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Western blot
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm
1. Objetivo
 Determinar los niveles de la proteína “actina” en diferentes sistemas celulares.
2. Introducción
La transferencia de proteínas o 'blotting' supone la inmovilización de las proteínas sobre
membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas especialmente
diseñados para la tinción de 'blots'. El método más potente es el denominado 'Western blot'
en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico
(perpendicular al gel) a una membrana. El procedimiento es análogo al desarrollado por el
Prof. E. Southern ('Southern blotting') y por ello se le denominó
'Western'. Hay sin embargo otros métodos de transferir o aplicar
proteínas sobre una membrana. El más sencillo es aplicarlas
directamente en forma de una pequeña gota de una solución
concentrada sobre la membrana. La absorción de la gota provoca la
adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de una
mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'). Existen dispositivos que
facilitan la aplicación de las proteínas directamente a la membrana,
aplicando una succión que facilita la penetración de la solución, y
reciben los nombres de 'dot blot' o 'slot blot' en función de que la
proteína quede aplicada en forma de una gota circular o de una línea.
En la imagen puedes ver dos de estos dispositivos.
Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas
dentro del propio gel:





Son más rápidas de teñir y desteñir.
Reducción del consumo de reactivos y anticuerpos.
Se detectan cantidades menores de proteínas pues se concentran en la superficie y
no se diluyen en todo el espesor del gel.
El 'blot' es un registro conveniente y cómodo de manipular del gel.
Las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel
Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas:




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Inmovilización de proteínas sobre la membrana ya sea mediante transferencia
(electroforetica, aspiración, presión) o mediante aplicación directa.
Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados
para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas.
Incubación del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés.
Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando
del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores.
1

Las bandas de proteínas marcadas con enzimas se hacen visibles por incubación
con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar
donde se encuentran las bandas de proteína.
Hay tres métodos para transferir proteínas a las membranas:
1. Transferencia capilar
2. Transferencia por difusión
3. Transferencia electroforética ('electroblotting')
En el caso de los geles de poliacrilamida el método de elección es la transferencia
electroforética. La transferencia es mucho más efectiva si se realiza aplicando una diferencia
de potencial entre el gel y la membrana.
Electroblotting
En este método, descrito por Towbin, las proteínas son transferidas desde el gel a la
membrana electroforéticamente. La ventaja de este proceso es su corta duración (de 30 min
a pocas horas), lo que reduce notablemente el efecto de difusión de las bandas. El
procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana papel de filtro
empapado en tampón de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con el gel,
más papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos capas
de plástico perforado y se introduce en un tanque en el que se encuentra una solución salina
(tampón de transferencia) y dos electrodos planos (diseñados para conseguir un campo
uniforme en toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel quede hacia el ánodo
(-) y la membrana hacia el cátodo (+). La carga neta de las proteínas en el caso de los geles
de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS.
La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos), que suele
corresponder a 0.3 a 2. Amp de 1 a 4 h. La velocidad de transferencia es inversamente
proporcional al tamaño de la proteína.
El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se recomienda
refrigerar el sistema y recircular el tampón.
Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien
conservarla en frio (2 a 8ºC) durante meses.
Existen diferentes combinaciones de soluciones de transferencia y de membranas para cada
aplicación. En la tabla siguiente se incluyen algunas de las más características.
Tabla : Condiciones de elestroblotting más comunes.
Gel
Tampón de transferencia
Membrana
Nitrocelulosa
SDS-PAGE (Lammli)
O'Farrell 2D
25 mM Tris, 192 mM glycina, 20%
Papel de intercambio iónico
v/v metanol, pH 8.3
PVDF
SDS-PAGE
IBCM
25 mM Tris, 192 mM glicina, pH 8.3
Nitrocelulosa, Nylon, Papel de
intercambio iónico, PVDF,
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papel diazo-modificado
O'Farrell 2D
25 mM fosfato sódico, pH 6.5
papel diazo-modificado
Native
PAGE
(proteínas acídicas o 15 mM borato sódico, pH 9.2
básicas)
papel diazo-modificado
IEF,
Native-PAGE
(proteínas
básicas), 0,7% ácido acético
geles de urea ácidos
Nitrocelulosa, Nylon,
diazo-modificad
papel
El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia, siendo muy
ineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto más eficiente cuanto más fino es el
gel, con un límite debido a los problemas de manipulación en torno a los 0.4 mm.
