UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS Grupo de Investigación enotecUPM Utilización de bloqueadores metabólicos y optimización de las condiciones de aplicación para la reducción del grado alcohólico en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas. TESIS DOCTORAL PRESENTA RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA DIRECTOR ANTONIO MORATA BARRADO Madrid, 2013 ii UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS ANTONIO MORATA BARRADO, Profesor Titular de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid. CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación titulado “Utilización de bloqueadores metabólicos y optimización de las condiciones de aplicación para la reducción del grado alcohólico en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas”, que constituye la Tesis presentada por D. RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA para optar al Grado de Doctor en Ciencia, Tecnología e Ingeniería de Alimentos, ha sido desarrollado bajo mi dirección en el Departamento de Tecnología de Alimentos de la E.T.S.I. Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid. Madrid, a 06 de Noviembre del 2013 Fdo.: ANTONIO MORATA BARRADO i ii DECLARACIÓN JURADA Declaro por la presente que la Tesis Doctoral titulada “Utilización de bloqueadores metabólicos y optimización de las condiciones de aplicación para la reducción del grado alcohólico en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas”, presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencia, Tecnología e Ingeniería de Alimentos: - Ha sido elaborada completamente por mi persona, sin ninguna ayuda inadmisible y sin el uso de otras fuentes que no sean aquellas mencionadas en las referencias bibliográficas. - Que todas las personas e instituciones de las cuales he recibido colaboración directa o indirecta en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, han sido debidamente agradecidas y mencionadas. - Que la presente Tesis Doctoral no ha sido, ni de forma parcial ni en su totalidad, sometida a ningún tipo de evaluación para obtener Título académico alguno, en ninguna otra institución que no sea la Universidad Politécnica de Madrid. Madrid, a 06 de Noviembre del 2013 Fdo.: RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA iii iv RESUMEN El presente trabajo de Tesis describe la posibilidad de modular la fermentación alcohólica utilizando bloqueadores metabólicos como furfural, o-vainillina, ácido cinámico, glicolaldehído, p-benzoquinona y cobre; para controlar la producción de etanol. El redireccionamiento de la ruta glicolítica en Saccharomyces cerevisiae favorece el descenso del grado alcohólico gracias al aumento de la producción de metabolitos secundarios de interés enológico. La primera parte de la Tesis presenta una revisión bibliográfica sobre estudios previos en los que se ha evaluado el efecto de los diferentes bloqueadores metabólicos en la producción de etanol durante la fermentación alcohólica. La segunda parte muestra los resultados experimentales de producción de etanol obtenidos con los bloqueadores metabólicos, observándose una amplia variabilidad en su efecto en función de la naturaleza química de cada bloqueador y de la naturaleza del medio fermentativo utilizado. Finalmente, la tercera parte del trabajo muestra el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos y la producción de metabolitos secundarios, observándose un importante efecto en la producción de glicerina y en algunos de los compuestos volátiles fermentativos. La principal aplicación de esta tecnología basada en la utilización de bloqueadores metabólicos sería la elaboración de vinos con una menor graduación alcohólica a partir de uva procedente de zonas cálidas. PALABRAS CLAVE: Bloqueadores metabólicos, inhibidores metabólicos, vinos con bajo grado alcohólico. v vi SUMMARY This thesis describes the possibility of modulating the alcoholic fermentation using metabolic blockers such as furfural, o-vanillin, cinnamic acid, glycolaldehyde, pbenzoquinone and copper. The controlled production of ethanol by redirecting of the glycolytic pathway in Saccharomyces cerevisiae, is achieved through diverting some of the carbohydrates away from alcohol production into the formation of glycolytic intermediates of interest to the winemaking industry. The first part of this work shows a literature review on previous studies about the effect of different metabolic blockers in order to reduce the ethanol production during alcoholic fermentation. The second part deals about the experimental results of ethanol production obtained with the metabolic blockers, showing a wide variation in the inhibitory effect depending on the chemical nature of each blocker and the nature of the fermentation medium used. Finally, the third part discussed about the effect of the metabolic blockers on colorimetric parameters and production of secondary metabolites, showing a significant effect on the production of glycerol and in some of the volatile fermentative compounds. The main application of this technology based on the use of metabolic blockers could lie in the preparation of reduced-alcohol wines from grapes grown in hot climate regions. KEY WORDS: Metabolic blockers, metabolic inhibitors, reduced-alcohol wines, lowalcohol wines. vii viii PUBLICACIONES Artículos en revistas SCI - Vejarano, R.; Morata, A.; Loira, I.; González, M.C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Theoretical considerations about usage of metabolic inhibitors as possible alternative to reduce alcohol content of wines from hot areas. European Food Research and Technology, 237(3): 281-290. - Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Ricardo-da-Silva, J.M.; Laureano, O.; González, M.C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Effect of Saccharomyces strains on the quality of red wines aged on lees. Food Chemistry, 139: 1044–1051. - Morata, A.; Vejarano, R.; Ridolfi, G.; Benito, S.; Palomero, F.; Uthurry, C.; Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Reduction of 4-ethylphenol production in red wines using HCDC+ yeasts and cinnamyl esterases. Enzyme and Microbial Technology, 52(2): 99-104. - Ábalos, D.; Vejarano, R.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). The use of furfural as a metabolic inhibitor for reducing the alcohol content of model wines. European Food Research and Technology, 232: 663 – 669. Congresos internacionales - Morata, A.; Vejarano, R.; Benito, S.; Palomero, F.; González, C.; Tesfaye, W.; Uthurry, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Reduction of 4-ethylphenol contents in red wines using HCDC yeasts and cinnamyl esterases. XXXVI World Congress of Vine and Wine (OIV). 2nd–7th June. Bucharest, Romania. ISBN 979-10-91799-16-4. POSTER. - Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Cuerda, R.; González, C.; Calderón, F.; SuárezLepe, J.A. (2013). Industrial scale application of the ageing-on-lees technique to improve the sensory quality of red wine. XXXVI World Congress of Vine and Wine (OIV). 2nd–7th June. Bucharest, Romania. ISBN 979-10-91799-16-4. POSTER. ix - Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Cuerda, R.; Awad, A.; González, C.; SuárezLepe, J.A. (2012). Effect of Saccharomyces strain on the quality of red wines aged on lees. XXXV World Congress of Vine and Wine (OIV). 18–22th June. Izmir, Turkey. ISBN 979-10-91799-00-3. POSTER. - Vejarano, R.; Loira, I.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2012). Use of metabolic blockers and non-Saccharomyces yeasts in sequential fermentation to reduce the alcohol content of wine. XXXV World Congress of Vine and Wine (OIV). 18–22th June. Izmir, Turkey. ISBN 979-10-91799-00-3. COMUNICATION. - Vejarano, R.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). Furfural as a metabolic inhibitor for reducing the alcohol content of wines. XXXIV World Congress of Vine and Wine (OIV). 20–27th June. Porto, Portugal. ISBN 978-989-202449-3. POSTER. Congresos nacionales - Morata, A.; Tesfaye, W.; Uthurry, C.; González, C.; Calderón, F.; Palomero, F.; Benito, S.; Loira, I; Vejarano, R.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Empleo de noSaccharomyces para incrementar la formación de pigmentos piranoantociánicos durante la fermentación. XII Congreso Nacional de Investigación Enológica (GIENOL). 18-21 Junio. Madrid, España. PÓSTER. - Loira, I; Vejarano, R.; Morata, A.; Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). Control de grado alcohólico en zonas cálidas mediante el empleo de levaduras seleccionadas con ineficiencia glicolítica y bloqueadores metabólicos. XI Congreso Nacional de Investigación Enológica (GIENOL). 