ± 0,00b pH Control 3,18 ± 0,09b 3,17 ± 0,09b 3,22 ± 0,06b 3,22 ± 0,06b 3,52 ± 0,16b Irradiación 3,24 ± 0,08b 3,20 ± 0,21b 3,24 ± 0,03b 3,15 ± 0,09b 3,34 ± 0,07c Sólidos solubles totales (°Brix) Control 7,80 ± 0,20c 8,56 ± 0,46c 8,72 ± 0,33c 8,84 ± 0,26c 9,08 ± 0,23c Irradiación 7,76 ± 0,38c 8,24 ± 0,33c 8,80 ± 0,37c 9,12 ± 0,11c 9,00 ± 0,28c Acidez titulable (% ácido cítrico) Control 3,36 ± 0,28d 2,57 ± 0,11d 2,14 ± 0,16d 2,01 ± 0,10d 1,89 ± 0,20d Irradiación 2,76 ± 0,20e 2,24 ± 0,34e 2,01 ± 0,05d 1,86 ± 0,03e 1,74 ± 0,12d ݔҧ േ ߪሺ݊ ൌ ͷሻ Letras diferentes en una misma columna y para el mismo parámetro indican diferencias estadisticas significativas (p < 0,05) 0: Inicio del experimento (0 días de almacenamiento) 1: Primer periodo de almacenamiento (15 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 2: Segundo periodo de almacenamiento (30 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 3: Tercer periodo de almacenamiento (45 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 4: Cuarto periodo de almacenamiento (60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 66 13,9 Firmeza (N) 11,9 9,9 7,9 5,9 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.8. Gráfico de medias e intervalos LSD de la firmeza de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy De la Tabla 3.4 y la Figura 3.9 se aprecia que la firmeza de la naranjilla sin irradiar fue disminuyendo progresivamente con el tiempo de almacenamiento; al primer periodo de almacenamiento la firmeza se disminuyó en un 69,14 % y al cuarto periodo la disminución de la firmeza alcanzó un porcentaje de 94,14%; por lo contrario la firmeza de la naranjilla irradiada experimentó un decremento brusco, con un 100 % de pérdida a partir del primer periodo de almacenamiento. En la Figura 3.10 se muestra el comportamiento de la firmeza de la fruta al inicio del experimento y durante los periodos de almacenamiento refrigerado; y se pudo corroborar el decremento substancial en la firmeza a lo largo del almacenamiento, tal como se manifestó arriba. En refrigeración, los resultados obtenidos son similares a los reportados por Proaño (2008) quien determinó que la firmeza de tres ecotipos de naranjilla almacenada a 8 °C y 90 %HR comienza a disminuir a partir del día 15 hasta que en el día 28 los frutos pierden toda su firmeza (pp. 62, 63). 67 50,0 40,0 Firmeza (N) 30,0 20,0 10,0 0,0 0 1 -10,0 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.9. Firmeza de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 39 Firmeza (N) 29 19 9 -1 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Figura 3.10. Gráfico de medias e intervalos LSD de la firmeza de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado La pérdida de firmeza es un fenómeno propio de los procesos de maduración y senescencia; y los tratamientos poscosecha con radiaciones ionizantes y refrigeración han sido usados en varias frutas para extender su tiempo de vida útil, a través del retraso de estos procesos. El efecto de los tratamientos mencionados se ha estudiado en tomate de árbol, pera, mandarina y naranja dulce, etc.; es así que: en el tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) el 68 tratamiento con irradiación a una dosis de 500 Gy en combinación con recubrimientos comestibles permitió disminuir la pérdida de firmeza durante el almacenamiento hasta 75 días a 5 °C y 90 %HR (Abad, 2014, pp. 75, 76); en la pera William tratada con radiación gamma en un rango de 1,50 a 1,70 KGy y almacenada a 3 °C y 80 %HR hasta 45 días, la firmeza de la fruta fue superior a la del control (Wani, Hussain, Meena, y Dar, 2008, p. 989); y en la mandarina “Nagpur” y la naranja “Monsambi”, tratadas hasta 1,5 KGy y almacenadas a una temperatura de 6-7 °C y 90-95 % HR por 75 y 95 días respectivamente, la dosis de radiación aplicada no provocó efectos significativos sobre la firmeza de estas frutas (Ladaniya, Singh, y Wadhawan, 2003, p. 674). La firmeza de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 disminuyó durante el almacenamiento, con una significativa pérdida de firmeza en la naranjilla irradiada, que permitió inferir que la naranjilla es muy sensible a la radiación gamma y que a pesar que los efectos negativos sobre la firmeza no son inmediatos, estos se manifiestan drásticamente durante el almacenamiento refrigerado. El decremento significativo en la firmeza de la naranjilla irradiada se podría deber posiblemente a que la radiación gamma lesionó a la fruta afectando su pared celular, que provocó una degradación severa de las sustancias pécticas y la hemicelulosa; también se podría atribuir a un incremento de las actividades de las enzimas protopectinasa y pectinmetilestearasa (Ladaniya et al., 2003, p. 672; Wani et al., 2008, p. 984). El pH y los sólidos solubles totales no fueron influenciados significativamente por la irradiación. Entre la naranjilla tratada y el control no se presentó una diferencia estadística significativa tal como se muestra en la Tabla 3.4 y se corrobora en la Figura 3.11 y Figura 3.12; en tanto que el tiempo de almacenamiento si originó efectos significativos; encontrándose un ligero incremento en el pH en el cuarto periodo de almacenamiento, tal como se aprecia en la Figura 3.13; y un incremento exponencial en los sólidos solubles totales hasta el segundo periodo de almacenamiento refrigerado, posterior a éste no existieron diferencias estadísticas significativas tal cual se muestra en la Figura 3.14. 69 4,0 pH 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.11. pH de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado Sólidos solubles (°Brix) 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.12. Sólidos solubles totales de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 70 3,5 pH 3,4 3,3 3,2 3,1 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Sólidos solubles totales (°Brix) Figura 3.13. Gráfico de medias e intervalos LSD del pH de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 9,2 8,8 8,4 8 7,6 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Figura 3.14. Gráfico de medias e intervalos LSD de los sólidos solubles totales de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado El contenido de sólidos solubles totales incrementó con el tiempo, tanto para la naranjilla sin irradiar como para la irradiada, esto podría deberse a que el proceso de maduración no se retardó por efecto de la radiación ni tampoco con la disminución de la temperatura de almacenamiento. Varios estudios revelan que el contenido de los SST de algunas frutas (arándonos, frambuesas, manzanas, peras y mandarinas) no se ve afectado significativamente por el tratamiento 71 combinado de irradiación y refrigeración; y además que los SST tienden a incrementarse durante el almacenamiento (Golding et al., 2014, p. 50; Pérez et al., 2009, pp. 648, 649; Zhang, Deng, Fu, y Weng, 2014, pp. 7-12). Por otro lado, Proaño (2008) reportó que los SST en la naranjilla aumentan durante el almacenamiento refrigerado, y verse afectados por la reducción de la temperatura (p. 72). De la Tabla 3.4 y la Figura 3.15 se observa que para la acidez titulable existió diferencias estadísticas significativas entre la naranjilla tratada y el control a lo Acidez titulabel (% ácido cítrico) largo del almacenamiento refrigerado. 2,4 2,3 2,2 2,1 2 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.15. