uso de herramientas biotecnológicas para acelerar el proceso de

USO DE HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA ACELERAR EL
PROCESO DE GENERACIÓN DE VARIEDADES DE SOYA RESISTENTES A
MOSQUITA BLANCA
Resumen ejecutivo
Este proyecto tuvo como fin contribuir a la resolución de este problema
utilizando
herramientas
de
biotecnología,
como
son
los
marcadores
moleculares, para generar nuevas variedades con resistencia genética a ese
insecto. Lo anterior, con dos propósitos: aumentar los rendimientos por unidad
de superficie y recuperar la superficie de siembra de esta leguminosa.
Este proyecto constó de tres etapas: a) identificación de marcadores
moleculares asociados a la resistencia a mosquita blanca o a otros factores de
estrés; b) identificación de progenitores donadores de los genes de resistencia,
y c) obtención de poblaciones segregantes.
Para la búsqueda y diseño de iniciadores la metodología consistió en:
búsqueda en la literatura mundial tanto en libros, revistas científicas y de
divulgación, publicaciones electrónicas, etc. además de consultar la base de
datos mundiales de secuencias de genes reportados en el NCBI, con el
objetivo de lograr la identificación de genes y marcadores genéticos
relacionados con la resistencia a mosquita blanca en soya o especies
relacionadas. Una vez concluida esta búsqueda se pasó al diseño de los
iniciadores que permitieran identificar, seguir y eventualmente aislar los genes
relacionados con la resistencia a estrés biótico. Se utilizó el programa
OligoAnalyzer de idtDNA para el diseño de los oligos y el Reverse Complement
de Bioinformatics para obtener complementos inversos.
Los parámetros que se tomaron en cuenta, para el diseño fueron los siguientes:
tamaño de oligonucleótidos iniciadores: 22-30 pb; tamaño del producto de
amplificación: 250-1200 pb; Tm (melting point): 35-65ºC; %CG: 40-60;
apareamiento en orquilla (hairpin): 4 máx.; autoapareamiento (self-dimer y
hetero-dimer): 4 máx.
Para el inicio de este proyecto se contó con 41 genotipos provenientes de los
programas de mejoramiento de soya del INIFAP de Sonora, Culiacán y
Tamaulipas.
Con el propósito de obtener plántulas sanas para la obtención del ADN de
calidad y concentración necesaria, primero se procedió con la siembra de las
diferentes variedades de soya en invernadero con el siguiente procedimiento:
a) las semillas fueron pretratadas previamente con etanol al 70% por 5 minutos
y con hipoclorito al 0.6% durante 15 minutos y fueron enjuagadas con agua
estéril; b) se sumergieron en solución de Ridomil a una concentración de 100
ppm durante 5 minutos; c) se sembraron 50 semillas de cada genotipo en
condiciones estériles. Una vez germinadas las plantas libres de patógenos
fueron trasplantadas a charolas con substrato estéril para obtener plántulas
sanas; d) se trasplantó la plántula después de una semana de sembrada a
macetas previamente lavadas y esterilizadas; e) se esperó entre dos y tres
semanas para realizar la colecta de tejido vegetal y realizar la extracción del
ADN. El aislamiento del ADN fue hecho de acuerdo al protocolo de extracción
de CTAB modificado por Porebski et al., (1997).
El ADN se cuantificó con la ayuda de un fluorómetro y se complementó con una
cuantificación visual; la metodología fue la siguiente: se coloca en un gel de
agarosa al 0.8 % cada uno de los ADN extraídos mezclados con un buffer de
carga (Orange G 6%), junto con 100 ng de ADN del fago λ que funciona como
referencia para la cuantificación. Este gel es corrido en una cámara de
electroforesis a 86 volts por 1.5 hrs. Transcurrido este tiempo se captura la
imagen del gel y se analizan los resultados por densitometría utilizando el
programa “1D Image Análisis” versión 3.0 de Kodak. Con base en los datos
obtenidos en la cuantificación, se uniformizan las concentraciones de todos los
ADN a una concentración conocida. Para comprobar la calidad y concentración
después de la extracción de ADN genómico se llevó a cabo una electroforesis
en gel de agarosa. Se seleccionaron como posibles marcadores y candidatos a
ser clonados y secuenciados, los oligonucleótidos que de manera consistente
amplificaron fragmentos únicos con diferentes patrones de movilidad
electroforética.
La selección de los progenitores se basó en los patrones electroforéticos
obtenidos de los productos de amplificación por PCR con oligonucleótidos
específicos a genes de tolerancia a insectos, mosquita blanca y productividad.
Se seleccionaron aquellos que presentaban la mayor cantidad de fragmentos
esperados y estos presentaban un nivel de polimorfismo lo suficientemente
informativo. La obtención de poblaciones segregantes se consiguió por medio
de cruzas entre los materiales molecularmente sobresalientes en cuanto a la
presencia de genes de resistencia. Se realizaron las cruzas reciprocas con el
fin de poder evaluar si existía algún efecto materno.
Demanda o problemática que atiende
Mediante el uso de herramientas biotecnológicas, generar nuevas variedades
de soya genéticamente resistentes a la mosquita blanca.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Identificación de marcadores moleculares asociados a la resistencia a mosquita
blanca o a otros factores de estrés.
Marcadores moleculares para selección asistida.
Identificación de progenitores donadores de los genes de resistencia.
Poblaciones segregantes con genes de resistencia piramidados, donde la
probabilidad de obtener una nueva variedad de soya resistente a mosquita
blanca es muy alta, probabilidad que se ve aumentada con el uso de los
marcadores moleculares obtenidos para llevar a cabo una eficiente selección
asistida.
Impactos
Los genotipos clasificados como tolerantes a mosquita blanca fueron: PI201422, Esperanza, PI-171443 y H98-1075; fueron los que presentaron un
mayor número de fragmentos amplificados con los iniciadores diseñados para
buscar secuencias relacionadas con la resistencia a mosquita blanca y otros
estreses bióticos.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
Este es un avance científico; no se puede estimar costos.
Ámbito de aplicación
Comunidad científica nacional.
Información adicional o comentario
La soya es originaria de china y es una leguminosa cuyo atributo más
importante es que puede ser un componente destacado en la dieta desde el
punto de vista funciona. Es la única legumbre que tiene los nueve aminoácidos
esenciales en la proporción correcta para la salud humana. Por lo tanto, la
proteína de soya está calificada como una proteína completa de alta calidad.
El principal problema entomológico de este cultivo en México es la mosquita
blanca (Bemisia argentifolii), debido a que la soya es uno de sus hospederos
preferidos, lo cual es un factor limitante y determinante en la reducción de la
superficie de siembra de esta leguminosa, ya que pasó de casi 250 mil ha en
1989 a 30 mil has actualmente; esto explica en parte la baja del rendimiento
que en el mismo periodo pasó de poco mas de 2.0 ton /ha a menos de1.2
ton/ha.
Clave del proyecto: SAGARPA 2005-C01-12235
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: soya; fitomejoramiento
Investigador: doctor MARIO M. GONZÁLEZ CHAVIRA
Institución: Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y
Pecuarias.