La membrana que se emplea más frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque cuando se
requieren soportes más robustos, por ejemplo cuando la membrana ha de ser reutilizada
diversas veces se recurre al Nylon. Sin embargo las membranas de Nylon se bloquean con
más dificultad que las de nitrocelulosa y suelen presentar mayor 'background'. Las
membranas de PVDF tienen gran capacidad de unión a proteínas y gran resistencia
mecánica pero se humedecen con más dificultad.
Todas las membranas son hidrofóbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes
de sumergirlas en soluciones acuosas.
Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que
habitualmente es el propio carril donde se han cargado los marcadores de peso molecular
que al transferirlos se tiñen sobre el filtro para ver si la transferencia de toda la gama de
pesos moleculares ha sido correcta.
Existen algunas variantes a la transferencia electroforética descrita previamente. El sistema
más extendido es el 'Semi-Dry blotting' en el que los geles son sometidos a una intensidad
de corriente elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca
una pila formada por papel, el gel, la membrana y más papel, empapados
en tampón de transferencia. El único líquido que hay es el que empapan
los papeles. La ventaja de este sistema es su rapidez, consiguiendo
transferencias en pocos minutos.
Tinción de proteínas en el filtro
Habitualmente se emplean técnicas de tinción de proteínas sobre el filtro como control de la
transferencia. Existen diferentes métodos para teñir todas las proteínas presentes en el filtro,
pero los que más interés despiertan son los métodos de tinción de proteínas específicas a
partir de mezclas complejas separadas en geles y transferidos a filtros, son los métodos de
tinción específicos, usualmente basados en métodos inmunoquímicos.
Proteína total
Colorantes
Los colorantes que permiten teñir las proteínas en los geles de poliacrilamida no son
utilizables en los filtros pues se unen irreversiblemente a éstos. Para teñir las proteínas en
los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro Amido.
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Ponceau S se emplea en forma de solución acuosa. La tinción es rápida pero no es
permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la tinción
desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de detección con anticuerpos.
El método de tinción de filtros con tinta china es reproducible, sensible y permanente, y no
interfiere con los procedimientos de inmunodetección, pero puede tapar la tinción
colorimétrica del proceso inmunoquímico. La tinción se basa en la adherencia preferente de
las partículas coloidales de carbón de la tinta sobre las proteínas inmovilizadas. La
destinción se hace en PBS.
El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un
fondo azul claro. Después de la tinción se destiñe con una solución de metanol/ácido
acético. Este método de tinción es incompatible con la inmunodetección posterior.
Tinción mediante biotina-estreptoavidina
Este método de tinción se basa en la afinidad de la estreptoavidina por la
biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las proteínas unidas
a la nitrocelulosa se pueden biotinilar empleando un derivado N-hidroxido
succinimida de la biotina que contiene un brazo espaciador hidrofóbico.
Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y después se bloquea la membrana con una
solución de leche en polvo. Las proteínas biotiniladas pueden ser detectadas empleando un
complejo preformado de estreptoavidina-enzima y el sistema de detección de la actividad
enzimática.
Tinción mediante oro coloidal
Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que actúa como colorante
para proteínas sobre filtros. Se trata de una solución coloidal estabilizada de oro a pH 3. A
este pH las partículas de oro están cargadas negativamente y se unen específicamente a las
proteínas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une no específicamente a
las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de
amplificación de señal. Este método tiene una sensibilidad similar al de la tinción con plata
de los geles.
