Detección de autoanticuerpos en suero

DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS EN SUERO POR
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
1.- INTRODUCCIÓN
Los autoanticuerpos son anticuerpos de un individuo que reaccionan contra proteínas u otras
moléculas propias, denominadas autoantígenos. Suelen encontrarse en suero en enfermedades
autoinmunes. Los autoantígenos frente a los que se dirigen pueden ser de naturaleza diversa y los
complejos Ag-Ac formados depositarse en tejidos muy distintos, como el riñón o las articulaciones.
La detección de los autoanticuerpos en humanos está facilitada por el hecho de que pueden
reconocer el antígeno en tejidos de otras especies. En la práctica se usan cortes de tejidos de
animales de experimentación, como por ejemplo rata o mono, o líneas celulares humanas
cultivadas.
Para la determinación de autoanticuerpos, se incuban en un portaobjetos el suero problema
y el tejido. Después se lava para eliminar todo lo que no se ha unido y se incuba con un antisuero
que reconozca las Ig humanas, marcado con un fluorocromo. Al observarlo al microscopio de
fluorescencia se verán las zonas del tejido donde se han unido los antoanticuerpos, si es que estaban
presentes, ya que aparecerán fluorescentes. Observando la estructura del tejido que se marca, se
puede determinar la naturaleza de los antígenos frente a los que se dirige el autoanticuerpo. Esta
técnica se denomina inmunofluorescencia indirecta (IFI).
En la práctica se determinará la presencia de anticuerpos antinucleares, anti DNA, anti
músculo liso y/o anti células parietales gástricas, en distintos sueros humanos. Para llevarlo a cabo
se utilizarán cortes de hígado, riñón y estómago de rata, y citocentrifugados de células de la línea
humana Hep-2 y de Crithidia luciliae.
2.- OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:
- Detectar autoanticuerpos por IFI.
- Diferenciar algunos de los patrones más comunes: patrones nucleares (homogéneo, periférico,
moteado y nucleolar) en hígado y Hep-2, anti DNA en Crithidia, anti músculo liso en un corte
transversal de estómago y en arterias renales, anti células parietales gástricas en estómago.
3.- EQUIPAMIENTO
- Microscopio de fluorescencia con filtros para FITC (Isotiocianato de fluoresceina).
- Portas con alguno de los siguientes cortes o células: hígado, riñón y estómago de rata, células
Hep-2, Crithidia luciliae.
- Cubetas para lavar portas.
- Agitador horizontal y vortex.
- Cámara húmeda.
- Tubos de poliestireno de 5ml y gradilla.
- Pipetas de 5-40, 40-200 y 200-1000l y puntas.
- Papel secante.
- Cubreobjetos de 24x60 mm.
4.- REACTIVOS
- PBS pH 7.2
- Antisuero de conejo o cabra anti Ig humanas conjugado a FITC (Dako a dilución 1/200).
- Azul de Evans (opcional)
- Medio de montaje: glicerol 50% en PBS.
- Pool de sueros de donantes sanos (control -).
- Sueros problema.
5.- PROCEDIMIENTO
1)
Diluir los sueros control negativo y problemas 1/40 (o la dilución que indique el Profesor)
en PBS, hasta un volumen final de 1 ml y agitar bien.
2)
Sacar los portas con el tejido del refrigerador para que alcancen la temperatura ambiente
(T.A.). Secar el agua condensada.
3)
Pipetear 25l de suero diluido sobre el corte, de modo que lo cubra totalmente (para Hep-2
y Crithidia pipetear 10µl).
4)
Incubar 30 minutos a T.A. en cámara húmeda en oscuridad.
5)
Sacar los portas de la cámara y lavar con PBS a chorro utilizando frasco lavador. Este paso
tiene la finalidad de eliminar el exceso de suero.
6)
Sumergir los portas en una cubeta, cubrir con PBS y añadir una gota de azul de Evans.
Dejar 5 minutos en agitación.
7)
Cambiar el PBS y dejar otros 5 minutos en agitación.
8)
Extraer los portas y secar el PBS alrededor de los cortes.
9)
Secar suavemente los cortes sin deteriorar el tejido ni desecarlo totalmente.
10)
Pipetear 25 l de antisuero anti Ig Humana fluoresceinado, previamente diluido en PBS 1%
BSA 0.1% azida sódica, cubriendo todo el tejido (para Hep-2 y Crithidia pipetear 10µl)
11)
Repetir los pasos 4 a 9.
12)
Añadir una gota de medio de montaje a cada corte.
13)
Cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio de fluorescencia.
6.- INTERPRETACIÓN
En los controles positivos deben apreciarse los patrones nucleares con una fluorescencia
intensa y bien delimitada, el resto del tejido aparecerá con un tono pardo rojizo dado por el
colorante de contraste (azul de Evans) y zonas con un tono verde claro mate por la fluorescencia de
fondo. En el control negativo se observarán los núcleos sin marcar y nos servirá para distinguir la
fluorescencia de fondo. En cada preparación debe hacerse un recorrido por múltiples campos.
Patrones nucleares (Hígado y Hep-2):
Homogéneo: Fluorescencia difusa cubriendo los núcleos. Los autoantígenos responsables
son DNA e histonas.
Periférico:
Anillo de fluorescencia delimitando la cara interna de la membrana nuclear.
Puede solaparse con el patrón homogéneo, aparentando un refuerzo de
fluorescencia en la periferia. El autoantígeno responsable es el DNA.
Moteado:
Los núcleos aparecen con un punteado, más o menos grueso, de
fluorescencia. Los autoantígenos son proteínas no histónicas y RNP.
Nucleolar:
La fluorescencia aparece concentrada en 1-5 puntos gruesos por célula. Los
autoantígenos responsables son rRNP
Patrón DNA (Crithidia):
Se observará fluorescencia en el núcleo y el cinetoplasto. No considerar la fluorescencia
inespecífica de los corpúsculos basales.
Músculo liso:
Se observará un patrón delimitando la muscularis mucosae del estómago y en las fibras
musculares de las paredes de los vasos, visibles especialmente en los cortes de riñón. Los
autoantígenos responsables son filamentos de F-actina.
Células parietales gástricas:
Se observará fluorescencia en el citoplasma de las células parietales y no en hígado o riñón.
Los autoantígenos responsables pueden ser ATPasa Na/H y factor intrínseco.