01-03 Junio. Jerez de la Frontera, España. POSTER. - Vejarano, R.; Morata, A.; Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). El furfural como inhibidor metabólico para reducir el grado alcohólico en vinos. Reunión anual de Grupos de Trabajo en Viticultura y Enología (GTVE). España. COMUNICACIÓN. x El presente trabajo de Tesis se ha desarrollado en el marco del Proyecto de Investigación: “Técnicas vitícolas y enológicas para la regulación del equilibrio alcohol/acidez y protección del color en vinos tintos” Proyecto AGL-2008-05603-C02-01/AGR. Ministerio de Ciencia e Innovación de España (MICINN). I.P. José Antonio Suárez-Lepe. En el desarrollo de la primera parte de la Tesis, el doctorando ha contado con una beca predoctoral obtenida en virtud del Convenio de colaboración entre la Universidad Politécnica de Madrid y la Fundación del Banco Santander, para el periodo comprendido entre el 01 de mayo y el 31 de diciembre del 2010. xi xii AGRADECIMIENTOS Una Tesis Doctoral requiere mucha dedicación, perseverancia y paciencia con los resultados. El investigar implica tener una mente siempre abierta ante las posibilidades que nos ofrece la realidad, a despertar dudas de si lo hasta ahora conocido es lo definitivo o hay algo más por descubrir. Es por ello que el desarrollar esta Tesis me ha permitido aprender muchas cosas que posiblemente no lo hubiese hecho en otras circunstancias, tanto a nivel académico como personal. En el Departamento de Tecnología de Alimentos me dieron la oportunidad de formar parte del Grupo de Investigación en Enología, Enotecnia y Biotecnología Enológica (enotecUPM). Por ello debo expresar mi eterna gratitud a los dos profesores que me dieron esa oportunidad, al Director del Grupo de Investigación, el profesor José Antonio Suárez-Lepe, y a mi Director de Tesis, el profesor Antonio Morata Barrado. Expreso también mi gratitud a los profesores Fernando Calderón, María del Carmen González, María Jesús Callejo, Guillermo Rodríguez, Santiago Benito, Felipe Palomero, José Antonio Muñoz, y mención especial para los profesores Wendu Tesfaye y Carlos Uthurry, con quienes a diario comparto diversos temas de conversación, además de anécdotas y bromas que nos arrancan de vez en cuando una carcajada. Debo expresar algo más que gratitud por todos los momentos compartidos, por esa amistad, por todo lo que me han enseñado y ayudado. Mi gratitud a mis compañeras, Iris Loira y Susana Somolinos, con quienes he aprendido mucho sobre enología, gracias chicas. xiii Al personal laboral del Departamento, a Belén Cifuentes, Juan Antonio Sánchez, José Antonio Navarro, Francisco Manzano, Ana Sáez; porque siempre han mostrado predisposición cuando he necesitado su valioso apoyo. Igualmente agradezco la amistad compartida con muchos becarios que han pasado por el Departamento, a Isabel, Ignacio Antón (Nacho), Diego Ábalos, Cristina, Pietro, Giovanni, Paolo, Isik, Noam, Lan Liu. Agradezco también a Bodegas y Viñedos Comenge S.A. (Curiel del Duero, España) y a Lallemand España, por la colaboración que siempre han brindado al Grupo de Investigación en el desarrollo de los diferentes trabajos de investigación. A todos, gracias. xiv DEDICATORIA A mi familia en Perú, que a pesar de no tenerles junto a mí, siempre me han brindado ese ánimo y ese cariño que me dan fuerzas para seguir adelante. A mi madre Salomé Mantilla y mi abuela Justa Sánchez, mis viejitas. Porque a ustedes les debo todo en la vida. xv xvi PREÁMBULO Es bien conocida la problemática asociada al aumento de las temperaturas en diferentes regiones del mundo, especialmente en las cuales se producen cultivos destinados a la alimentación humana, sean para uso directo o para elaborar otros alimentos como es el caso del vino. Ello ha dado lugar a que la comunidad científica busque alternativas que permitan paliar los efectos del aumento de las temperaturas, más aún acentuado por el cambio climático. Es en dicho contexto que se ha desarrollado la presente Tesis Doctoral, con el propósito de evaluar una alternativa mediante la cual, utilizando diferentes sustancias como bloqueadores metabólicos de la fermentación alcohólica, se pueda reducir el grado alcohólico de los vinos, especialmente los elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas, en las cuales la alta producción y acumulación de azúcares durante la maduración dan lugar a un contenido alcohólico alto y desequilibrios en la relación alcohol/acidez, conduciendo a vinos sin una adecuada estabilidad fisicoquímica y poco agradables desde el punto de vista sensorial. Además del hecho de que cada vez aumenta la demanda por vinos con menor grado alcohólico por parte de los consumidores. El trabajo se ha realizado de manera experimental, estudiando en primer lugar el efecto de diferentes bloqueadores metabólicos como el furfural, o-vainillina, ácido transcinámico, glicolaldehído, p-benzoquinona y cobre, sobre la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae, en diferentes medios fermentativos y diferentes condiciones de fermentación, condiciones que se han reproducido en base a los diferentes parámetros tecnológicos propios de la elaboración del vino, obteniéndose resultados con una amplia variabilidad determinada por la naturaleza química de cada bloqueador utilizado. De xvii todas estas sustancias, la bibliografía reporta que únicamente el cobre ha sido evaluado en estudios previos de fermentaciones con mostos, mientras que para los otros bloqueadores metabólicos, no se tiene constancia que hayan sido estudiados en el contexto de la elaboración de vinos, lo cual conlleva a este trabajo de investigación a abrir nuevas perspectivas en la búsqueda de alternativas que permitan controlar el grado alcohólico en zonas cálidas. La otra parte experimental de la Tesis recoge los resultados del efecto de los bloqueadores metabólicos sobre las repercusiones de su utilización en la producción de metabolitos que por su naturaleza constituyen una importante fracción en la composición del vino y en sus características organolépticas, como son la glicerina y los compuestos volátiles de origen fermentativo como acetaldehído, ésteres, alcoholes y cetonas; además de presentar los resultados del efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos en vinos tintos. xviii ÍNDICE GENERAL CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ..................................................................................................1 I.1. LAS ALTAS TEMPERATURAS Y SUS EFECTOS EN EL CULTIVO DE LA VID ................................3 I.1.1. El cambio climático ............................................................................................................3 I.1.2. Efecto de las altas temperaturas sobre la composición de la uva ......................................5 I.1.3. Efectos sobre el pH y estabilidad del vino..........................................................................6 I.1.4. El etanol y su influencia en el perfil aromático del vino ....................................................7 I.2. TÉCNICAS APLICADAS PARA REDUCIR EL GRADO ALCOHÓLICO EN EL VINO ........................9 I.2.1. Etapa prefermentativa: a nivel de mosto ..........................................................................11 I.2.2. Etapa postfermentativa: a nivel de vino elaborado ..........................................................12 I.2.3. Etapa de fermentación alcohólica ....................................................................................12 I.3. BLOQUEADORES METABÓLICOS PARA REDUCIR LA PRODUCCIÓN DE ETANOL DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA EN VINOS ..................................................................................... 18 I.3.1. Compuestos furánicos .....................................................................................................19 I.3.1.1. Furfural .....................................................................................................................20 I.3.1.2. Efecto inhibitorio del furfural ...................................................................................21 I.3.2. Compuestos vainíllicos ....................................................................................................27 I.3.2.1. Efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos ......................................................27 I.3.2.2. Efecto inhibitorio de la vainillina y o-vainillina .......................................................30 I.3.3. Glicolaldehído..................................................................................................................33 I.3.3.