CAM 2

Identificación y caracterización
funcional de sistemas génicos
implicados en la homeostasis de
níquel en Rhizobium
leguminosarum bv. viciae
II Reunión Microambiente
“La Cristalera”, Miraflores de la Sierra
Recuperación ambiental
Laura Rubio-Sanz,
Rosabel Prieto,
Jose Manuel Palacios,
Belén Brito.
1
Sistema de oxidación de hidrógeno en Rhizobiaceae
Transportador de Ni para
síntesis de la hidrogenasa
Análisis homeostasis Ni en
R.Leguminosarum UPM791
2
Objetivos

Caracterización
de
la
resistencia
a
altas
concentraciones a níquel y cobalto en cepas de
Rhizobium leguminosarum

Identificación de sistemas génicos implicados en la
resistencia a níquel en Rhizobium leguminosarum.

Estudio del papel de estos mecanismos de resistencia
a níquel en los estados simbióticos y rizosférico de
Rhizobium leguminosarum.
3
Caracterización de la resistencia a altas concentraciones
a níquel en cepas de Rhizobium leguminosarum aisladas
de suelos ultramáficos y contaminados
CEPA
FENOTIPO
Hup
ORIGEN
UPM1131
+
Ultramáfico (Italia)
UPM1132
+
Ultramáfico (Italia)
UPM1133
+
Ultramáfico (Italia)
UPM1134
+
Ultramáfico (Italia)
UPM1135
+
Contaminado (Alemania)
UPM1136
-
Ultramáfico (Italia)
UPM1137
-
Ultramáfico (Italia)
UPM1138
-
Ultramáfico (Italia)
UPM1139
-
Ultramáfico (Italia)
UPM1140
-
Contaminado (Alemania)
UPM1141
-
Contaminado (Alemania)
UPM1142
-
Contaminado (Alemania)
4
Caracterización de los niveles de resistencia a Ni y Co
Cepas
UPM1137
UPM1136
Concentración
Inhibitoria Mínima (mM)
Diámetro de inhibición
(mm)*
NiCl2
CoCl2
NiCl2
CoCl2
UPM1131
1
0.5
20
20
UPM1132
2
0.75
18
26
UPM1133
2
0.75
16
18
UPM1134
2
0.75
18
16
UPM1135
1.5
0.5
16
22
UPM1136
1
0.25
26
26
UPM1137
2.5
1
11
13
UPM1138
1
0.25
22
26
UPM1139
2
0.75
14
24
UPM1140
1.5
0.5
17
18
UPM1141
1
0.75
22
20
UPM1142
1
1
22
15
3841
1.5
0.75
20
20
5
*NiCl2 200 mM; CoCl2 100 mM
Mecanismos moleculares implicados en la resistencia a Ni
Obtención de una colección de mutantes sensibles a Ni
mediante mutagénesis aleatoria con mTn5
• 4313 transconjugantes
• 16 mutantes sensibles NiCl2
TY
TY + 1,5 mM NiCl2
6
Código
mutante
Ortologo en
R.leg bv.
viciae
3841
Proteina
(aa)
Función deducida
(Nombre gen)
UPM1137
-
-
13
RL2862
403
Diámetro de inhibición
(mm)
Fenotipo
Nod
Fenotipo
Fix
% NT
13
+
+
4.05
13
16
-
-
1.41
proteina ribosoma 30s S1
(rpsA)
16
20
+
-
1.60
258
Adenilato /guanilato ciclasa
16
16
+
+
3.72
RL2322
213
Proteína hipotética
18
22
+
+
4.10
2.2.50.
RL1351
323
Sistema de salida de
cationes (rcnA)
13
30
+
+
4.13
3.4.66.
RL4539
253
Proteína C exportadora
grupo hemo (ccmC)
20
16
+
-
2.14
3.5.61.
RL2906
330
Dihidroxiacetona quinasa
(dhaK)
17
16
+
+
4.09
3.7.64.
RL3560
252
Metionina aminopeptidasa
(map)
14
16
+
+
3.94
4.2.39.
pRL90287
303
Proteína reguladora
transcripcional familia AraC
15
16
+
-
1.85
4.6.32.
RL4188
230
Proteína secretada
22
21
+
+
3.86
4.7.19.
RL2793
363
Componente unión ATP.
Transportador ABC
14
16
+
+
4.45
4.7.37.
RL4297
293
foldase/peptidil-prolil cistrans isomerasa
12
18
+
+
3.88
5.2.17.
RL0615
161
Arsenato reductasa
16
16
+
+
3.97
5.4.51.
RL1589
211
Proteína de membrana
ropB
19
20
+
+
4.45
6.4.26.
pRL110071
276
Proteína hipotética
conservada
16
24
+
+
3.68
7.1.12.
SMa0403
462
Proteína hipotética
16
16
+
+
4.10
NiCl2
(200 mM)
CoCl2
(100 mM)
Cepa parental
11
318
Proteína hipotética
conservada exportadora
RL0106
567
2.2.42.
RL2953
2.2.48.
7
Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum

Sistema de salida de Ni y Co en E.coli.
 Cadena arriba rcnR que codifica un represor que controla
la expresión de rcnA.
R.leguminosarum 3841
R.leguminosarum UPM791 SPF25
Diheme
cytochrome C
Acetyl
transferase
Glutathion
S-transferase
rcnR rcnA
Exported
-lactamase
Glucose
dehydrogenase
Generación de un mutante rcnRA en SPF25
8
Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum
Niveles de resistencia a Ni y Co
A
0,9
0,8
Concentración inhibitoria mínima (mM)
Genotipo
NiCl2
CoCl2
ZnCl2
CuSO4
SPF25
wt
1
0,75
2
2
ΔrcnRA
rcn-
0,75
0,3
2
2
0,7
DO600
Cepa
No metal added
1,0
0,6
SPF25
0,5
UPM1137
wt
2,5
1
ND
ND
0,4
2250
rcn-
1,5
0,4
ND
ND
0,3
rcnRA
0,2
0,1
0,0
0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96
Time (hours)
B
500 M NiCl2
0,8
C
0,8
0,7
0,7
0,6
0,5
DO600
DO600
0,6
0,4
0,3
0,5
0,4
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,0
200 M CoCl2
0,9
0,0
0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96
Time (hours)
0
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96
Time (hours)
9
Análisis funcional del sistema RcnRA en R. leguminosarum
Interacción con planta
Nitrógeno total en planta
Guisante
Lenteja
0
Ni
Co
Control
0
Ni
Co
Control
SPF25
4.15
3.83
3.93
1.14
2.66
2.51
2.54
1.17
rcnRA
3.98
3.93
3.83
1.14
2.66
2.66
2.59
1.17
Actividad hidrogenasa en bacteroides
Bacteroides guisante
1400
Hydrogenase activity
Hydrogenase activity
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
Bacteroides lenteja
1200
SPF25
1000
rcnRA
800
600
400
200
1000
0
0
No Metal
NiCl2
CoCl2
No Metal
NiCl2
CoCl2
10
Expresión génica del operón rcnRA en R. leguminosarum SPF25 / Δ15
Análisis de la expresión génica del operón
rcnRA en R. leguminosarum SPF25.
prcnRA
lacZ
prcnR prcnA
Diheme
cytochrome C
Acetyl
transferase
rcnR rcnA
Glutathion
S-transferase
rcnR::lacZ
R
Glucose
dehydrogenase
rcnA::lacZ
R
A
Tc
Exported
-lactamase
Tc
rcnRA::lacZ
A
Tc
11
Expresión génica del operón rcnRA en R. leguminosarum SPF25
prcnRA1
-galactosidase activity
A
B
prcnR
6000
12000
5000
10000
4000
8000
3000
6000
2000
4000
1000
2000
0
prcnA
0
0
100
200
M NiCl2
300
400
500
0
10
20
30
40
50
M CoCl2
12
Conclusiones

La cepa UPM1137, aislada de suelos ultramáficos de Italia, es
capaz de resistir elevadas concentraciones de níquel y cobalto en el
medio.

Mediante mutagénesis aleatoria de la cepa UPM1137 se han
identificado 16 mutantes afectados en la resistencia a níquel. Siete
de los mutantes se encuentran también afectados en la resistencia
a cobalto.

El sistema RcnRA es un sistema de salida de níquel-cobalto en R.
leguminosarum bv. viciae y está implicado en la resistencia a
ambos metales.

Los genes rcnRA están organizados como un operón que se
transcribe desde un promotor localizado cadena arriba del gen
rcnR.

La expresión de los genes rcnRA es inducible por níquel y cobalto. 13