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez titulable de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy La acidez titulable disminuyó en el tiempo de almacenamiento refrigerado según se muestra en la Figura 3.16 y Figura 3.17; este comportamiento es concordante con el incremento del contenido de sólidos soluble totales presentado en la Figura 3.12 y Figura 3.14. Este resultado es además, análogo al obtenido por Abad, (2014) quien indica que esto se podría explicar por la reducción de los ácidos orgánicos en el proceso de maduración para la formación de compuestos volátiles aromáticos (p. 80). Acidez titulable (%ácido cítrico) 72 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Acidez titulable (% ácido cítrico) Figura 3.16. Acidez titulable de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 3,2 2,8 2,4 2 1,6 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Figura 3.17. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez titulable de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado La pérdida de peso se determinó en cada salida para todos los frutos muestreados. Tal como se muestra en la Figura 3.18, la pérdida de peso incremento con el tiempo hasta un porcentaje promedio de 18,33 % al cuarto periodo de almacenamiento; sin embargo no existieron diferencias estadísticas significativas (p > 0,05) entre el control y la naranjilla irradiada. 73 Pérdida de peso (%) 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.18. Pérdida de peso de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy La transpiración es el principal proceso fisiológico por el cual las frutas pierden agua y con ello peso, deteriorando su calidad y valor comercial para el consumo en fresco (Garcia y Garcia, 2001, p. 23). Abad (2014) determinó que en el tomate de árbol tratado con una dosis de radiación de 500 Gy, la pérdida de peso se disminuye en un 42 % en relación a los frutos sin tratamiento, almacenados hasta 75 días a 5 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C (p. 72); mientras que McDonald et al. (2013) establecieron que en la naranja navel “Lane Late” tratada con una dosis de 400 y 600 Gy, la pérdida de peso es significativamente superior a la de los frutos no irradiados, almacenados hasta 3 semanas a 5 °C seguido de 1 semana a 20 °C (p. 96). De lo expuesto se podría decir que el efecto de la radiación gamma difiere según el tipo y la variedad de fruta que se trate e incluso si ésta pertenece a la misma familia; además se podría establecer que la irradiación y el almacenamiento refrigerado no fueron efectivos para el control de la pérdida de peso en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009. 74 3.3.2 CALIDAD VISUAL La calidad visual se evaluó para los 40 frutos muestreados en cada periodo de almacenamiento refrigerado; en base a los atributos: turgencia; daños físicos; y marchitez del cáliz según la escala de valoración mostrada en el Anexo IV. La valoración se realizó usando un escala del 1 al 5; donde 5 representaba a los frutos con las características propias de la naranjilla recién cosechada y 1 a los frutos con una pérdida extrema de su calidad visual. Los resultados obtenidos en la evaluación de la calidad visual de la naranjilla tratada con irradiación y almacenada en refrigeración hasta 60 días se presentan en la Tabla 3.5. Tabla 3.5. Evaluación de la calidad visual de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy TRATAMIENTOS PERIODOS DE ALMACENAMIENTO 0 1 2 3 4 Turgencia Control 5,00 ± 0,00a 3,28 ± 0,13b 1,73 ± 0,34a 1,35 ± 0,17b 1,55 ± 0,58b Irradiación 5,00 ± 0,00a 2,28 ± 0,49c 1,61 ± 0,31a 2,00 ± 0,22c 2,78 ± 0,43c Daños físicos Control 4,68 ± 0,13d 3,70 ± 0,14e 3,05 ± 0,34e 2,70 ± 0,29d 2,93 ± 0,15d Irradiación 4,70 ± 0,00d 2,43 ± 0,56f 1,78 ± 0,57f 2,25 ± 0,38d 2,63 ± 0,42d Marchitez del cáliz Control 5,00 ± 0,00g 3,23 ± 0,33h 2,00 ± 0,39h 1,70 ± 0,14g 1,60 ± 0,08g Irradiación 5,00 ± 0,00g 1,93 ± 0,10j 1,38 ± 0,28j 1,55 ± 0,21g 1,48 ± 0,43g ݔҧ േ ߪሺ݊ ൌ ͶͲሻ Letras diferentes en una misma columna y para el mismo parámetro indican diferencias estadisticas significativas (p < 0,05) 0: Inicio del experimento (0 días de almacenamiento) 1: Primer periodo de almacenamiento (15 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 2: Segundo periodo de almacenamiento (30 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 3: Tercer periodo de almacenamiento (45 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 4: Cuarto periodo de almacenamiento (60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 75 La turgencia disminuyó con el tiempo de almacenamiento tanto para el control como para la naranjilla tratada; mientras que el tratamiento con irradiación no confirió efectos estadísticamente significativos en relación al control durante todo el periodo de almacenamiento. Los resultados obtenidos de la evaluación de la turgencia se muestran en la Figura 3.19 y Figura 3.20. Al inicio del experimento la calificación de la naranjilla irradiada fue de 5, puesto que la turgencia se mantuvo inalterable al igual que la de la naranjilla fresca recién cosechada. Sin embargo, en el primer periodo de almacenamiento la turgencia disminuyó significativamente; con calificaciones de 3 y 2 para el control y la naranjilla irradiada respectivamente; la calificación 3 representó a la naranjilla con deshidratación moderada y 2 a la naranjilla con deshidratación severa. Para los periodos posteriores al primer periodo de almacenamiento refrigerado la calificación promedio para el control y la naranjilla irradiada estuvo en el rango de 2 a 1, que significó que la naranjilla se hallaba deshidratada en el rango de severo a extremo; presentándose una calificación atípica de 3 para el lote muestreado en el cuarto periodo de almacenamiento según se observa en la Figura 3.19. 6,0 Turgencia 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.19. Turgencia de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 76 5,4 Turgencia 4,4 3,4 2,4 1,4 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Figura 3.20. Gráfico de medias e intervalos LSD de la turgencia de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado En la valoración de los daños físicos presentes en la superficie de la naranjilla; el tratamiento con irradiación tuvo efectos estadísticamente significativos. Sin embargo, la calificación promedio durante el almacenamiento se mantuvo en alrededor de la ponderación 3 que correspondió a un 10 a 30 % de daños físicos, tal como se puede apreciar en la Figura 3.21. 3,6 Daños físicos 3,4 3,2 3 2,8 2,6 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.21. Gráfico de medias e intervalos LSD de los daños físicos en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 77 El efecto de tiempo de almacenamiento sobre los daños físicos en la naranjilla se presenta en las siguientes figuras. 