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído.........................................................................34 I.3.4. Quinonas..........................................................................................................................37 I.3.4.1. Efecto inhibitorio de las quinonas .............................................................................38 I.3.5. Ácido cinámico ................................................................................................................41 I.3.5.1. Efecto inhibitorio del ácido cinámico .......................................................................42 I.3.6. Otros ácidos orgánicos ....................................................................................................47 I.3.6.1. Efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos ................................................................47 I.3.7. Metales .............................................................................................................................49 I.3.7.1. El cobre .....................................................................................................................49 I.3.7.2. Efecto inhibitorio del cobre.......................................................................................50 CAPÍTULO II: OBJETIVOS ........................................................................................................55 II.1. OBJETIVO GENERAL.................................................................................................................57 II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..........................................................................................................57 xix CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................59 III.1. CEPAS DE LEVADURAS UTILIZADAS ....................................................................................61 III.2. MEDIOS DE FERMENTACIÓN ................................................................................................61 III.3. BLOQUEADORES METABÓLICOS UTILIZADOS ....................................................................62 III.4. FERMENTACIONES ...............................................................................................................62 III.5. ANÁLISIS REALIZADOS TRAS LAS FERMENTACIONES ........................................................64 III.5.1. Determinación del grado alcohólico .............................................................................64 III.5.2. Determinación de azúcares residuales y glicerina ........................................................64 III.5.3. Parámetros colorimétricos ............................................................................................65 III.5.4. Determinación de la acidez volátil ................................................................................65 III.5.5. Análisis de compuestos volátiles de origen fermentativo ..............................................66 III.5.6. Análisis de los bloqueadores metabólicos y sus derivados tras las fermentaciones......67 III.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................................68 CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................69 IV.1. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS SOBRE EL GRADO ALCOHÓLICO ..........70 IV.1.1. Efecto inhibitorio del furfural ......................................................................................71 IV.1.1.1. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP ...............................................................................................................71 IV.1.1.2. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de furfural sobre diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae en un medio sintético con alto contenido de azúcar ...................73 IV.1.1.3. Efecto inhibitorio del furfural sobre diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae y evaluación del momento óptimo de adición en un medio sintético con alto contenido de azúcar ....................................................................................................................................81 IV.1.1.4. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto inhibitorio del furfural en un medio sintético con altas concentraciones de azúcar ............................................................83 IV.1.1.5. Efecto inhibitorio de altas dosis iniciales de furfural y conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético ...........................................................................................85 IV.1.1.6. Efecto inhibitorio de altas concentraciones de furfural dosificadas en fase de crecimiento exponencial y conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético ............90 IV.1.1.7. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado.................................................................................................................95 IV.1.2. Efecto inhibitorio de la o-vainillina .............................................................................99 IV.1.2.1. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético con alto contenido de azúcares ............................................................................................ 100 IV.1.2.2. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio sintético ....................................................................... 102 IV.1.2.3. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con alto contenido de azúcares ............................................................................................................................... 104 IV.1.2.4. Conversión enzimática de la o-vainillina y el furfural en sus respectivos derivados por la levadura Saccharomyces cerevisiae a diferentes momentos de dosificación en mosto tinto ..................................................................................................................................... 108 IV.1.2.4.1. Dosificaciones al inicio de las fermentaciones ............................................. 110 IV.1.2.4.2. Dosificaciones al finalizar la fase de crecimiento exponencial .................... 111 xx IV.1.3. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico............................................................... 115 IV.1.3.1. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico en mosto tinto con diferentes concentraciones de azúcar y análisis del estireno producido .............................................. 116 IV.1.3.2. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico a diferentes concentraciones de azúcar en un medio a base de mosto concentrado .......................................................................... 120 IV.1.4. Efecto inhibitorio del glicolaldehído .......................................................................... 131 IV.1.4.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con alto contenido de azúcar ...................................................................................................... 131 IV.1.4.2. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable ............................................................................................................. 134 IV.1.4.3. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de grado alcohólico probable ............................................................................................................................... 136 IV.1.5. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona.................................................................... 139 IV.1.5.1. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en medios a base de mosto concentrado con diferentes concentraciones de azúcar............................................................................ 139 IV.1.5.2. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable ............................................................................................................. 142 IV.1.6. Efecto inhibitorio del cobre ........................................................................................ 145 IV.1.6.1. Efecto inhibitorio del cobre en un medio sintético con diferentes concentraciones de azúcar.............................................................................................................................. 146 IV.1.6.2. Efecto inhibitorio del cobre y efecto sinérgico en combinaciones con furfural en medios a base de mosto concentrado .................................................................................. 149 IV.1.6.3. Efecto inhibitorio del cobre en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable ............................................................................................................................... 153 IV.2. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS EN LOS PARÁMETROS COLORIMÉTRICOS Y EN LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN VINIFICACIONES EN TINTO ......... 157 IV.2.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros colorimétricos en vino tinto ................................................................................................................................................. 157 IV.2.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de glicerina en vino tinto ................................................................................................................................................. 163 IV.2.3. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en vino tinto ..................................................................................................... 167 IV.2.3.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP .................................................... 167 IV.2.3.1.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 167 IV.2.3.1.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 168 IV.2.3.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP ........................................ 175 IV.2.3.2.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 175 IV.2.3.2.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 176 xxi IV.2.3.3 Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP ..................................... 187 IV.2.3.3.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 187 IV.2.3.3.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 188 CAPÍTULO V: CONCLUSIONES............................................................................................. 203 V.1. REDUCCIÓN DEL GRADO ALCOHÓLICO .................................................................................. 205 V.2. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS EN LOS PARÁMETROS COLORIMÉTRICOS Y PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS ............................................................................. 205 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 209 APÉNDICES ....................................................................................................................................... 225 APÉNDICE A. CINÉTICA FERMENTATIVA DE DIFERENTES ENSAYOS EXPERIMENTALES ........................................... 227 APÉNDICE B. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON FURFURAL231 APÉNDICE C. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON O-VAINILLINA ............................................................................................................................................................. 237 APÉNDICE D. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON ÁCIDO TRANSCINÁMICO ................................................................................................................................................ 240 APÉNDICE E. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON GLICOLALDEHÍDO ...................................................................................................................................... 243 APÉNDICE F. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON PBENZOQUINONA ........................................................................................................................................ 245 APÉNDICE G. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON COBRE ... 247 APÉNDICE H. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LA PRODUCCIÓN DE GLICERINA ............................................................................................................................................................. 251 APÉNDICE I. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES FERMENTATIVOS ........................................................................................................................ 253 APÉNDICE J. CROMATOGRAMAS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS PARA ESTUDIAR LA CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DEL FURFURAL Y O-VAINILLINA ........................................................................................................................... 259 APÉNDICE K. CROMATOGRAMAS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS PARA ESTUDIAR LA CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DEL ÁCIDO TRANS-CINÁMICO ...................................................................................................................................... 261 xxii ÍNDICE DE FIGURAS CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Figura I.1. Variación de las áreas aptas para el cultivo de la vid a causa del cambio climático…... Figura I.2. Fermentación secuencial con una levadura Crabtree(-) no-Saccharomyces................... Figura I.3. Inhibición metabólica y producción de intermediarios metabólicos…………...……… Figura I.4. Compuestos furánicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae……..... Figura I.5. Conversión del furfural en alcohol furfurílico..………………………………………... Figura I.6. Compuestos vainíllicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae…….... Figura I.7. Conversión de la vainillina en alcohol vainíllico………..…………………………….. Figura I.8. Molécula de glicolaldehído………..…………………………………………………... Figura I.9. Conversión del glicoladehído en etilenglicol por Saccharomyces cerevisiae……...….. Figura I.10. Moléculas de quinonas con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae…..… Figura I.11. Efecto inhibitorio de las quinonas sobre Saccharomyces cerevisiae………..……….. Figura I.12. Derivados fenilpropanos inhibidores de Saccharomyces cerevisiae.………………… Figura I.13. Formación de estireno a partir de cinamaldehído por Saccharomyces cerevisiae…… Figura I.14. Vía de degradación del ácido trans-cinámico por la levadura Pichia carsonii……..... CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS Figura III.1. Microvinificadores utilizados……….……………………………….......................... Figura III.2. Equipos utilizados para determinar el grado alcohólico (HPLC-RI) y analizador automático para determinar azúcares residuales y glicerina..……….………………..………...…… Figura III.3. Equipos para análisis cromatográfico de compuestos volátiles fermentativos y contenido residual de los bloqueadores metabólicos y sus derivados……………………………….. CAPÍTULO IV. RESULTADOS Efecto inhibitorio del furfural Figura IV.1. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP…………………………………………………………………………..………... Figura IV.2. Grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………... Figura IV.3. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………..………………. Figura IV.4. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura Distinction a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………………….. Figura IV.5. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………….…. Figura IV.6. Grado alcohólico en un medio sintético con 14,5 % de GAP con diferentes cepas de S. cerevisiae y evaluación del momento óptimo de adición de furfural…………………………….. Figura IV.7. Incidencia del pH y la temperatura sobre el grado alcohólico en un medio sintético con 14,5 % de GAP y evaluación del momento óptimo de adición de furfural.……………………. Figura IV.8. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………………………….……………………………….. Figura IV.9. Alcohol furfurílico producido a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………………………………………………………………... Figura IV.10. Grado alcohólico obtenido al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………………………………………………………….. Figura IV.11. Alcohol furfurílico producido al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP……...……………………………………………………………………………. Figura IV.12. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………………………………………………………………. Efecto inhibitorio de la o-vainillina Figura IV.13. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………………………………………… Figura IV.14. Cromatogramas para la identificación del alcohol o-vainíllico producido a partir de la o-vainillina en un medio sintético con 15 % de GAP………......………………………………... Figura IV.15. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con xxiii 5 14 15 19 24 29 31 33 35 37 38 42 44 45 63 65 67 72 74 80 80 81 82 84 87 89 91 94 96 101 103 furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP……..…………………………………………... Figura IV.16. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) en sus alcoholes derivados a partir de su dosificación en mosto tinto al inicio de las fermentaciones ...…………...… Figura IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) en sus alcoholes derivados a partir de su dosificación en mosto tinto al finalizar la fase de crecimiento exponencial.. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico Figura IV.18. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP…………………………………………..………………………… Figura IV.19. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado de 12 y 15 % de GAP…………………………………………………. Figura IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 % de GAP……………………………………..…………………………………………………………... Figura IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………………………………………………………………………………………..………... Figura IV.22. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 % de GAP…………………………………………………………………………………….……... Figura IV.23. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP…………………………………………………….……………………………………... Efecto inhibitorio del glicolaldehído Figura IV.24. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP…………………………………………………………… Figura IV.25. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 % de GAP………………………………………………............................................................ Figura IV.26. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de GAP………………………………………………………………………………………... Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona Figura IV.27. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP…………………………………………………….... Figura IV.28. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en mosto tinto con 14,3 % de GAP……………………………………………………………………………….…….. Efecto inhibitorio del cobre Figura IV.29. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en un medio sintético con 12 y 14 % de GAP………………………………………………………………………………..…….. Figura IV.30. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP y evaluación de la sinergia cobre-furfural…………...………. Figura IV.31. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto con 14,3 % de GAP…………………………………………………………………………………………………. Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos en vino tinto Figura IV.32. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA……………………………………………….. Figura IV.33. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA……………………………………………………………….. Figura IV.34. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796…………………………………………. Figura IV.35. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796…………………………………………………………. Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de glicerina en vino tinto Figura IV.36. Fermentación gliceropirúvica en Saccharomyces cerevisiae…...………………….. xxiv 107 111 113 118 122 126 126 128 128 132 135 136 141 143 148 152 154 160 160 161 161 164 Figura IV.37. Producción de glicerina al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 10 % de GAP……..……………………………………………. Figura IV.38. Producción de glicerina al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 14,3 % de GAP……………..………………………………….. Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos en vino tinto Figura IV.39. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP…………….………………………… Figura IV.40. Producción de diacetilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………..……………...…………….. Figura IV.41. Producción de lactato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP………………………………………. Figura IV.42. Producción de 1-propanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………..……………...…………….. Figura IV.43. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP………………...……...…..…………. Figura IV.44. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP………………………………………………………………. Figura IV.45. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP……….………………………… Figura IV.46. Producción de acetato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP….........………………………… Figura IV.47. Producción de 1-propanol e isobutanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP…….…………………. Figura IV.48. Producción de 2-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP………………………………. Figura IV.49. Producción de 3-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP…..…………………………... Figura IV.50. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP………………………………... Figura IV.51. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP………………………………………………………… Figura IV.52. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP…………….…………………. Figura IV.53. Producción de acetoína al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………..…………………….. Figura IV.54. Producción de acetato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………………………. Figura IV.55. Producción de acetato de isoamilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………...………. Figura IV.56. Producción de 1-propanol e isobutanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………..……….. Figura IV.57. Producción de 1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………….………..…………. Figura IV.58. Producción de 2-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………....…………. Figura IV.59. Producción de 3-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………….....…………. Figura IV.60. Producción de 2-feniletanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………...…...…………. Figura IV.61. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………...……...………. Figura IV.62. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………………………………………………. xxv 165 166 168 171 172 172 173 174 176 180 181 182 183 184 185 187 191 192 193 194 194 195 196 197 198 200 xxvi ÍNDICE DE TABLAS CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Tabla I.1. Técnicas utilizadas para producir vinos con menor graduación alcohólica……………... Tabla I.2. Potenciales bloqueadores del metabolismo fermentativo de Saccharomyces cerevisiae... Tabla I.3. Efecto de los potenciales bloqueadores metabólicos sobre la producción de etanol……. 10 16 17 CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS Tabla III.1. Programa de temperaturas para análizar los bloqueadores metabólicos y sus derivados por GC-MS……………………………………………………………………………….. 68 CAPÍTULO IV. RESULTADOS Efecto inhibitorio del furfural Tabla IV.1. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP……………………………………………………………………………………… Tabla IV.2. Acidez volátil con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………… Tabla IV.3. Producción de acetaldehído por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………………………………. Tabla IV.4. Producción de compuestos volátiles fermentativos por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………….. Tabla IV.5. Grado alcohólico a diferentes valores de pH y temperatura a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 14,5 % de GAP……………………………………………… Tabla IV.6. Azúcares residuales a diferentes valores de pH y temperatura a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 14,5 % de GAP…………………………………….. Tabla IV.7. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………………………………………………………………………………... Tabla IV.8. Furfural residual y alcohol furfurílico producido a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………… Tabla IV.9. Azúcares residuales al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………………………………………………………. Tabla IV.10. Furfural residual y alcohol furfurílico producido al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………………………... Tabla IV.11. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………………………………………………………………. Tabla IV.12. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………………………………………………………………. Efecto inhibitorio de la o-vainillina Tabla IV.13. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………………………………………………………. Tabla IV.14. Azúcares residuales a diferentes dosis de o-vainillina y combinación de o-vainillina y furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio sintético con 12,5 % de GAP………………………….. Tabla IV.15. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………... Tabla IV.16. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP……. Tabla IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) a diferentes tiempos de fermentación a partir de su dosificación en mosto tinto…………………………………………….. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico Tabla IV.18. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP…………………………………………………………………….. Tabla IV.19. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP………………………………………………… Tabla IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP………………………………………………………………………………………………….. Tabla IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a xxvii 73 75 77 79 83 85 88 88 92 94 97 98 102 104 107 108 114 119 123 125 diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP………………………………………………………………………………………... Tabla IV.22. Producción de acetaldehído a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP………………………………………. Efecto inhibitorio del glicolaldehído Tabla IV.23. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP…………………………………………………………… Tabla IV.24. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………… Tabla IV.25. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 % de GAP……………………………………………………………………………………… Tabla IV.26. Azúcares residuales y producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de GAP……………………………………………………. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona Tabla IV.27. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP………………………………………………………. Tabla IV.28. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en mosto tinto con 14,3 % de GAP………………………………………………………………………………….. Efecto inhibitorio del cobre Tabla IV.29. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en un medio sintético con 12 y 14 % de GAP…………………………………………………………………………………... Tabla IV.30. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP, y evaluación de la sinergia entre cobre y furfural…………… Tabla IV.31. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto con 14,3 % de GAP………………………………………………………………………………………………. Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos en vino tinto Tabla IV.32. Intensidad colorante (IC), tonalidad (T) y porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones………………………………………….. Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos en vino tinto Tabla IV.33. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP…….