Detección específica de proteínas en filtros
Una proteína específica puede ser identificada y visualizada en un 'Western blot' empleando
técnicas de inmunodetección. Estas técnicas emplean la capacidad de reconocimiento de
los anticuerpos a sus antígenos. En 'Western blot' se emplea comunmente el sistema de
inmunodetección indirecta que se representa en la figura. En este método se emplea un
anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. Un segundo anticuerpo, marcado
con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero,
se emplea para localizar donde se formaron los complejos antígenoanticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar de formas muy
diversas con el fin de producir una señal detectable (por ejemplo una
señal sobre una película radiográfica o una mancha de color en el filtro).
En ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario proteína A o
proteína G.
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Bloqueo de la membrana
Una etapa común a todos los procedimientos de inmunodetección es el bloqueo, para
prevenir la unión no específica del sistema de detección a la membrana, con el riesgo
asociado de tener un elevado 'background' o falsos positivos.
Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son efectivas. El factor
esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de
detección empleado. Por ejemplo, las soluciones de bloqueo que contienen leche desnatada
contienen una gran cantidad de carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse
cuando se van a emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por
ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la detección se emplea proteína A o
proteína G.
Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de detección
son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA).
También se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado 'background'. Sin
embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no iónicos como Tween-20 pues
pueden solubilizar las proteínas transferidas al filtro.
En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo más comunmente
empleadas:
Tabla : Soluciones de bloqueo más comunes en 'Western blotting'
Agente
Características
bloqueante
5% de leche desnatada en PBS /TBS. Muy económico. Con poco
Leche en polvo
'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos
antígenos.
Económico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20. Con
Leche / Tween-20 poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape
algunos antígenos.
0.1% Tween-20, 0.02% azida sódica en PBS/TBS. Económico. Permite
Tween-20
la tinción después de la inmunodetección. Puede quedar un
'background' residual.
3% BSA, 0,02% azida sódica en PBS. Bueno. Relativamente
BSA
económico.
10% suero de caballo, 0,02% azida sódica en PBS. Sin 'background'.
Suero de caballo
Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos antiinmunoglobulinas.
Elección del sistema de anticuerpos.
El tipo de anticuerpos empleado en la detección de las proteínas transferidas a filtro no es
determinante. Existen tanto excelentes anticuerpos policlonales con alta especificidad y
sensibilidad como monoclonales. Sin embargo los monoclonales se pueden obtener en
mayor cantidad y mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento
independientemente del lote.
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Una vez elegido el anticuerpo a emplear se deben realizar controles en el experimento,
como por ejemplo la inclusión de un experimento completo idéntico con suero pre-inmune, y
con el secundario empleado en la detección.
Secundarios / proteína A/ proteína G
Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos obtenidos inoculando en la
especie productoras inmunoglobulinas de la especie a detectar (anticuerpos anti-especie).
También se emplean los fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de
los anticuerpos puros, y que, al carecer de región Fc no interfieren con algunos
componentes de los tejidos que pueden estar presentes en las muestras biológicas
complejas, reduciendo el 'background'.
Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aislan de la pared celular de
bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas
pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene
una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.
Elección del sistema de revelado
Existen tres grandes grupos de marcadores o sistemas de revelado empleados en 'Western
blotting':



enzimas, que catalizan una reacción en la que se forma un precipitado coloreado, o
en la que se emite luz.
radioquímicos, que emiten radiaciones ionizantes
oro coloidal, que acumulado localmente produce un color rojizo, y que puede actuar
como catalizador para la deposición de plata, con lo que se incrementa la señal.
Enzimas
Los dos enzimas más empleados para marcar proteína A o G o anticuerpos son la
peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.
Peroxidasa de rábano (HRP). La peroxidasa de rábano (HRP) se emplea con gran
frecuencia. Se dispone de sustratos que forman un precipitado coloreado así como de
sustratos quimioluminiscentes.
Sustratos colorimétricos. Se basan en la formación de un producto coloreado
insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de acción del enzima. Se han descrito
tres sustratos para la HRP.
o 3,3' diaminobenzidina (DAB). En presencia de
peróxido de oxígeno la polimerización oxidativa y el
ciclado de la DAB por acción de la HRP produce la
aparición de un precipitado marrón. Se puede
intensificar la reacción añadiendo iones de Cobalto o
de Níquel, que provocan un cambio de color del
precipitado de marrón a gris-negro. La reacción es
muy rápida y es fácil que se desarrolle en exceso
provocando un elevado 'background' en el filtro. DAB
es una molécula de acción carcinogénica y es
necesario tomar precauciones para su manipulación.
