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Jornadas SAM – CONAMET – AAS 2001, Septiembre de 2001
1213-1220
ESTUDIOS FISICOQUÍMICOS SOBRE HIDROXIAPATITAS PARA
IMPLANTES DENTALES: MODIFICACIÓN DE LAS PROPIEDADES
SUPERFICIALES CON LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ SOLUBLE Y
SU RELACIÓN CON LA ADHESIÓN BACTERIANA.
1,2
2,3
J.M. Palacios , M.C. Apella , M.A. Blesa
1,4
1,5
y P.J. Morando
1
Unidad Actividad Química, Centro Atómico Constituyentes, CNEA, Avenida Gral. Paz
1499 (1650) San Martín Pcia de Bs As.
2
CERELA, Chacabuco 145, (4000) S. M. de Tucumán
3
Facultad de Ciencias Naturales, UNT, Miguel Lillo 205, (4000) S. M. de Tucumán
4
Escuela de Posgrado, UNSaM, Avda 52 No 3563 (1650) San Martín Pcia Bs As
5
Instituto de Tecnología “Jorge Sabato”, UNSaM, Avda Gral Paz 1499 (1650) San Martín
Pcia Bs As
RESUMEN
La utilización de biomateriales sintéticos plantea, además de las dificultades de
compatibilidad, el interrogante sobre el posterior comportamiento de los mismos en contacto
con los fluidos humorales normales y/o patógenos. En el caso de los implantes dentales los
materiales están en contacto con una solución compleja (la saliva) la cual es, además,
vehículo de bacterias. En este trabajo se analiza la influencia de la composición iónica del
vehículo (en especial su contenido en ion calcio) sobre algunas de las propiedades
electrocinéticas de hidroxiapatitas de distinto origen y como las mismas se manifiesta en la
adsorción bacteriana Se ha elegido el ion Ca2+ ya que el mismo es uno de los suplementos
dietarios mas utilizados en la alimentación moderna. Se presentan datos que demuestran que
concentraciones de Ca2+ del orden de 10-4 M ya alteran notablemente la carga superficial de
la hidroxiapatita. También se estudió la adhesión a partículas de HA de bacterias capaces de
provocar la formación de placa dental. Se muestran datos de adhesión de una cepa de
Streptococcus mutans, los mismos muestran que por agregado de Ca2+ en concentraciones del
orden o inferiores a las proporcionadas por un yogur comercial, la adhesión muestra un
incremento de entre un 20 y un 50% respecto al valor en ausencia de Ca2+.
Palabras claves
Hidroxiapatita, biomateriales, adhesión bacteriana, carga superficial, placa dental.
INTRODUCCIÓN
El desarrollo que ha tenido la ciencia de los biomateriales durante las dos últimas
décadas, involucra el sinergismo de grupos de investigación de diferentes áreas como la
medicina, odontología, biología, física, química e ingeniería, circunscribiendo dos grandes
áreas: la biotecnología y la bioingeniería. Uno de los principales estímulos que dieron lugar a
los avances de esta ciencia ha sido la necesidad de desarrollar materiales biocompatibles o sea
inertes con el medio fisiológico. Entre las diferentes aplicaciones de los biomateriales, se
encuentran las asociadas a la restauración de los tejidos duros del ser humano como resultado
de diversas patologías y traumatologías, y una de las vías correctivas empleadas recurre a
implantes con materiales sintéticos o semisintéticos que cumplan funciones de relleno, y que
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Palacios, Apella, Blesa y Morando
puedan dar origen a la reconstitución ósea. En la actualidad, se estudia la posibilidad de usar
materiales inorgánicos similares a la matriz ósea. Los tejidos duros, huesos y dientes, tienen
una estructura compleja en la que la fase inorgánica predominante guarda una estrecha
relación estructural y química con la hidroxiapatita cálcica, Ca10(PO4)6(OH)2[1]. Por esta