6,0 Daños físicos 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.22. Daños físicos en la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 5,1 Daños Físicos 4,6 4,1 3,6 3,1 2,6 2,1 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Figura 3.23. Gráfico de medias e intervalos LSD de los daños en la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado La valoración respecto a los daños físicos varió de un valor de 4,76 al inicio del experimento; 3,06 en el primer periodo; 2,45 en el segundo y tercer periodos y un 78 2,78 al final del experimento. Esta variación implicó que al inicio del experimento los frutos se hallaban sanos, sin golpes ni daños físicos aparentes y que a partir del primer periodo de almacenamiento los daños físicos no superaron el 30 % en la superficie total de la naranjilla, esto para el promedio entre el tratamiento y el control; sin hallarse diferencia estadísticas significativas en el lapso de los 30 a los 60 días de almacenamiento tal como se observa en la Figura 3.23. Ahora bien, si se analiza el tratamiento de forma individual (Tabla 3.5 y Figura 3.22) se verificó que la calificación a partir del primer periodo de almacenamiento fue de alrededor de 2 que implicó la presencia de manchas y daños físicos en un 30 a 50 % en la superficie de la naranjilla; evidenciándose mayor predominación de daños físicos en la naranjilla irradiada que en el control; lo cual se podría atribuir a que los daños mecánicos ocasionados durante la poscosecha de la fruta son más evidentes en la fruta tratada, puesto que la radiación debilitó la corteza de la naranjilla. La marchitez del cáliz tuvo una calificación de 2,71 para el control y 2,27 para el tratamiento; por tanto la valoración para este atributo fue de moderada y severa respectivamente; hallándose diferencias estadísticas significativas tal como se evidencia en la Figura 3.24. Marchitez del cáliz 2,9 2,7 2,5 2,3 2,1 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.24. Gráfico de medias e intervalos LSD de la marchitez del cáliz de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 79 La marchitez del cáliz al inicio de la experimentación tuvo una valoración de 5, pero a partir del primer periodo de almacenamiento la valoración decayó, asignándosele un puntaje próximo a 2 que representó una marchitez severa del cáliz; y desde el segundo periodo de almacenamiento, no se hallaron diferencias estadística significativas (p > 0,05) tal como se distingue en la Figura 3.25 y Figura 3.26 y se verifica en los resultados presentados en la Tabla 3.5. 6,0 Marchitez del cáliz 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.25. Marchitez del cáliz de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado Marchitez del cáliz 5,3 4,3 3,3 2,3 1,3 0 15 30 45 60 Tiempo (Días) Figura 3.26. Gráfico de medias e intervalos LSD de la marchitez del cáliz de la naranjilla al inicio del experimento y en cada uno de los periodos de almacenamiento refrigerado 80 La calificación final de la calidad visual se realizó con la determinación del índice de calidad, cuyos resultados se presentan en la Tabla 3.6. Tabla 3.6. Índice de calidad visual de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy ATRIBUTO TRATAMIENTO PERIODOS DE ALMACENAMIENTO CONTROL IRRADIACIÓN 0 I I 1 II III 2 III III 3 III III 4 III III 0 I I 1 II III 2 II III 3 III III 4 III III 0 I I 1 II III 2 III III 3 III III 4 III III Turgencia Daños físicos Marchitez del cáliz n=40 I = 4-5, II = 3-4, III £ 3 I: mantiene características iniciales II: presenta deterioro pero es consumible III: no comerciable La naranjilla sin irradiar obtuvo una categorización de II hasta el primer periodo de almacenamiento, que implicó que la fruta presentó ligeros deterioros en relación a los atributos evaluados pero que aun así era idónea para su comercialización; mientras que la naranjilla irradiada presentó severos defectos a partir del primer periodo de almacenamiento por lo que se categorizó como III, lo que significó que la fruta no era apta para su comercialización. 81 El deterioro de la calidad visual externa (apariencia) de los frutos está influenciado por la pérdida de turgencia, los daños físicos durante el transporte y el almacenamiento y la aparición de manchas u hongos sobre la corteza de la fruta. Para el caso de la naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009, la calidad visual presentó una afectación considerable en relación a los daños físicos y la marchitez del cáliz; lo cual se podría atribuir a que la dosis de radiación suministrada a la fruta causó daños irreversibles sobre la pared celular de la naranjilla, ocasionando como ya se mencionó, perdida de firmeza y peso; y por ende deterioro de la calidad visual de la naranjilla durante el almacenamiento. A pesar que no se visualizó una presencia substancial de hongos sobre la superficie de la fruta; la irradiación no originó los efectos esperados en relación a la calidad visual, ya que los atributos evaluados obtuvieron calificación inferiores a las de la naranjilla sin irradiar. 3.3.3 CALIDAD SENSORIAL El análisis sensorial se efectuó con un panel semientrenado conformado por 12 jueces quienes recibieron dos rodajas de fruta (pulpa + mucilago) de alrededor de 1 cm de grosor para evaluar los atributos: aroma (sabor + olor); dureza; acidez; dulzor; y la presencia y/o ausencia de sabores extraños. La calificación de los atributos se realizó mediante una prueba descriptiva de escalas no estructuradas, según el formato mostrado en el Anexo VI; y los resultados obtenidos para cada atributo valorado se presentan en la Tabla 3.7. El aroma fue determinado por la sinergia del sabor y el olor de naranjilla; y según la percepción de los panelista no varió con el tratamiento ni tampoco con el tiempo, encontrándose una calificación promedio superior a 5, que significó que la naranjilla tratada conservó sus características propias respecto al aroma. Este resultado concuerda con la calificación obtenida para los sabores extraños que en promedio fue de 1,5 lo cual implicó ausencia de sabores distintos al de la naranjilla. 82 Tabla 3.7. Evaluación sensorial de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 % HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy TRATAMIENTOS PERIODOS DE ALMACENAMIENTO 0 1 2 3 4 Aroma (Sabor + Olor) Control 5,18 ± 2,42a 4,84 ± 2,55a 4,96 ± 2,86a 5,75 ± 2,59a 5,61 ± 2,28a Irradiación 5,47 ± 2,62a 5,86 ± 2,39a 3,71 ± 2,24a 4,33 ± 2,13a 4,50 ± 2,68a Dureza Control 5,14 ± 2,08b 4,86 ± 2,48b 2,78 ± 1,47b 4,41 ± 2,23b 3,99 ± 2,25b Irradiación 5,48 ± 2,09b 2,63 ± 1,82c 1,82 ± 1,80b 1,43 ± 0,89c 2,38 ± 1,59b Acidez Control 6,24 ± 1,67c 6,38 ± 2,38c 5,63 ± 2,01c 6.23 ± 2,41c 6,14 ± 1,60c Irradiación 6,42 ± 1,73c 4,55 ± 2,87c 3,23 ± 2,22d 4,68 ± 3,04c 5,41 ± 2,86c Dulzor Control 3,00 ± 1,88d 2,98 ± 2,54d 3,10 ± 2,04d 3.49 ± 1,92d 3,26 ± 1,79d Irradiación 2,92 ± 1,32d 3,51 ± 2,50d 3,90 ± 2,41d 3,48 ± 2,54d 4,10 ± 1,60d Sabores Extraños Control 0,79 ± 0,95e 1,51 ± 2,10e 2,13 ± 2,74e 1,14 ± 1,41e 1,32 ± 1,96e Irradiación 1,08 ± 1,10e 1,75 ± 2,61e 2,81 ± 1,89e 1,37 ± 2,32e 1,37 ± 2,24e ݔҧ േ ߪሺ݊ ൌ ͳʹሻ Letras diferentes en una misma columna y para el mismo parámetro indican diferencias estadisticas significativas p < 0,05 0: Inicio del experimento (0 días de almacenamiento) 1: Primer periodo de almacenamiento (15 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 2: Segundo periodo de almacenamiento (30 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 3: Tercer periodo de almacenamiento (45 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) 4: Cuarto periodo de almacenamiento (60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) Para la apreciación de los panelistas, el dulzor no se modificó a causa de la irradiación, siendo éste resultado concordante con los valores obtenidos en la determinación analítica de los sólidos solubles totales (°Brix) presentados en la Tabla 3.4. Estadísticamente el dulzor se mantuvo invariable en el tiempo, sin embargo se halló una tendencia creciente en el tiempo, que concuerda con los resultados presentados en la Figura 3.14. Tanto la irradiación como el tiempo de almacenamiento no provocaron efectos estadísticamente significativos en el aroma, el dulzor y los sabores extraños; pero 83 la irradiación si lo hizo en la dureza y la acidez tal como se aprecia en la Figura 3.27 y la Figura 3.28. 