……… Tabla IV.34. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………………………......………… Tabla IV.35. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP...……... Tabla IV.36. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP……………………………………... Tabla IV.37. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……... Tabla IV.38. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP…………………………………… xxviii 127 129 133 133 135 137 142 144 149 153 154 158 169 170 177 178 189 190 LISTA DE ABREVIATURAS ADH : Enzima alcohol deshidrogenasa ADN : Ácido desoxirribonucleico AlDH : Enzima aldehído deshidrogenasa ARN : Ácido ribonucleico ATP : Adenosin trifosfato ATPasa : Enzima adenosintrifosfatasa CCR : Columna de conos rotatorios Ctr1p y Ctr3p : Copper transport proteins Cu/Zn-SOD : Enzima superóxido dismutasa con Cu/Zn DL50 : Dosis letal mediana D.O. : Denominación de Origen ERO : Especies oxígeno reactivas FAD / FADH2 : Flavin adenin dinucleótido (oxidado / reducido) FDC : Enzima descarboxilasa del ácido ferúlico FEMA : Flavour and Extract Manufacturers Association FML : Fermentación maloláctica FMN / FMNH2 : Flavin mononucleótido (oxidado / reducido) GAP : Grado alcohólico probable GAPDH : Enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GPDH : Enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa GRAS: : Generally Recognized As Safe (+) H ATPasa : Enzima adenosintrifosfatasa transportadora de hidrogeniones HMF : 5-hidroximetilfurfural IC : Intensidad colorante IC50 : Inhibición de la tasa de crecimiento celular en un 50% NAD / NADH : Nicotinamida adenina dinucleótido (oxidado / reducido) Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (oxidado / reducido) NADP / NADPH PAD : Enzima descarboxilasa del ácido fenilacrílico SIM : Selected Ion Monitoring T : Tonalidad YEPD : Yeast Extract Peptone Dextrose YNB : Yeast Nitrogen Base xxix xxx I. Introducción CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN I.1. Las altas temperaturas y sus efectos en el cultivo de la vid I.2. Técnicas aplicadas para reducir el grado alcohólico en vinos I.3. Bloqueadores metabólicos para reducir el grado alcohólico 1 I. Introducción 2 I. Introducción I.1. Las altas temperaturas y sus efectos en el cultivo de la vid I.1.1. El cambio climático Existen numerosas regiones en las cuales el clima favorece maduraciones sacarimétricas excesivas que influyen en la composición de la uva y en los vinos que a partir de esta se elaboran, zonas con elevadas temperaturas medias y escasez de recursos hídricos, que dan lugar a desequilibrios tanto a nivel vitícola como enológico y hacen muy difícil la obtención de vinos con un contenido alcohólico estándar comprendido entre 12,5 – 13,5 % v/v y una adecuada acidez, además de otros parámetros de calidad. Son varios los foros científicos y divulgativos (Balairón, 2006; Poni, 2006; Dokoozlian, 2006; Moutounet, 2006; Butzke, 2006) en los que se citan parámetros anómalos como son las maduraciones cada vez más tempranas, grados alcohólicos más elevados y deficientes maduraciones fenólicas, etc. Estas condiciones, definidas por unas elevadas temperaturas medias y un intenso déficit hídrico, se ven incrementadas por los efectos del cambio climático (IPCC, 2007), cuyas repercusiones previstas en las latitudes de tradición vitivinícola son un aumento de las temperaturas en 2 ºC antes del año 2050, y un aumento en la tasa de evaporación, tanto en el suelo como en la vid (Schultz, 2007). Algunas predicciones iniciales estimaban que el grado de reducción de la humedad del terreno podría ser del 20 al 30 % en la mayor parte de la región mediterránea y valores incluso superiores en la península ibérica (Stigliani y Salomons, 1992), pero estas predicciones se han puesto en duda recientemente según las tendencias climáticas pasadas y actuales (Schönwiese y Rapp, 1997). Sin embargo, el impacto en la vitivinicultura y sus consecuencias socioeconómicas serían 3 I. Introducción muy importantes especialmente en la cuenca mediterránea donde el agua es un recurso escaso y el riego no es siempre posible, problemática que se acentúa con el calentamiento global producido por la actividad industrial humana. El Modelo de Circulación General (GCM) predice además un calentamiento más rápido en el hemisferio norte durante los próximos 50 años (Evans, 1996). Se calcula que esto puede suponer desplazamientos de los límites septentrionales de cultivo de la vid de unos 10 a 30 Km por década hasta el año 2030 y llegar a duplicarse esta tasa entre 2020 y 2050 (Kenny y Harrison, 1993). Se ha observado que variedades adecuadas en Geisenheim (Alemania), a 50º de latitud norte, como Riesling, Pinot gris y Pinot noir, según las condiciones climáticas de los últimos 30 años podrían ser sustituidas en los próximos 50 años por otras como Cabernet franc y Merlot (Schultz, 2000), típicas de la cuenca mediterránea. Se estima que para el año 2050 la superficie adecuada para el cultivo de la vid en algunas zonas del planeta disminuiría considerablemente a causa del calentamiento global, como es el caso de la cuenca mediterránea con mermas de hasta un 68% del área vitícola, en California se perdería el 60%, en Sudáfrica el 51%, mientras que en Australia esa merma podría alcanzar hasta un 73%. Por el contrario, otras zonas que en la actualidad no son aptas verían incrementada su superficie vitícola, como son el norte de Europa hasta en un 99%, mientras que en otras zonas sería mayor, como Nueva Zelanda y Norteamérica occidental con incrementos de hasta 168 y 231%, respectivamente (Hannah et al, 2013). Dichas variaciones se recogen en la Figura I.1, que muestra la zonificación de las regiones vitícolas que se verían afectadas por el cambio climático en base a estas predicciones. 4 I. Introducción Actuales áreas adecuadas para viticultura que se perderían en el año 2050. Áreas que se mantendrían adecuadas para viticultura hasta el año 2050. Nuevas áreas que serían adecuadas para viticultura en el año 2050. Figura I.1. Variación de las áreas aptas para el cultivo de la vid a causa del cambio climático prevista para el año 2050 (Hannah et al, 2013). I.1.2. Efecto de las altas temperaturas sobre la composición de la uva Uno de los efectos más importantes del aumento de las temperaturas es la producción de vendimia con baja acidez y sobre todo una elevada concentración de azúcar en la uva (Mira de Orduña, 2010), lo cual no sólo aumenta la presión osmótica que la levadura tiene que tolerar durante las etapas iniciales de la fermentación, sino que además afectan los niveles de otras sustancias de interés en el vino como la glicerina y el ácido acético (Bauer y Pretorius, 2000; Mira de Orduña, 2010). También puede influir en el metabolismo de la levadura mediante la inducción de diversas respuestas al estrés, que influyen en la 5 I. Introducción expresión génica global y el cambio de la estructura de la membrana celular (Hallsworth, 1998; Alexandre et al, 2001). Por otro lado, las altas temperaturas ralentizan o inhiben la biosíntesis de antocianos, produciendo un desfase entre la maduración de la pulpa y la de la piel. Al perseguir una maduración fenólica más completa, se alarga el periodo en el cual la uva continua acumulando azúcar en la pulpa (Savé et al, 2010). Además, algunas alteraciones aromáticas en vinos blancos se han relacionado con la competencia de las vides por el agua y el nitrógeno en años secos de escasa pluviometría (Rapp et al, 1993). I.1.3. Efectos sobre el pH y estabilidad del vino Uno de los problemas asociados al cultivo de vid en zonas cálidas es la producción de vendimia con baja acidez y por tanto elevado pH (Mira de Orduña, 2010). El pH es un parámetro clave en la estructura del mosto y por tanto del vino que de éste se elabore, ya que se trata de un medio biológico naturalmente estable con valores cercanos a 3,5. Al incrementar su valor, la estabilidad del vino con el transcurrir del tiempo disminuye, su evolución es más rápida y los riesgos de contaminación son mayores. Su valor influye en la facilidad con la que se desarrollan microorganismos contaminantes como bacterias acéticas y lácticas, en la concentración de SO2 molecular disponible (Ribereau-Gayon et al, 2003a), en el sabor del vino (Ribereau-Gayon et al, 1976), en la sensación de astringencia de los vinos tintos (Peleg y Noble, 1999), en el color del vino y su estabilidad físico-química respecto a la solubilidad de las sales tartáricas, en la quiebra férrica, en la formación de asociaciones tanino-proteínas; y, sobre todo, en la sensibilidad del vino a los fenómenos oxidativos (Ribereau-Gayon et al, 2003b). 