razón, entre los materiales usados en la restauración ósea se encuentran diversas
hidroxiapatitas, obtenidas por síntesis inorgánica, o por transformaciones de biomateriales
naturales como la coralina (carbonato de calcio) que proviene de formaciones de corales. La
hidroxiapatita es un material altamente insoluble en medios biológicos normales, por lo que es
común usar también precursores que se transforman en hidroxiapatita; de esta forma se
facilita la integración del material implantado a través de transformaciones de fase y
reacciones superficiales. Existe abundante bibliografía sobre las relaciones interfaciales entre
estos materiales y el tejido tisular y/ o bacteriano y se ha demostrado que la microestructura
del biomaterial influye notablemente sobre la capacidad de las células para orientarse, migrar
[2]
y producir arreglos organizados . Así, los materiales densos y microporosos con
propiedades diferentes son usados en problemas restaurativos específicos. Sin embargo, no
existe un estudio sistemático que vincule las propiedades superficiales de los mismos con
fenómenos relacionados a su comportamiento frente al medio natural. Los fenómenos de
colonización bacteriana han sido descriptos en la literatura en relación a la formación de
biopelículas, como en la placa dental. La formación de la misma reconoce cuatro etapas
solapadas en el tiempo que son i) formación de un depósito o adsorción; ii)adhesión o anclaje
irreversible de una célula en la superficie; iii) formación de multicapas: iv) crecimiento en
superficie con desarrollo de la biopelícula. Trabajos previos han demostrado que la afinidad
de HA por bacterias de la cavidad oral puede ser descripta mediante ecuaciones de Langmuir
y/o de Hill modificadas y que la misma no se modifica apreciablemente por su diferente
[3]
naturaleza química y morfológica . Por otra parte la naturaleza química del medio acuoso
resulta determinante en los procesos de adsorción-adhesión bacteriana con lo cual la
composición. de la saliva resulta ser un detalle no menor. La caracterización de las
interacciones se ve aún más dificultada por la incorporación en las dietas alimentarias de
iones determinantes del potencial superficial de la HA. Con el propósito de poder dilucidar el
fenómeno de adhesion se llevó a cabo una caracterización fisicoquímica de distintas muestras
de HA en condiciones fisiológicas y con agregado de Ca2+. En paralelo se estudió el
fenómeno de adhesión bacteriana sobre HA en presencia y ausencia del ion Ca2+ externo.
EXPERIMENTAL:
Materiales analizados: Se usaron HA provistas por el Instituto de Pesquisas Tecnológicas
[4]
de Sao Paulo, Brasil (Secklerita) , el Instituto de Ciencias de Materiales de Barcelona,
[5,6]
España (Rarita y Nano-Rarita) , por el Laboratorio de Biomateriales del Centro Nacional de
[7]
y el BIOMAT (Centro de Biomateriales,
Investigaciones Científicas (Gonzalita)
Universidad de La Habana) (Apafill G), La Habana, Cuba.
Caracterización estructural y espectroscópica: los difractogramas de RX de las muestras,
registrados entre 2θ = 20 y 70°, fueron obtenidos con un difractómetro Siemens D5000. Para
la realizacion del espectro de FTIR se utilizó la técnica de reflectancia difusa en un equipo
1
FTIR-ATR Nicolet Magna 560. El barrido fue realizado entre 600 y 4000 cm- .
Caracterización superficial: las determinaciones de las áreas específicas de las diferentes
HA se las realizaron a partir de la medición de las isotermas BET, en un equipo Micromeritics
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Jornadas SAM – CONAMET – AAS 2001
Acusorb.