4,7 4,3 Dureza 3,9 3,5 3,1 2,7 2,3 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.27. Gráfico de medias e intervalos LSD de la dureza de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 6,8 6,4 Acidez 6 5,6 5,2 4,8 4,4 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.28. Gráfico de medias e intervalos LSD de la acidez de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy Del análisis sensorial se estableció que la naranjilla irradiada se hallaba menos firme y menos ácida en comparación con el control; concordando los resultados 84 reportados en la Figura 3.27 y Figura 3.28 con los obtenidos de las determinaciones analíticas de la firmeza y la acidez titulable presentados en la Figura 3.9 y Figura 3.16 Adicionalmente los panelistas observaron variaciones en la apariencia de la pulpa de la naranjilla irradiada, en comparación con la pulpa del control. Estas diferencias se apreciaron a partir del primer periodo de almacenamiento, y se debieron principalmente al daño de la pulpa ocasionado por la irradiación. Los panelistas apreciaron que la pulpa se desprendió de la parte interna de la corteza y ésta se volvió algo gelatinosa. El daño producido en la pulpa se aprecia en la Figura 3.29; y este de podría atribuir al efecto negativo de la radiación gamma sobre la pared celular de la corteza que indujo pérdida de textura y ablandamiento. Este resultado es similar al reportado por Abad (2014) que halló que la irradiación de tomate de árbol a una dosis de 500 Gy durante el almacenamiento refrigerado, provocó daño en la pulpa de la fruta con migración del color de la piel hacia la pulpa (pp. 70, 71, 84). A B Figura 3.29. Corte transversal de frutos de naranjilla A) naranjilla sin irradiar y B) naranjilla irradiada 3.3.4 TASA DE RESPIRACIÓN La tasa de respiración se determinó en relación a la concentración de CO 2 determinada a entrada y la salida de las cámaras de respiración, que contenían 85 alrededor de 1 kg de fruta. Las determinaciones del porcentaje de CO 2 se realizaron en un Analizador Rápido de CO2/O2, Post-Harvest Research, VIA- 510; por triplicado y cada 3 días; a las condiciones de almacenamiento establecidas para el control y la naranjilla irradiada. Los valores reportados en la Figura 3.30 son los obtenidos hasta los 15 días de almacenamiento refrigerado; puesto que el analizador de gases presentó deficiencias técnicas que imposibilitaron su uso, y fue llevado a mantenimiento y Tasa de respiración (mg CO2/Kg h) reparación. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (Días) Control Irradiada Figura 3.30. Tasa de respiración de la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy De la Figura 3.30 se puede apreciar que la tasa de respiración de la naranjilla irradiada es superior a la del control, con una tendencia decreciente hasta los 10 días de almacenamiento; esto permitió advertir que los procesos metabólicos de deterioro se estaban dando de forma más rápida en la naranjilla tratada. Sin embargo, a los 15 días de almacenamiento la tasa de respiración fue igual tanto para el control como para la naranjilla tratada, a partir de lo cual no se pudo monitorizar el comportamiento de la tasa de respiración de la fruta, por las causas antes mencionadas. 86 3.3.5 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) Se investigó en el efecto de la radiación gamma sobre la inhibición del pardeamiento enzimático por polifenoloxidasa en la naranjilla, durante el almacenamiento refrigerado. La naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense2009 se irradió a una dosis de 500 Gy y se almacenó a 8 °C y 90 %HR durante un periodo total de 60 días más 7 días a condiciones ambientales (20 °C y 80 %HR) para simular el tiempo de vida en anaquel. Se realizaron muestreos para cada periodo de almacenamiento (15, 30, 45 y 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20°C y 80 %HR) y se determinó espectrofotométricamente la actividad enzimática de la polifenoloxidasa para la naranjilla tratada y para el control. Las determinaciones se realizaron en 5 réplicas y se halló que efectivamente la irradiación inhibe parcialmente la actividad de la polifenoloxidasa, reduciéndose su actividad en aproximadamente un 29,30 % en relación al control, tal como se muestra en la Figura 3.31 y en la Tabla 3.8. Actividad PPO (U/g) 45 41 37 33 29 25 Control Irradiación Tratamiento Figura 3.31. Gráfico de medias e intervalos LSD de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C y 80 %HR, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy 87 Tabla 3.8. Porcentaje de inhibición de la actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy Control* Irradiación* Actividad PPO (U/g) Actividad PPO (U/g) 0 50,80 ± 20,02a 44,26 ± 5,08c 12,9 1 51,43 ± 17,43a 33,10 ± 5,24d 35,6 2 31,41 ± 6,41b 23,80 ± 3,74e 24,1 3 37,10 ± 4,99b 20,61 ± 2,93e 44,4 4 31,25 ± 11,56b 20,90 ± 2,97e 33,0 Periodos de almacenamiento Inhibición (%) ݔ כҧ േ ߪሺ݊ ൌ ʹͲሻ Letras diferentes en una misma columna indican diferencias estadisticas significativas p < 0,05 Existieron diferencias estadísticas significativas (p < 0,05) en relación al tratamiento (Figura 3.31) y también a los periodos de almacenamiento (Tabla 3.8). Actividad PPO (U/g) 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0 1 2 3 4 Periodos de almacenamiento Control Irradiación Figura 3.32. Actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la naranjilla almacenada hasta 60 días a 8 °C y 90 %HR más 7 días a 20 °C, sin ningún tratamiento (control) e irradiada a 500 Gy En la Figura 3.32 se observa el comportamiento de la actividad enzimática de la PPO en relación al tiempo de almacenamiento; para la naranjilla irradiada la actividad de la PPO disminuyó progresivamente hasta el segundo periodo de almacenamiento a partir de lo cual no se hallaron diferencias estadísticas 88 significativas; en cambio para el control no se evidenció una tendencia especifica del comportamiento de la actividad de la PPO, manteniéndose prácticamente constante hasta el primer periodo de almacenamiento; luego experimentó una disminución al segundo periodo, luego de lo cual no se encontraron diferencias significativas. La polifenoloxidasa se halla contenida en forma natural en las frutas; y la importancia de su estudio radica en que esta enzima es la principal responsable de las reacciones de pardeamiento enzimático, que comercialmente es indeseable, debido a que su acción altera las propiedades sensoriales y nutricionales de los productos y por ende su comercialización. Se han estudiado diversos métodos de inhibición del pardeamiento enzimático, entre ellos están los métodos tradicionales como el tratamiento térmico y la adición de productos químicos; y los métodos alternativos, como por ejemplo: altas presiones hidrostáticas, ultrasonido, pulsos eléctrico, radiaciones ionizantes y no ionizantes, y la utilización de métodos combinados (Mesquita y Queiroz, 2013, pp. 403-412). El tratamiento término es quizás el método más efectivo para inactivar la polifenoloxidasa, a pesar que su uso debería estar limitado a frutas que estén destinadas