6 I. Introducción En cuanto a la estabilidad biológica, el pH es un factor esencial con respecto a las bacterias lácticas (Ribereau-Gayon et al, 2003a), encargadas de conducir la fermentación maloláctica (FML); pero que también producen compuestos tóxicos como las aminas biógenas (Santamaría et al, 2005) tales como histamina, tiramina, putrescina y cadaverina (Coton et al, 1999; Lonvaud-Funel, 2001; Soufleros et al, 1998), a partir de la descarboxilación de aminoácidos precursores presentes en el mosto/vino. Siendo un pH alto, una de las condiciones fundamentales para su formación (Ten Brink y Damink, 1990), aunque influyen también otros factores como la temperatura o la cepa bacteriana (Smit y du Toit, 2013). I.1.4. El etanol y su influencia en el perfil aromático del vino La mezcla de todos los componentes mayoritarios de la fermentación alcohólica a las concentraciones a las que se encuentran habitualmente en el vino confiere el olor típico de bebida alcohólica que habitualmente se define como vinoso: ligeramente dulce, picante y agresivo, alcohólico y un poco frutal. Esta mezcla constituye el sistema buffer o tampón aromático, que tiene la capacidad de neutralizar el efecto aromático ligado tanto a la adición de sustancias aromáticas, como a la eliminación de alguno de los constituyentes básicos del buffer (Ferreira, 2007). El etanol reduce la percepción aromática del vino mediante el aumento de la solubilidad de los compuestos aromáticos, reduciendo la fracción volátil. En general, la presencia de alcohol y de los otros componentes mayoritarios provoca que la solubilidad de los distintos componentes aromáticos sea mayor en vino de lo que lo es en disoluciones 7 I. Introducción acuosas. Tal aumento de solubilidad, a su vez, provoca que la presión de vapor de los odorantes disminuya (Ferreira, 2007). Por otro lado, el alcohol tiene la capacidad de potenciar el olor de algunos compuestos volátiles, como el eugenol o el decanal (Petka et al, 2003), mejorando por tanto la transferencia de los componentes volátiles a la fase de vapor (en condiciones dinámicas), pero este efecto causado por la denominada convección de Marangoni, es cancelado por las proteínas y otras macromoléculas del vino, siendo perceptible tan sólo en disoluciones sintéticas o en vinos muy envejecidos (Tsachaki et al, 2005; 2009). Por tanto, en la mayoría de los vinos, la cantidad de compuesto volátil alcanzando la pituitaria durante la olfacción está por debajo de la que se encuentra en cantidades equivalentes en disoluciones acuosas (Ferreira, 2007). Sin embargo, el mayor efecto de los altos niveles de etanol no es tanto físico-químico sino sensorial. Hay varias experiencias que lo corroboran, como por ejemplo su capacidad de enmascarar o suprimir de manera casi completa las notas frutales (Escudero et al, 2007; Harbertson et al, 2009), o de cambiar el carácter de afrutado a herbáceo (Goldner et al, 2009). También pueden aumentar la percepción de la astringencia de los taninos y la amargura, la rugosidad y la sensación cálida y ardiente del vino (Jones et al, 2008; Obreque-Slìer et al, 2010). Al reducir los niveles de alcohol en el vino, el perfil aromático se ve favorecido tanto por el fortalecimiento de las interacciones percibidas entre madera y fruta, así como mediante la modificación de las proporciones químicas de los compuestos aromáticos (Le Berre et al, 2007). 8 I. Introducción I.2. Técnicas aplicadas para reducir el grado alcohólico en el vino La demanda de vinos con una menor graduación alcohólica está creciendo como consecuencia de una mayor formación por parte del consumidor en cuanto a los beneficios de un consumo moderado en la salud y sus repercusiones en el estilo de vida (Pickering, 2000; Pereira et al, 2011; Zhang et al, 2011). Numerosas líneas de investigación se han iniciado en los últimos años, orientadas a disminuir la concentración alcohólica en los vinos. La Tabla I.1 resume algunas de las técnicas que permiten actuar a los diferentes niveles en el proceso de vinificación, como son las etapas prefermentativa, fermentativa y postfermentativa. 9 I. Introducción Tabla I.1. Técnicas utilizadas para producir vinos con menor graduación alcohólica. Nivel de aplicación Método Aplicación de enzimas (Por ejm. glucosa oxidasa) Uso de uva sin madurar recogida durante el aclareo de los viñedos Concentración por congelación y fraccionamiento Técnicas de membrana: ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa Adición de agua / agua acidulada para diluir el mosto Separación de aguas de vegetación /sangrado y posterior reconstitución Utilización de levaduras Saccharomyces ineficientes Empleo de levaduras Saccharomyces genéticamente modificadas Fermentaciones secuenciales y/o mixtas con levaduras no-Saccharomyces Metabolismo respiro-fermentativo de azúcares con no-Saccharomyces Parada temprana de la fermentación Prefermentación (Reducción de azúcares fermentables) Fermentación Postfermentación Técnicas por calor Destilación a vacío en columnas de conos rotatorios (CCR) Evaporación Crioconcentración Diálisis Ósmosis inversa Mediante resinas y silica gel Solventes orgánicos Fluidos supercríticos Técnicas de membrana Adsorción Extracción Dilución del vino 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Pickering (2000). Schmidtke et al (2012). Kontoudakis et al (2011). Petrotos et al (2001); Prodanov et al (2004); Warczok et al (2005; 2007). California Administrative Code (2012); Code of Federal Regulations USA (2012); Harbertson et al (2009). Loira et al (2012). González et al (2013). 10 Referencia 1, 2 1, 2, 3 1 4 1, 2, 5 1, 6 1, 2 1, 2 7 1, 2 1, 2 1 1 1 1, 2 1, 2 1, 2 1 1 I. Introducción I.2.1. Etapa prefermentativa: a nivel de mosto Las técnicas fisicoquímicas de extracción/sangrado de parte del mosto y sustitución por soluciones aciduladas o por aguas de vegetación obtenidas en la concentración de mostos, deberían ser consideradas, aunque, de forma más cuidadosa y con particular interés en la viticultura de zonas cálidas. En algunos países, como Estados Unidos, se permite la adición de agua al mosto antes, durante o después de la fermentación para ajustar la acidez (proceso conocido con el término inglés “amelioration”) (Code of Federal Regulations, 2012) o para diluir la concentración azucarada del mosto (Bisson, 1999; Harbertson et al, 2009) y facilitar una normal fermentación (California Administrative Code, 2012), que sería un proceso de corrección como lo es la adición de mosto concentrado (España, Ley 24/2003), que se permite en zonas con malas maduraciones sacarimétricas por peculiaridades climáticas regionales, aunque en un contexto opuesto. Otra opción interesante es el uso de mosto de uva no madura recolectada durante el aclareo, con el cual se puede producir un vino con alta acidez y bajo grado alcohólico (Kontoudakis et al, 2011), el cual puede ser usado para reemplazar un volumen equivalente de mosto de uva madura, sin afectar las características sensoriales y el contenido de antocianos y proantocianidinas. Incluso se puede mejorar el color del vino elaborado con esta técnica. También el mosto se puede procesar parcialmente mediante separación física por tecnologías de membrana para separar como permeato el agua de constitución. Posteriormente se puede reincorporar al mosto no tratado el agua de constitución, 11 I. Introducción reduciendo así su concentración azucarada. Existe una amplia bibliografía referente a la aplicación de ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa para modificar el contenido azucarado en mostos (Petrotos et al, 2001; Prodanov et al, 2004; Warczok et al, 2005; 2007), opción viable pero que precisa ser estudiada y optimizada para su uso en vinificación en zonas cálidas. I.2.2. Etapa postfermentativa: a nivel de vino elaborado A nivel de vino elaborado, son aplicables diversas técnicas como la destilación, crioconcentración, técnicas de membrana, adsorción por resinas o silica gel, extracción por solventes orgánicos o fluidos supercríticos, dilución del vino, entre otras (Pickering, 2000). Siendo interesante la aplicación de la destilación a vacío en columnas de conos rotatorios (CCR), en la cual además se puede recuperar y reincorporar al vino desalcoholizado la fracción volátil (Belisario-Sánchez et al, 2011; Schmidtke et al, 2012). También puede utilizarse la extracción con CO2 supercrítico para recuperar el componente aromático (Macedo et al, 2008; Schmidtke et al, 2012) y reincorporarlo posteriormente al vino. I.2.3. Etapa de fermentación alcohólica A nivel de fermentación se puede trabajar desde el punto de vista microbiológico, seleccionando levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae que sean glicolíticamente ineficientes (Heux et al, 2006; Kutyna et al, 2010; Loira et al, 2011; SuarezLepe y Morata, 2012), de tal modo que parte del metabolismo de los carbohidratos se desvíe a la producción de biomasa y de intermediarios glicolíticos fermentativos de 12 I. Introducción interés enológico (Figura I.3) como glicerina, ácidos, ésteres, aldehídos, etc., mientras que se puede reducir la producción de acetato de etilo y la acidez volátil (Loira et al, 2011). También se pueden utilizar levaduras no-Saccharomyces que trabajando en forma secuencial o en cultivos mixtos con S. cerevisiae pueden permitir la elaboración de vinos con una menor graduación alcohólica y un mejor perfil organoléptico (Schmidtke et al, 2012; Gonzalez et al, 2013). En cuanto al perfil organoléptico, en estas levaduras se puede aprovechar su capacidad para secretar enzimas con impacto positivo en el aroma primario y secundario del vino, producción de glicerina, liberación de manoproteínas, baja acidez volátil y mejora de la estabilidad colorante (Strauss et al, 2001; Rojas et al, 2003; Bely et al, 2008; Moreira et al, 2008; Palomero et al, 2009; Viana et al, 2011; SuarezLepe y Morata, 2012). Con respecto a la aplicación de fermentaciones secuenciales, recientemente se ha propuesto una alternativa mediante la cual se puede aprovechar el carácter Crabtree(-) de algunas levaduras no-Saccharomyces, las cuales en una primera fase podrían consumir parte del azúcar del mosto mediante un metabolismo respiro-fermentativo el cual requeriría de un aporte de oxígeno; seguido de una segunda fase en la cual se inocularía una cepa de Saccharomyces cerevisiae para que continúe con una fermentación alcohólica normal (Gonzalez et al, 2013). Con lo cual el contenido de azúcares disponibles para la segunda fase de la fermentación sería menor y por tanto el vino resultante sería de menor grado alcohólico. El procedimiento propuesto se representa en la Figura I.2. 