Los potenciales zeta (ζ) se obtuvieron a partir de mediciones de movilidad
electroforética en solución acuosa. se utilizó un equipo Rank Brothers y se trabajo
manteniendo una fuerza iónica constante e igual a 0,01 mol dm-3 por agregado de cantidades
adecuadas de KNO3. Para explorar el efecto del ion Ca2+ se realizaron mediciones en
presencia de distintas concentraciones del mismo. Los diferentes valores de pH se ajustaron
con solución 0,1 N de HCl o NaOH según corresponda
Adhesión bacteriana:
Tratamiento de la HA: Se pesó 20 mg de HA y se lavó 3 veces con KNO3 (10-2 M), se
esterilizó en autoclave y se dejó equilibrar esta suspensión durante 15 h. Luego se separo el
sólido y se resuspendió en una solución estéril al 50 % de saliva.
Para los ensayos donde se evaluó la adhesión en presencia de Ca2+ se realizó idéntico
procedimiento pero se utilizó Ca(NO3)2 10-2M en un caso y 10-3 M en otro y se complemento
con concentración necesaria de KNO3 para mantener constante la fuerza iónica.
Ensayo de adhesión: la HA tratada fue puesta en contacto con un ml de una suspensión de S.
mutans (1,2 x 108 UFC/ml) durante 2 h. Luego se lavó 3 veces la HA con KNO3 (con el
contenido de Ca2+ correspondiente a cada caso).
Evaluación de la adhesión:
Absorbancia (560 nm): Se agregó 60 μl de HCl concentrado a las muestra de HA con
bacteria adherida para disolver la HA. Se agitó hasta disolución total del sólido. Se leyó
absorbancia.
Recuento microbiano: Cada muestra de HA con bacteria adherida se separó del
sobrenadante, se lavó (2 veces) en buffer correspondiente. Se resuspendió en un ml de medio
diluyente y mediante recuento en placas de Laptg agar (1 %), utilizando el método de
diluciones sucesivas, se determinó el número de microorganismos viables en la muestra.
Microscopía de fluorescencia: un cultivo de S. mutans de 12 hs lavado 2 veces con KNO3 ,
se llevó a una absorbancia igual a 560 nm de 0,4. Se centrifugó a (3000 rpm durante 10 min) y
se resuspendió en una solución de naranja de acridina 0,01%[8] (utilizando volumen original),
se dejó en contacto durante 2 a 3 minutos. Posteriormente se lavó la suspensión celular. Luego
se puso en contacto con la HA (2 h) y se procedió a lavar. Con ansa se tomó HA (con bacteria
adherida) y se esparció sobre un portaobjeto y después de el agregado de una gota de H2O
destilada se observó en microscopio bajo exposición de radiación (rango ultravioleta) para
evidenciar la fluorescencia de las bacterias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
Los resultados del análisis elemental confirmaron la naturaleza de las muestras. Todas, a
excepción de las nanoapatitas mostraron por difracción de RX una alta cristalinidad. Por otra
parte en los espectros de FTIR además de las bandas características de las vibraciones en HA,
se pueden observar bandas de baja intensidad en la región de 1400 a 1600 cm-1
correspondientes a los modos de vibración del grupo CO32- indicando una baja proporción de
carbonatoapatita. Las áreas BET mostraron una gran variación en clara correlación con los
métodos de síntesis abarcando un intervalo entre 143 (para nanorarita) y 0,1 (para coralina)
La Fig. 1 muestra a título de ejemplo las curvas de movilidades obtenidas para la rarita
(cuyo comportamiento es similar al de las demás muestras) y la nanorarita. Las diferencias
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Palacios, Apella, Blesa y Morando
observadas en la nanorarita se atribuyen al hecho que dada su baja cristalinidad y elevada área
superficial su comportamiento en condiciones más ácidas se aproxima más al equilibrio de
solubilidad.
30
Nano - rarita
20
10
0
-10
-20
3 dias - abierto a la atmosfera
3 dias - cerrado a la atmosfera
15 dias - abierto a la atmosfera
15 dias - cerrado a la atmosfera
-30
-40
-50
5
6
7
8
9
3 dias - abierto a la atmosfera
3 dias - cerrado a la atmosfera
15 dias - abierto a la atmosfera
15 dias - cerrado a la atmosfera
20
Potencial Zeta (mV)
Potencial Zeta (mV)
30
10
0
-10
-20
-30
-40
Rarita
-50
10
11
5
pH
6
7
8
9
10
11
pH
Figura 1: Curvas de potencial zeta (ζ) de las HA. Se muestran las mediciones realizadas a
distintos tiempos de envejecimiento. Las experiencias se las realizó en 2
condiciones: abierta y cerrada a la atmósfera.