a congelación ya que la elevación de la temperatura provoca pérdidas de textura y el desarrollo de procesos no enzimáticos (Pérez, 2003, pp. 82-97). (Gasull y Becerra, 2006) determinaron que la actividad de la PPO en la pera se inactiva en su totalidad con un tratamiento durante 10 minutos a 70°C y en la manzana durante 30 minutos a 70°C; y que la inactivación térmica de la PPO se da mediante una cinética de reacción de primer orden. Adicionalmente concluyeron que el ácido ascórbico es el inhibidor más eficaz para las frutas estudiadas, ya que actúa más como antioxidante que como inhibidor (pp. 73, 74). Por otro lado, autores como Denoya et al. (2012) estudiaron el efecto de tratamiento combinado de aditivos químicos sobre la inhibición enzimática, y determinaron que el tratamiento con 2 % ácido ascórbico, 1 % ácido cítrico y 0,5% EDTA es el más efectivo para inhibir la polifenoloxidasa en manzanas Granny 89 Smith mínimamente procesadas, hallándose porcentajes de inhibición por arriba del 85 % hasta 16 días de almacenamiento climatizado a 1,5 °C (pp. 265-267). Civera (2012) estudió el efecto de las altas presiones hidrostáticas (HPP) en combinación con Stevia Rebaudiana como antioxidante natural, en la actividad de la peroxidasa (POD) y la polifenoloxidasa (PPO) de un extracto enzimático de pulpa combinada de papaya, mango y naranja; y determinó que el tratamiento con HPP en ausencia de stevia, inhibió hasta en un 97 % la actividad de PPO y un 94% la actividad de POD, y concluyó que el uso de stevia confirió un efecto sinérgico sobre la inhibición de las enzimas estudiadas, encontrándose mejores resultados con el incremento de la concentración de stevia y manteniéndose las características sensoriales y nutricionales propias de las frutas (pp. 8-16). En manzanas mínimamente procesadas también se ha investigado el uso de ultrasonido en combinación con ácido ascórbico; es así que los resultados reportados por Jang y Moon (2011) revelaron el tratamiento simultáneo con ácido ascórbico y ultrasonido durante el almacenamiento, tenía efectos inhibidores sinérgicos sobre la polifenoloxidasa y la peroxidasa que son las enzimas relacionadas con el pardeamiento enzimático y que los efectos de la aplicación individual de los tratamientos fueron ineficientes (pp. 446-448). Otro de los tratamientos no convencionales investigados es el uso de microondas, y Paredes (2012) determinó que el horneo de manzanas a 1 200 W de potencia durante tiempos de 2, 3 y 4 minutos inactiva la polifenoloxidasa a porcentajes superiores al 90 %, sin influir la variedad de fruta sobre la acción inhibitoria de las microondas (p. 110). Las investigaciones relacionadas a la inhibición del pardeamiento enzimático en la naranjilla o lulo son escasos, sin embargo; se ha estudiado la utilización de: agentes antioxidantes, pulsos eléctricos de alta intensidad, radiación ultravioleta, y radiación gamma que es el caso particular en la presente investigación. Los resultados obtenidos en estas investigaciones se resumen enseguida. 90 El uso de inhibidores de la polifenoloxidasa fue estudiado por Mogollon et al. (2010) quienes encontraron que el ácido cítrico a 500 ppm es más apto para la inhibición de la PPO en la pulpa de lulo, con porcentajes de inhibición del 59,60 %; mientras que para los extractos enzimático obtenidos de la corteza el metabisulfito a 1 000 ppm es el mejor, con porcentajes de inhibición de alrededor de 56,08 % (p. 116). Vilcaguano (2013) investigó el efecto de los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo sobre la actividad enzimática del néctar de naranjilla, y obtuvo que el tratamiento a una frecuencia de 250 Hz durante 45 min inhibe la actividad de la PPO en un 10 % al inicio del experimento y durante el almacenamiento a 7 °C hasta 14 días la actividad enzimática incremento en otro 10 % para el néctar tratado, mientras que la actividad del control (sin tratamiento) incremento en un 94,80 %. Si bien el porcentaje de inhibición no fue importante, el tratamiento y la refrigeración tuvieron efectos sinérgicos, conservándose las propiedades sensoriales del néctar de naranjilla (pp. 65-67). Samaniego (2014) por su parte estudió el efecto de la radiación ultravioleta sobre la actividad enzimática de la polifenoloxidasa y la peroxidasa en el jugo de naranjilla, determinando la influencia del tiempo de irradiación sobre la acción de la enzimas, y obtuvo que la actividad de la PPO se inhibió en un 45,8 % a 270 min de tratamiento y en un 34,8 % a 150 min, para las variedades de naranjilla Híbrida y Dulce, respectivamente; mientras que la actividad de la PDO no se vio afectada por la radiación UV (pp. 72, 77). Para el caso del presente estudio, la radiación gamma no inhibió en su totalidad la actividad de la polifenoloxidasa; sin embargo los resultados del análisis sensorial permitieron establecer que el tratamiento no modificó el aroma de la naranjilla a pesar de sufrir una pérdida total de la firmeza. Los resultados obtenidos permitieron establecer que la naranjilla tratada bajo las condiciones antes expuestas, cumple con los requisitos específicos establecidos por la NTE INEN 2337 (2008) para pulpas de frutas, ya que la fruta es adecuada para la elaboración de pulpas al no alterarse las características sensoriales propias de la 91 fruta, estar exenta de olores y sabores extraños y presentar un contenido de solidos solubles totales (°Brix) superior a 6 (INEN, 2008, pp. 3,4) 3.4 DISEÑO BÁSICO DE UN PROCESO DE ELABORACIÓN DE PULPA DE NARANJILLA IRRADIADA Se planteó el diseño básico de un proceso para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla, de la variedad INIAP Quitoense-2009, en el que se incluyó a la irradiación como una operación unitaria alternativa, para inhibir el pardeamiento enzimático en la pulpa, a fin de obtener un producto con las características nutricionales y sensoriales propias de la fruta. El diseño del proceso se realizó con base a los diagramas de bloques (BFD) y de flujo (PFD) planteados, sobre los cuales se hizo los balances de masa y energía. Para el proceso de irradiación se asumió que la fuente de Co60 del Laboratorio de Tecnología de Radiaciones (LTR) de la EPN fue repotenciada hasta una actividad de 100 000 Ci y que ésta operaria 8 horas al día, 240 días al año. 3.4.1 DEFINICIÓN DEL PRODUCTO El producto a obtenerse es una pulpa congelada de naranjilla irradiada, con un contenido de sólidos solubles totales superior a 8 °Brix; un pH promedio de 3,0; de coloración amarilla característica; de sabor y olor propios de la naranjilla; y sin evidencias aparentes de pardeamiento enzimático; estas características se establecieron con base a los resultados obtenidos en el acápite 3.3. La pulpa de naranjilla a producirse, cumpliría con los requisitos físicos, químicos, sensoriales y microbiológicos establecidos por la norma técnica ecuatoriana INEN 2337:2008 (INEN, 2008, pp. 1-8). 92 La pulpa de fruta se envasaría al vacío en fundas plásticas de polietileno natural de alta densidad (HDPE) y en presentaciones de 500 gr; con un tiempo de vida útil de 6 meses en congelación. 