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o 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB) Es un sustrato alternativo para la
DAB, más sensible antes de la amplificación con metales. Se forma un
precipitado azul. Sin embargo su uso es reducido pues el precipitado es
semisoluble en agua y desaparece con facilidad en algunas condiciones.
Actualmente se dispone de nuevas formulaciones del sustrato que
producen productos más estables.
o 4-cloro-1-naftol. En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el
cloronaftol produce un precipitado azul-negro. La reacción es fácilmente
controlable, aunque es relativamente insensible cuando se compara con
DAB o TMB.
Sustratos quimioluminiscentes. La reacción quimioluminiscente ocurre cuando
la energía de una reacción química se emite en forma de luz. Se emplea la peroxidasa de
rábano (HRP) para catalizar la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno.
Inmediatamente después de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado del
que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una
longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de
iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas.
Si esta reacción se produce sobre una membrana en contacto con una
película de autorradiografía ésta queda impresionada. Este sistema tiene
la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios
('stripping') y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos
('reprobing').
Fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina tiene una acción similar a la peroxidasa de rábano.
Se han descrito asimismo sustratos colorimétricos y sustratos quimioluminiscentes.
Los sustratos colorimétricos de la fosfatasa alcalina son:
o
o
o
Bromocloroindolil fosfato / nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT). Forma
un precipitado azúl-púrpura- Es el resultado de la desfosforilación y
posterior oxidación de BCIP a índigo, acoplada a la reacción de NBT a
diformazon. La reacción es progresiva lo que facilita el control de la
misma ajustando el tiempo de desarrollo.
Naftol-AS-MX fosfato / Fast red (NAMP/FR) y naftol-AS-BI-fosfato /
Fast Red TR (NABP/FR) Las dos parejas de productos conforman dos
sustratos que se transforman en un precipitado insoluble de color rojo.
Este sistema es menos sensible que el anterior (BCIP/NBT) pero el color
obtenido tiene un mejor contraste con la membrana.
AP mistly purple / AP liquid purple. Son productos comerciales
(Amersahm, composición exacta no conocida) con propiedades de
sustrato específicas para la fosfatasa alcalina. Se forma un precipitado
intensamente púrpura que no desaparece con el tiempo.
El sustrato quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina es el 3-(2'spiroadamantane)4-methoxy-4-(3'phosporyloxy)-phenyl-1,2-dioxetane. Después de la desfosforilación
el producto se acumula como un intermediario inestable que se descompone en
adamantane y methymetha-oxybenzoato que pasa de un estado inestable, excitado, a
otro estable, relajado, emitiendo luz. En la figura adjunta se muestran filtros de 'western
blot' que han sido revelados con algunos de los sustratos colorimétricos antes citados
para la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.
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Sistemas radioquímicos de revelado
Para poder detectar las proteínas mediante el uso de isótopos radiactivos es necesario que
éstas incorporen este tipo de isótopos. Existen diferentes estrategias para conseguirlo. La
elección de una u otra dependerá del objetivo perseguido. Veamos algunos ejemplos:


Si el objetivo es detectar las proteínas sintetizadas en un período de tiempo en un
sistema celular, el método de elección es el denominado marcaje metabólico, que
consiste en la adición al medio de cultivo de las células de aminoácidos marcados (en
general se emplean los aminoácidos azufrados cisteína y metionina con el isótopo
35S, emisor de radiación beta débil). Las células incorporarán este aminoácido a todas
las proteínas que sinteticen durante el período de exposición al trazador.
Si el objetivo es detectar una proteína en concreto, el método de elección será
inmunoquímico con un sistema de revelado que emplee reactivos radiactivos:
anticuerpos secundarios unidos a 125I o proteína A o G -I125. El proceso de marcaje
de una proteína con 125I se basa en la reacción de Bolton y Hunter. De una manera
similar se pueden incorporar otros marcajes como el 35S.