En estas condiciones, los equilibrios protolíticos de PO43- y OH- generan un medio
acuoso adecuado para definir cargas superficiales positivas por adsorción del Ca2+
proveniente de la disolución. En apoyo de esta conclusión se puede mencionar: (a) la forma
de la curva se aproxima a la de la calcita, caso en el que se ha demostrado la operación del
equilibrio de solubilidad; (b) los valores de ζ en los medios más ácidos indican un nivel de
Ca2+ disuelto importante, similar al previsto por el equilibrio de solubilidad. De cualquier
manera, el grado de aproximación al equilibrio es mayor a pH bajo que a pH alto. A la luz de
la importante influencia que mostraba tener el Ca2+ en las propiedades electrocinéticas de las
HA, se realizaron mediciones de ζ en presencia de este catión en solución. La Fig. 2 muestra
que el agregado de este catión induce a que las partículas se carguen en forma positiva
encontrándose una relación directa entre los valores de movilidad de las mismas y la cantidad
de Ca2+ agregado. En el caso de nano-rarita (Fig. 2B) los desplazamientos del ζ con log
[Ca2+]agregado a bajos tiempos de envejecimiento, son aproximadamente lineales (del orden de
10 mV/década) en el intervalo de pH 5,5 - 8. Este comportamiento implica una respuesta
nernstiana de la superficie a la actividad de Ca2+ en solución A tiempos de envejecimiento
mayores, se observa un incremento de ζ asociado con el aumento de la concentración de Ca2+
disuelto, y un efecto compensador del incremento de la fuerza iónica a valores bajos de pH.
Adviértase que estos experimentos se realizaron con relaciones “número de moles de calcio
agregados/área superficial disponible” (2x10-6 moles. m-2) relativamente bajas.
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A
30
45
15
0
 [Ca2+] 10-2M ; 15 días
◊ [Ca2+] 10-3M ; 15 días
 [Ca2+] 5x10-4M ; 15 días
 [Ca2+] 10-2M ; 3 días
⟨ [Ca2+] 10-3M ; 3 días
⌡ [Ca2+] 5x10-4M ; 3 días
-15
-30
-45
5
6
7
8
9
10
11
Potencial Zeta (mV)
Potencial Zeta (mV)
45
30
15
0
-15
 [Ca2+] 10-2M ; 15 días
◊ [Ca2+] 10-3M ; 15 días
 [Ca2+] 5x10-4M ; 15 días
 [Ca2+] 10-2M ; 3 días
⟨ [Ca2+] 10-3M ; 3 días
⌡ [Ca2+] 5x10-4M ; 3 días
-30
-45
pH
5
6
7
8
9
10
11
pH
Figura 2: Curvas de potencial zeta (ζ) de rarita (A) y nano-rarita (B), en presencia de
diferentes concentraciones de Ca2+ en el sobrenadante. Las mediciones fueron
realizadas a distintos tiempos de envejecimiento.
Estos resultados ponen de manifiesto la importancia de analizar la influencia que pueda
tener el ion calcio en la adhesión bacteriana y en la formación, por ejemplo, de una placa
dental en un implante. Para estudiar esa posibilidad se determinó la adhesión de S. mutans
sobre suspensiones de HA en saliva con y sin el agregado de ion Ca2+. Se trabajó con una
muestra de “rarita’ de las caracterizadas anteriormente y la Fig. 3 da cuenta de la fijación de
las bacterias sobre la misma.