3.4.2 CAPACIDAD DE PRODUCCIÓN La capacidad de producción se fijó en relación a las exportaciones de naranjilla que realizó el Ecuador en los años 2013 y 2014; asumiendo que los volúmenes de exportación reportados por el Banco Central del Ecuador, corresponden a fruta industrializada siendo su principal producto, pulpa congelada de fruta, puesto que la alta perecibilidad de la naranjilla impide exportarla como fruta fresca. Por tanto, se procesarían 1 228,5 kg/mes de naranjilla, que corresponde al 10 % del promedio de exportaciones de naranjilla. Además se asumió que si el diseño planteado fuese implementado; una planta de procesamiento de naranjilla de jugo operaría 8 horas al día y 5 días a la semana, con lo cual se procesarían 60 kg de fruta al día; y su modo de operación sería semicontinuo. 3.4.3 MATERIA PRIMA E INSUMOS La materia prima que se utilizaría, es la naranjilla de jugo de la variedad INIAP Quitoense-2009, procedente principalmente de la Provincia de Napo. Los proveedores de la naranjilla serían los pequeños y medianos productores agrícolas de la zona rural de la provincia, quienes garantizarían entregar la fruta cosechada en madurez de fisiológica (75 % coloración amarilla) y que cumpla con los requisitos establecidos en la Tabla 21 de la norma técnica INEN 2303:2009 (INEN, 2009, p. 4). 1 Requisitos físico químicos mínimos para naranjilla cosechada en madurez fisiológica: - Acidez titulable (% ácido cítrico): 2,4 - Sólidos solubles totales (°Brix): 6,0 - Índice de madurez (°Brix/acidez): 2,5 93 Las fundas plásticas de HDPE, se adquirirían a la industria local para una capacidad de empaque de 500 g, cuyas dimensiones aproximadas son 6” x 8” y de calibre 2 (espesor en µm). 3.4.4 DESCRIPCIÓN DEL PROCESO Y DEFINICIÓN DEL DIAGRAMA DE BLOQUES (BFD) Las operaciones unitarias que se realizarían para la producción de pulpa congelada de naranjilla irradiada, son las que se describen a continuación: - Recepción de la materia prima: En esta etapa del proceso se recepta (pesaje) la naranjilla entregada por los proveedores y se verifica que cumpla con los requisitos exigidos y descritos en el acápite 3.4.3. Se realiza además, un control de calidad de la naranjilla recibida con base a la norma NTE INEN 2303:2009; los parámetros analizados son: sólidos soluble totales (°Brix) y acidez titulable (% ácido cítrico), usando los métodos de ensayo NTE INEN 380 y 381 respectivamente. - Selección: Esta operación se realiza en forma manual y función de la apreciación visual, separando todos los frutos con daños mecánicos u otros daños (hongos, pudriciones, etc.). También se realiza una limpieza previa, removiendo las pelusas de la fruta, partículas de polvo, u otras sustancias ajenas a la superficie de la fruta. Para esta etapa, se consideró que los desperdicios alcanzarían un máximo de 5 % del total de fruta fresca receptada. - Lavado y desinfección: Los frutos son inmersos en una solución de hipoclorito de sodio de 100 ppm durante 15 minutos. Con base a la experimentación realizada se determinó que se emplearían 1,25 kg de agua clorada por cada kilogramo de fruta procesada. 94 - Escurrido: Se enjuagan los frutos desinfectados, se dejan escurrir y se secan al ambiente para remover el agua superficial. Esta operación se ejecuta empleando aire forzado proveniente de un ventilador; colocando la naranjilla en canastillas plásticas con un máximo de dos filas de fruta. - Irradiación: La naranjilla se irradia a una dosis de 500 Gy en la fuente de Co60 del LTR. El tiempo de exposición a la radiación gamma para los 60 kg/día es de 1 minuto y 15 segundos, puesto que la cámara de irradiación de la fuente, tiene un volumen de 41,6 m3 y permite irradiar 125 kg/carga con una tasa de dosis de 24 000 Gy/h. - Almacenamiento: Una vez irradiada la fruta, esta se coloca en una cámara de maduración a 20 °C y 80 %HR durante 7 días, a fin de que los frutos alcancen la madurez comercial (100 % coloración amarilla) y desarrollen en forma completa el sabor y aroma característicos de la naranjilla. - Despulpado: Siendo el rendimiento en pulpa del 80 %, la fruta se procesa en un despulpador industrial, y se separan la cáscara y las semillas. - Envasado y sellado: La pulpa de naranjilla irradiada obtenida, se envasa al vacío en fundas de polietileno natural de alta densidad, en presentaciones de 500 g. - Congelación: Las fundas de pulpa de naranjilla se colocan en gavetas plásticas y se almacenan en congelación a una temperatura aproximada de -20 °C. La congelación de la pulpa se la realiza considerando que el gradiente de temperatura es de 18 °C a -20 °C. En la Figura 3.33 se presenta en diagrama de bloques del proceso, en el cual se especifican los flujos másicos de las corrientes principales. Naranjilla fresca 60 kg/día Naranjilla dañada 3 kg/día SELECCIÓN LAVADO Naranjilla lavada Pulpa congela de Naranjilla 45,60 kg/día (91 fundas/día) CONGELACIÓN ENVASADO 11/05/2015 Luis Gabriel Montenegro Rivera ELABORADO POR: PÁGINAS: 1 DE 1 BFD DISEÑO BÁSICO DE UN PROCESO DE ELABORACIÓN DE PULPA DE NARANJILLA IRRADIADA PROYECTO: FECHA: Cáscara y semillas 11,40 kg/día Pulpa de Naranjilla DESPULPADO Naranjilla madura ALMACENAMIENTO Naranjilla irradiada IRRADIACIÓN ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA Fundas de HDPE 91 fundas/día Agua clorada 100ppm 72,25 kg/día ESCURRIDO Naranjilla seca Figura 3.33. Diagrama de bloques para la elaboración de pulpa de naranjilla irradiada a una dosis de 500 Gy RECEPCIÓN Naranjilla Agua clorada 100ppm 71,25 kg/día 95 96 3.4.5 BALANCES DE MASA Y ENERGÍA Y DEFINICIÓN DEL DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO (PFD) El balance de masa para el proceso de elaboración de pulpa de naranjilla irradiada, se realizó en relación a la metodología y las consideraciones descritas arriba. Un resumen de materia prima e insumos requeridos se presentan en la Tabla 3.9. Tabla 3.9. Resumen del balance de masa para el proceso de elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada Materia Prima / Insumo Cantidad (kg/día) / (fundas/día) Naranjilla fresca 60 Desperdicios de naranjilla 3 Agua clorada 100 ppm 71,25 Pulpa de Naranjilla irradiada 45,60 Cáscaras y semillas 11,40 Fundas de HPDE 91 Para la formulación del balance de energía se consideró únicamente el proceso de congelación, que es en el cual se debe retirar energía del sistema para obtener la pulpa congelada de naranjilla irradiada. En el planteamiento del balance se tomaron en cuenta: el calor de enfriamiento (18 °C a -1°C), calor latente de fusión y el calor de subenfriamiento (-1°C a -20 °C). La base de cálculo fue 45,6 kg/día de pulpa de naranjilla irradiada que se deberían congelar. Las magnitudes termodinámicas involucradas en el proceso de congelación se obtuvieron de bibliografía y se enlistan a continuación: - Calor específico de enfriamiento: ܥଵ ൌ ͵ǡͺ Calor latente de congelación: ߣ ൌ ͵ͳʹ Ԩ (Orrego, 2003, p. 67) (Orrego, 2003, p. 249) ݇ܬ Calor específico de subenfriamiento: ʹܥൌ ʹǡͲͳ ݇݃Ԩ (Orrego, 2003, p. 249) 97 Con las consideraciones realizadas, el balance de energía para el proceso de congelación se desarrolla en las siguientes ecuaciones: ܳ ݀ܽݎ݅ݐ݁ݎൌ ܳܿ݁݀݅݀ [3.1] ܳ ݀ܽݎ݅ݐ݁ݎൌ ݂ܳ݁݊ ܳܿ ݃݊ ݂ܾܳ݊݁ݑݏ [3.2] ܳ ݀ܽݎ݅ݐ݁ݎൌ ݉ ͳܥοܶͳ ݉ߣܿ ݃݊ ݉ ʹܥοܶʹ [3.3] ݇݃ ݇ܬ ݇ܬ ݇ܬ ܳ ݀ܽݎ݅ݐ݁ݎൌ Ͷͷǡ ݀Àܽ ቄ͵ǡͺ ݇݃Ԩ ሾͳͺԨ െ ሺെͳԨሻሿ ͵ͳʹ ݇݃ ʹǡͲͳ ݇݃Ԩ ሾെͳԨ െ ሺെʹͲԨሻሿቅ [3.4] ݇ܬ ܳ ݀ܽݎ݅ݐ݁ݎൌ ͳͻͲͺǡ ݀Àܽ ൎ ͷǡ͵ ܹ݇െ݄ ݀Àܽ [3.5] El diagrama de flujo de procesos se muestra en la Figura 3.34; en este se presenta el resumen de corrientes, donde se especifican los flujos másicos, la temperatura, la presión y el estado de cada corriente. Pulpa congelada Naranjilla fresca BA-101 CF-304 14 18 Fundas HDPE Naranjilla dañada 2 3 EN-303 13 BT-102 Cáscaras y semillas 12 4 11 5 9 ES-104 CI-201 