El revelado se realiza mediante exposición de la membrana ante película autorradiográfica.
En este caso, a diferencia de la autorradiografía y fluorografía de los geles de acrilamida no
es necesario tratar la membrana con fluoróforos pues la totalidad del marcaje se localiza en
la cara más externa de la membrana. Si se emplean las pantallas amplificadoras para
incrementar la señal.
La ventaja de disponer de copias duraderas (película) del experimento es
además de la conservación, la posibilidad de realizar densitometrados
que permiten obtener valores cuantitativos de la señal obtenida. Para ello
es ideal el sistema de 'slot blot'. En la figura se han recogido algunos
ejemplos.
Tinción mediante oro coloidal
Es posible detectar las proteínas fijadas sobre un filtro empleando anticuerpos que
directamente o indirectamente (anticuerpos secundarios o proteína A o G) estén unidos a
oro coloidal.
Debido a las características del oro coloidal la interacción antígeno anticuerpo se observa
como una señal rosacea de intensidad proporcional a la cantidad de antígeno presente. La
señal es tenue y tiende a desaparecer. Por ello se han diseñado sistemas de intensificación
de señal que en general se basan en la precipitación de plata metálica en
torno al oro coloidal. La reacción de amplificación con plata se basa en la
reducción de iones de plata a plata metálica por acción del oro, que actúa
como catalizador. Se forma un precipitado marrón oscuro, estable, que
incrementa la sensibilidad 10 veces.
La tinción que se obtiene es permanente y casi sin 'background'. El
proceso de intensificación de la señal del oro con plata es progresivo y
puede ser monitorizado hasta obtener la señal deseada.
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En las imágenes se muestra, en la primera, una comparación entre un filtro de 'western blot'
revelado con oro coloidal o amplificado posteriormente con plata. El aumento de sensibilidad
es importante. En la segunda se muestra el efecto del tamaño de la partícula de oro coloidal
sobre la sensibilidad de la detección.
3. PROCEDIMIENTO
a. Realizar la electrotransferencia de las
proteínas resueltas en el SDS-PAGE a una
membrana de nitrocelulosa.
b. Retirar las membranas de la cuba y
continuar con el siguiente protocolo:
i. Ponceau: teñir las membranas con rojo ponceau por 5 minutos.
ii. Lavar el colorante con H2Od hasta ver las bandas. Analizar la calidad de la
transferencia visualmente y anotar las observaciones.
iii. Bloqueo: bloquear con leche en polvo 0% de grasa (20 ml, 5% p/v en
TTBS.) durante 15 minutos.
iv. Lavado: hacer 3 lavados con TTBS de 3 minutos.
v. Anticuerpo 1º: incubar las membranas con 1 ml del anticuerpo 1º antiactina hecho en conejo (el cual está diluido 1 en 5000 en TTBS) durante 45
minutos.
vi. Lavado: hacer 3 lavados con TTBS de 3 minutos.
vii. Anticuerpo 2º: incubar las membranas con 1 ml del anticuerpo 2º anticonejo hecho en cabra y conjugado con HRP (el cual está diluido 1 en
5000 en TTBS) durante 20 minutos.
viii. Lavado: hacer 3 lavados con TTBS de 3 minutos.
c. Revelar las membranas con los reactivos del “luminol” (método
quimioluminiscente).
Los siguientes pasos se realizan en cuarto oscuro.
i. Empapar la membrana de nitrocelulosa con 1ml de reactivo de ECL
durante 3 minutos.
ii. Retirar y colocar la membrana entre dos vidrios y dentro del estuche de
revelado. Colocar sobre el vidrio superior la placa radiográfica. Cerrar el
estuche y dejar la exposición de 1 a 3 minutos.
iii. Quitar la placa radiográfica y empaparla con el reactivo revelador de placas
radiográficas.
iv. Retirar la placa y empaparla con el reactivo fijador de placas radiográficas.
v. Retirar y colocar en agua.
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