Figura 3: adhesión de S. mutans a rarita observada mediante microscopia de
fluorescencia. Las bacterias fueron marcadas con naranja de acridina
En presencia de iones Ca2+, la adhesión se ve favorecida como se puede observar en las
Fig. 4A y 4B. En las mismas se presentan respectivamente los valores de absorbancia y el
recuento de bacterias adheridas en distintas condiciones experimentales. La excelente
concordancia observada por los dos métodos utilizados para determinar el grado de adhesión
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Palacios, Apella, Blesa y Morando
1 .0
0 .8
KNO3
2,0x10
-3
C a (N O 3)2 1 0 M
KN O 3
-2
C a (N O 3)2 1 0 M
0 .6
0 .4
8
A
UFC/m l
A b s o rb a n c ia (5 6 0 n m )
certifica los resultados, al tiempo que resulta una validación del método de las densidades
ópticas (más sencillo) para su aplicación como único método.
0 .2
1,6x10
8
1,2x10
8
8,0x10
7
4,0x10
7
B
-3
C a(N O 3 ) 2 10 M
-2
C a(N O 3 ) 2 10 M
0,0
0 .0
Figuras4: A): Medidas de absorbancia que evidencian la adhesión de S. mutans a rarita
bajo diferentes concentraciones de agregados de ion Ca2+. B) Evaluación de la
adhesión de S. mutans a rarita (con diferentes concentraciones de agregados de
ion Ca2+) mediante recuento en Laptg agar
El análisis de los datos obtenidos permite afirmar que concentraciones del orden de 10-3
M de Ca 2+ provocan un aumento del orden de un 50% en la adhesión bacteriana. Si bien el
menor efecto observado al aumentar mas aún la concentración de Ca2+ deberá ser estudiado,
(podrían, por ejemplo, existir interacciones del ion con la membrana celular) el mismo sigue
siendo claramente mayor al obtenido en ausencia de Ca2+. Próximamente se comenzará a
estudiar el comportamiento de las propiedades electrocinéticas de las bacterias en las distintas
condiciones de trabajo. A partir de ello se habrá completado el análisis de todas las
interacciones y se estará en condiciones de postular un modelo general de comportamiento.
CONCLUSIONES
Se caracterizaron distintas muestras de HA sintetizadas por distintas vías observándose
(como era de esperar) marcadas diferencias en las propiedades superficiales de las
nanoapatitas.
Se encontró un patrón general de la influencia del agregado del ion Ca2+ en las
propiedades electrocinéticas mostrando un aumento en la carga positiva de las superficies
Se encontró que la cepa S. mutans se adhiere claramente sobre la HA en medios
fisiológicos.
Se demostró que esa adhesión aumenta por el agregado de ion Ca2+ externo, lo cual
podría aumentar las posibilidades de formación de placa dental
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REFERENCIAS
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573-588. 1999.
3. V.M. Hidalgo, E.M. Berardinelli, M.A. Blesa, M.C. Apella. Dentunm, 2, 9-13. 1999
4. F.B. Legracie, M.M. Seckler, S. Derenzo, M. Danese. Anais do XXII Congreso Brasileiro
de Sistemas Particulados, Maringa, Brasil, 855-862. 1995
5. A. López-Macipe, R. Rodríguez Clemente, A. Hidalgo-López, I. Arita, M.V. GarcíaGarduño,E. Rivera, V.M. Castaño. J. Mater. Synt. Proces., 6, 21-26. 1998.
6. A. López-Macipe, J. Gomez-Morales, R. Rodríguez Clemente. Adv. Mater., 10, 49-53.
1998.
7. R. González, M.C. Melo, A. Perz, A.C. Rodriguez. Quim. Nova, 16, 509-512. 1993.
8. D. Verrier, B. Mortier, G. Albagnac. Biotechnology Letters, 9, 735-740. 1987.
AGRADECIMIENTOS
Financiado por CONICET, ANPCYT, UNT, y CNEA. PJM, MCA y MAB son
miembros de CONICET. JP es becario posdoctoral del CONICET.
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