8 26/05/2015 Luis Gabriel Montenegro Rivera PÁGINAS: 1 DE 1 PFD DISEÑO BÁSICO DE UN PROCESO DE ELABORACIÓN DE PULPA DE NARANJILLA IRRADIADA ELABORADO POR: FECHA: 7 CM-301 20 6 ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA 10 PROYECTO: DE-302 LA-103 Agua clorada Figura 3.34. Diagrama de flujo para la elaboración de pulpa de naranjilla irradiada a una dosis de 500 Gy 15 -20 1 98 99 A continuación se presenta la simbología de los equipos mostrados en el diagrama de flujo de procesos, junto con la codificación empleada por cada área de procesos. Tabla 3.10. Simbología de los equipos principales utilizados para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada Área Proceso Simbología del Equipo Codificación BA-101 Recepción Balanza Selección Banda transportadora BT-102 1 Lavado y desinfección LA-103 Lavadora de frutas ES-104 Escurrido Canastillas plásticas 2 CI-201 Irradiación Cámara de irradiación 100 Tabla 3.10. Simbología de los equipos principales utilizados para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada (continuación…) Almacenamiento CM-301 Cuarto de maduración DE-302 Despulpado Despulpadora industrial 3 Envasado EN-303 Envasadora al vacío Congelación CF-304 Cuarto frío 3.4.6 SELECCIÓN DE LOS EQUIPOS PRINCIPALES Se eligieron los equipos principales, en función del diseño planteado y la capacidad de producción fijada; para lo cual se consultaron los catálogos de equipos de proveedores nacionales e internacionales. En las siguientes tablas se describen las especificaciones técnicas de cada uno de los equipos y materiales principales, que serían utilizados en el proceso de elaboración de pulpa de naranjilla irradiada diseñado. 101 Tabla 3.11. Hoja de especificaciones técnicas de la balanza industrial BALANZA INDUSTRIAL Fabricante: PCE Inst. Modelo: PCE-SD 153C IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Dimensiones: 400 x 620 x 850 x 870 mm Capacidad: 150 kg Apreciación: 1 kg Alimentación: 12 V / 1,4 A Temperatura operativa: -10 ºC a +40 ºC Peso: aprox. 12 kg Acero lacado con un plato de pesaje de acero revestido de plástico. Pesar la naranjilla receptada Balanza PCE-SD 153C 102 Tabla 3.12. Hoja de especificaciones técnicas de la banda transportadora BANDA TRANSPORTADORA DE SELECCIÓN IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Fabricante: NIKO Modelo: JT3000 Dimensiones: L = 3 000 mm W = 450 mm W1 = 620 mm H = 1 500 mm Alimentación: 0,25 kW Peso: 90 kg Otras: - Montada sobre ruedas giratorias - Regulación de altura de las patas - Regulación de velocidad con regulador de frecuencia en la caja de comando central Acero inoxidable, con banda de material no tóxico. Seleccionar y separar las naranjillas de mala calidad, y transportar la fruta al lavado. Banda transportadora de selección JT3000 103 Tabla 3.13. Hoja de especificaciones técnicas de la lavadora de frutas LAVADORA DE INMERSION CON ASPERSIÓN IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Fabricante: CI TALSA Modelo: LIA-1 Dimensiones: L = 2 233 mm W = 1 028 mm H = 1 738 mm Capacidad: Hasta 1 t/h y un tanque con capacidad para almacena 0,5 m3 de agua Potencia: Bomba Gould: 1,5 HP (1,12 kW) Motorreductor FLENDER SC63: 1,2 HP (0,9 kW) Peso: aprox. 250 kg Acero inoxidable Lavar y desinfectar la naranjilla Lavadora de inmersión con aspersión LIA-1 104 Tabla 3.14. Hoja de especificaciones técnicas de las canastillas plásticas CANASTILLAS PLÁSTICAS Fabricante: PICA Modelo: 912071 IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Dimensiones: L = 60 cm W = 40 cm H = 18,5 cm Capacidad: 25 kg Apilamiento: 300 kg (12 canastillas apiladas) Polipropileno Manejar la naranjilla en las diferentes etapas de procesamiento Canastilla plástica 912071 105 Tabla 3.15. Hoja de especificaciones técnicas de la fuente de Co60 FUENTE DE Co60 IDENTIFICACIÓN Fabricante: EPN Modelo: Clase II (Irradiador panorámico con blindaje húmedo) ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Dimensiones de la cámara de irradiación: L = 4,0 m W = 4,0 m H = 2,6 m Espesor de las paredes = 1,5 m Espesor de la puerta = 1,5 m Espesor del techo = 1,4 Capacidad: 125 kg/día a 100 000 Ci MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Fuente: Radioisótopo Co60 Paredes: Hormigón Puerta: Plomo Irradiar la naranjilla a una dosis de 500 Gy Irradiador de la EPN 106 Tabla 3.16. Hoja de especificaciones técnicas de la cámara de maduración CÁMARA DE MADURACIÓN Fabricante: DAWSON Modelo: SB12 IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Dimensiones: L = 6,06 m W = 2,86 m H = 2,64 m Capacidad: 10 palés; 10,88 m2 Peso en vacío: 3 150 kg Alimentación: 35 A, 380 V Refrigerante: R404a Rango de temperatura: -30°C a 50°C Acero inoxidable Almacenar la naranjilla a 20°C y 80 %HR para que alcance la madurez comercial Cámara de maduración 107 Tabla 3.17. Hoja de especificaciones técnicas de la despulpadora de frutas DESPULPADORA DE FRUTAS IDENTIFICACIÓN Fabricante: IMARCA C.A. Modelo: 10050 ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Dimensiones: L = 85 cm W = 23 cm H = 47 cm Alimentación: 110 V, 60 Hz Potencia: ½ CV Peso: 22 kg Capacidad: 50 a 110 kg/h MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Acero inoxidable AISI 430 Despulpar y refinar la naranjilla con un rendimiento del 80 % en pulpa Despulpadora 10050 108 Tabla 3.18. Hoja de especificaciones técnicas de la envasadora al vacío ENVASADORA AL VACÍO Fabricante: ASTIMEC S.A. Modelo: J-V002 IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Dimensiones del equipo: 490 x 540 x 510 mm Dimensiones de la cámara: 435 x 420 x 170 mm Tipo de sellado: Dos costuras paralelas planas de 2,0 mm Alimentación: 220 V, 60 Hz Consumo: aprox. 0,8 kW Peso: aprox. 60 kg Acero inoxidable AISI 304 Envasar y sellar las fundas con pulpa de naranjilla Empacadora al vacío J-V002 109 Tabla 3.19. Hoja de especificaciones técnicas del cuarto frío CUARTO FRÍO Fabricante: DAWSON Modelo: SB12 IDENTIFICACIÓN ESPECIFICACIONES TÉCNICAS MATERIAL DE FABRICACIÓN FUNCIÓN Dimensiones: L = 6,06 m W = 2,86 m H = 2,70 m Capacidad: 12 palés; 13,67 m2 Peso en vacío: 3 150 kg Alimentación: 25 A, 380 V Refrigerante: R404a Rango de temperatura: -30°C a 18°C Acero inoxidable Congelar y almacenar la pulpa de naranjilla irradiada Cuarto frío SB12 110 4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 4.1 CONCLUSIONES - La naranjilla caracterizada cumple con los requisitos físico químicos exigidos por la NTE INEN 2303:2009, clasificándose como de Grado Extra (fruta sin defectos) y de Calibre Grande (m > 130 g; θ > 68 mm; l > 55 mm). - La actividad enzimática de la polifenoloxidasa en la caracterización de la naranjilla tuvo una amplia variación, con valores entre 34,95 U/g y 154,61 U/g, un rango de 119,67 U/g y una desviación estándar del 44,91 %. - La apariencia externa de los frutos, el pH y los sólidos solubles totales se mantuvieron invariables en el rango de dosis de estudio; sin embargo la calidad sensorial global y la firmeza si fueron afectados significativamente por la radiación gamma por arriba de los 1 000 Gy. - La dosis que permitió conservar la calidad global de la naranjilla y a su vez inhibir parcialmente (> 38%) la actividad enzimática de la PPO fue la de 500 Gy. - Durante el almacenamiento refrigerado el tratamiento con radiación gamma no tuvo efectos estadísticos significativos en el pH, los sólidos solubles totales, la acidez titulable y la pérdida de peso; pero si en la firmeza y la actividad enzimática de la PPO. - La firmeza en la naranjilla irradiada disminuyó en un 100 % a los 15 días de almacenamiento; mientras que en la naranjilla sin irradiar la disminución de la firmeza superó el 70 % a partir de los 15 días de almacenamiento. 111 - La actividad enzimática de la PPO en la naranjilla irradiada disminuyó hasta en un 30 % en relación al control, durante el almacenamiento refrigerado. - La tasa de respiración en la naranjilla irradiada fue mayor que la del control hasta los 10 primeros días de almacenamiento y permitió advertir que los procesos metabólicos de deterioro se estaban dando de forma más rápida en la naranjilla tratada. - Se diseñó un proceso para la elaboración de pulpa congelada de naranjilla irradiada, el cual incluyó las operaciones de: recepción, selección, lavado y desinfección, escurrido, irradiación, almacenamiento, despulpado, envasado, y congelación; con una capacidad de procesamiento de 60 kg/día de fruta fresca y un requerimiento energético de 5,03 kWh/día. 4.2 RECOMENDACIONES - Estudiar el efecto de la irradiación sobre la acción enzimática de las polifenoloxidasas, en extractos enzimáticos más purificados a fin de reducir la variabilidad de los resultados de actividad enzimática. - Evaluar la posibilidad de emplear radiación gamma en combinación con un tratamiento térmico suave para obtener un efecto sinérgico sobre las polifenoloxidasas y comprobar si se puede inactivar por completo la enzima. - Realizar un nuevo estudio de inhibición de pardeamiento enzimático con naranjilla cosechada en madurez comercial, para verificar la posibilidad de obtener porcentajes de inhibición de la actividad de la polifenoloxidasa superiores a los del presente estudio. 112 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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Formulario para la evaluación de la calidad global de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 Apariencia de los frutos N° 1 2 3 4 Calidad sensorial global 5 1 2 3 4 5 Observaciones: ......................................................................................................................................................………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………... 127 ANEXO III DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD POLIFENOLOXIDASA Principio La actividad de la polifenoloxidasa se determina realizando un monitoreo espectrofotométrico a 420 nm y 30 °C, usando como sustrato una solución de catecol 0,1 M. De la curva absorbancia en función del tiempo, se obtiene la pendiente de la porción lineal de la curva a partir de lo cual se determina la actividad de la polifenoloxidasa en U/g. Equipos y Materiales - Vasos de precipitación - Embudos - Porta embudos - Papel filtro - Tubos para centrifuga con tapa - Frascos de vidrio con tapa - Pipetas - Micropipetas automáticas - Celdas para espectrofotómetro - Cronómetro - Termómetro - Espectrofotómetro HACH DR 900 - Balanza analítica - Baño maría - Centrifuga - Licuadora 128 Reactivos - Solución A, Fosfato de sodio monobásico 0,2 M: Pesar 6,0 g de fostafo de sodio monobásico (NaH2PO4), disolver y aforar a 250 ml con agua destilada. - Solución B, Fosfato de sodio dibásico 0,2 M: Pesar 7,098 g de fostafo de sodio dibásico (Na2HPO4), disolver y aforar a 250 ml con agua destilada. - Solución Buffer Fosfato 0,2 M; pH 6,0: Medir 219,25 ml de la Solución A y adicional 30,75 ml de la Solución B, medir el pH y aforar a 500 ml con agua destilada. - Solución de Catecol 0,1 M: Pesar 0,275 g de pirocatecol, disolver y aforar a 25 ml con agua destilada. Procedimiento EXTRACTO ENZIMÁTICO - Pesar 100 gramos de fruta (pulpa + corteza) refrigerada a 8°C - Adicionar 100 ml de buffer fosfato, pH 6 (solución refrigerada) - Homogenizar durante 30 segundos - Centrifugar el filtrado a 3500 rpm durante 15 min - Filtrar el sobrenadante sobre papel filtro - El sobrenadante, constituye el extracto enzimático, que se mantendrá en congelación hasta su uso. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA - En un Erlenmeyer adicionar 19,2 ml de Solución Buffer fosfato 0,2 M; pH 6,0. - Agregar 0,6 ml de catecol 0,1 M. - Colocar en baño maría a 30 °C durante 30 minutos. - Adicionar 0,2 ml de extracto enzimático. - Homogenizar rápidamente y medir espectrofotométricamente a 420 nm, usando como blanco la mezcla reaccionante sin adicionar la muestra. 129 - Realizar un monitoreo espectrofotométrico durante 5 minutos a intervalos de 30 segundos. - Una unidad de actividad de PPO, se definió como la cantidad de extracto enzimático que acusó un aumento en la absorbancia de 0,001 unidades por minuto, y se calcula con la siguiente ecuación. Donde: ܷ ܽ ή ܸ ܽݏܽ݀݅ݔ݈݂݈݊݁݅ܽܿ݅ݐ݉݅ݖ݊݁݀ܽ݀݅ݒ݅ݐܿܣ൬ ൰ ൌ ݃ ͲǡͲͲͳ ή ܸ ή ܲ - a: Pendiente de la parte lineal de la curva Absorbancia Vs. Tiempo - Vm: Volumen total de muestra homogenizada con buffer en ml - Ve: Volumen de extracto enzimático usado para la reacción en ml - Pm: Peso de la muestra en g Deshidratación leve Fresca Deshidratación moderada 3 Deshidratación severa 2 Figura AIV.1. Escala para evaluar la turgencia en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 4 5 TURGENCIA Quitoense-2009. Los atributos valorados fueron: la turgencia; los daños físicos; y la marchitez del cáliz. Deshidratación extrema 1 En las siguientes figuras se muestras las escalas para la evaluación de la calidad visual de la naranjilla de jugo INIAP ESCALA PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD VISUAL DE NARANJILLA ANEXO IV 130 0 % - 10% Ninguno 10 % - 30% 3 30 % - 50% 2 Figura AIV.2. Escala para evaluar los daños físicos en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 4 5 DAÑOS FÍSICOS > 50 % 1 131 Leve Ninguna Moderada 3 Severa 2 Figura AIV.3. Escala para evaluar la marchitez del cáliz en la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 4 5 MARCHITEZ DEL CÁLIZ Extrema 1 132 133 ANEXO V FORMULARIO DE REGISTRO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD VISUAL DE NARANJILLA Submuestra: ………………………………………………… Fecha: ……………………………………………………………. Hora: ……………………………………………………………… Tabla AV.1. Formulario para la evaluación de la calidad visual de la naranjilla de jugo INIAP Quitoense-2009 Daño físico y aparición de Marchitez del cáliz manchas Pérdida de turgencia N° 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Observaciones: .....................................................................................................................................................………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 134 ANEXO VI FORMULARIO DE REGISTRO PARA EL ANÁLISIS SENSORIAL DE NARANJILLA Nombre: ……………………………………………………………….. Fecha: …………………………………………………………………… Hora: ……………………………………………………………………... Usted ha recibido un total de dos muestras para evaluar. La valoración de cada atributo realícela en el orden establecido. Para la calificación dibuje una línea vertical en la escala presentada, e identifique sobre la línea trazada con el código de la muestra entregada. ATRIBUTOS Aroma (Olor + sabor) Débil Intenso Dureza Muy Blando Muy Duro Acidez Débil Intenso Débil Intenso Dulzor Sabores extraños Ausencia Presencia Observaciones: ........................................................................................................................................................ ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… Gracias por su colaboración CV/SV/LM