13 I. Introducción Figura I.2. Propuesta de fermentación secuencial con una levadura Crabtree(-) no-Saccharomyces y una levadura Saccharomyces cerevisiae (Gonzalez et al, 2013). Otra alternativa es el empleo de bloqueadores metabólicos, moléculas que están presentes en el vino y/u otros alimentos y que durante la fermentación alcohólica pueden originar redireccionamientos en la ruta fermentativa de las levaduras vínicas, tales como el furfural (Ábalos et al, 2011), o-vainillina, glicolaldehído, algunas quinonas, ácido cinámico y otros ácidos orgánicos y metales como el cobre (Tablas I.2 y I.3); pudiendo constituir una adecuada estrategia para reducir los niveles de etanol con el consiguiente aumento de otras sustancias de interés enológico (Figura I.3), tal como se ha reportado en trabajos previos (Pons y Chanel, 1991; Palmqvist et al, 1999; Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002). 14 I. Introducción Figura I.3. Inhibición metabólica y producción de intermediarios metabólicos de interés enológico durante la fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae en detrimento de la producción de etanol. 15 I. Introducción Tabla I.2. Potenciales bloqueadores del metabolismo glicolítico fermentativo de Saccharomyces cerevisiae. MOLÉCULA FÓRMULA PESO MOLECULAR g/mol O O 96,0 Furfural DL50 mg/Kg (oral) 65 (Merck) H O OH o-vainillina 152,5 1330 (Yu et al, 1987) OMe O Ácido cinámico 148,0 2500 (Merck) OH Glicolaldehído HO 60,0 O 280 (Collins, 2006) a O 108,0 p-Benzoquinona 100 (Sigma-Aldrich) O O OH Ácido benzoico (Lück y Pager, 2000) 46,0 (Lück y Pager, 2000) O Ácido fórmico H OH O 60,0 Ácido acético H3C OH O 74,1 Ácido propiónico OH a) Intraperitoneal (rata). 16 3000 122,1 1200 3310 (Merck) 4000 (Lück y Pager, 2000) I. Introducción Tabla I.3. Efecto de los potenciales bloqueadores del metabolismo fermentativo de S. cerevisiae, sobre la producción de etanol. MOLÉCULA Furfural o-Vainillina Glicolaldehído Ácido cinámico Ácido benzoico Ácido benzoico Ácido fórmico Ácido acético Ácido propiónico Ácido butanoico p-Benzoquinona Cobre CONCENTRACIÓN EN EL MEDIO g/l 0,5 4 2 4 >4 0,02 0,2 0,12 0,6 1,2 1 1 2 4 6 4 3 0,02 0,032 0,032 0,032 INHIBICIÓN PRODUCCIÓN DE ETANOL % 21 97 Sólo al inicio a 79 100 0 100 43 72 ≈ 100 58 75 > 90 > 90 > 90 > 90 > 90 100 Hasta 80 % (poder fermentativo) Aumentó la producción de etanol Aumentó la producción de etanol a) La producción final no se ve afectada. b) Glicolaldehído como dímero (PM: 120 g/mol). c) No se especifica el contenido de azúcar, pero se asume al tratarse de uva de mesa. 17 GLUCOSA EN EL MEDIO FERMENTATIVO g/l 20 20 100 30 10 20 20 100 100 100 20 10 10 10 10 10 10 20 19 % (mosto tinto) ≈ 150 (mosto blanco) c 100 REFERENCIA Banerjee et al, 1981 Banerjee et al, 1981 Boyer et al, 1992 Palmqvist et al, 1999 Huang et al, 2011 Larsson et al, 2000 Jayakody et al, 2011b Larsson et al, 2000 Huang et al, 2011 Larsson et al, 2000 Brandolini et al, 2002 Azenha et al, 2000 Azenha et al, 2000 I. Introducción I.3. Bloqueadores metabólicos para reducir la producción de etanol durante la fermentación alcohólica en vinos En los siguientes apartados se resume la información bibliográfica referente a algunos de los compuestos que han sido evaluados como bloqueadores metabólicos para reducir la producción de etanol en la fermentación alcohólica. La mayoría de ellos han sido estudiados en el contexto de la producción de biocombustibles, donde el tratamiento del material lignocelulósico previo a la fermentación genera una amplia diversidad de compuestos dentro de los cuales se encuentran los ya citados bloqueadores. Compuestos que afectan el normal metabolismo fermentativo de los microorganismos utilizados para convertir los azúcares derivados de los materiales lignocelulósicos en etanol, principalmente la levadura Saccharomyces cerevisiae. Cabe destacar que de estos compuestos únicamente el cobre ha sido evaluado en fermentaciones con mostos de uva, cuyas referencias se detallarán en el apartado correspondiente, mientras que para los demás compuestos no se tiene constancia de haber sido evaluados en dicho contexto. Razón por la cual no se conoce el efecto sobre su capacidad inhibitoria bajo algunos parámetros tecnológicos propios de la vinificación como son la concentración de azúcares en el mosto, temperatura de fermentación, pH del medio; además de su efecto sobre las levaduras vínicas en cuanto a producción de etanol, producción de metabolitos secundarios con importante repercusión en la composición y en el perfil organoléptico del vino, tales como glicerina, compuestos volátiles fermentativos, así como la generación de nuevos compuestos derivados de los bloqueadores metabólicos. 18 I. Introducción I.3.1. Compuestos furánicos Pertenecen a este grupo de compuestos el furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF), alcohol furfurílico (Figura I.4), entre otros; los cuales han sido evaluados como bloqueadores metabólicos durante de la fermentación alcohólica (Palmqvist et al, 1999; Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002; Liu et al, 2005; Liu y Blaschek 2009; Hawkins y Doran-Peterson, 2011). En el contexto de los vinos, estos compuestos mayoritariamente se generan durante el tostado de la barrica como consecuencia de una reacción de Maillard entre aminoácidos y los compuestos glucídicos de la madera (Cacho, 2006). El furfural proviene de las pentosas (xilosa), mientras que el HMF de las hexosas (glucosa, galactosa y manosa) (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000). El alcohol furfurílico se forma por reducción enzimática del furfural durante el envejecimiento del vino, de modo que factores relativos a la actividad enzimática, como pH y temperatura, afectarán a su concentración (Towey y Waterhouse, 1996; Aznar et al, 2003). También estos compuestos pueden aparecer naturalmente en muchos alimentos de origen vegetal (Maarse et al, 1994). O Furfural CHO HOH2C O CHO 5-Hidroximetilfurfural O CH2OH Alcohol furfurílico Figura I.4. Compuestos furánicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae. 19 I. Introducción I.3.1.1. Furfural El furfural es un aldehído aromático con una estructura en anillo también conocido como furan-2-carboxaldehído, fural, furfuraldehído, aldehído piromúcico (Figura I.4). Puede aparecer a través de reacciones de Maillard, generalmente a elevadas temperaturas (Delgado-Andrade et al, 2010), también a partir de la descomposición del ácido ascórbico (Masatsune et al, 2007). Este furfural de síntesis natural, está presente en los alimentos a concentraciones que varían entre los 0,05 ppm en ciertas frutas, hasta los 255 ppm en el cacao o el café (Maarse et al, 1994). Además, el furfural sintetizado en laboratorio es empleado como aditivo modificador de las propiedades organolépticas de varios productos alimentarios y bebidas, y estudios previos reportan que no implica ningún riesgo para la salud humana bajo las condiciones de uso como ingrediente alimentario (Adams et al, 1997). El furfural fue calificado como una sustancia generalmente reconocida como segura (Generally Recognized As Safe, GRAS) bajo condiciones de uso como aditivo alimentario por el panel de expertos de la Asociación de Fabricantes de Sabores y Extractos (Flavour and Extract Manufacturers’ Association, FEMA) (Adams et al, 1997). No existen estudios que analicen la acción inhibitoria del furfural a concentraciones aptas para el consumo humano, que no debe exceder de 0,5 mg/Kg de peso corporal (FAO/WHO, 2000), aunque estudios previos muestran que ingestas de 60 mg/Kg de peso corporal por día no muestran efecto nocivo alguno en roedores (Jonker, 2000). En los vinos, tanto el furfural como sus derivados furánicos están presentes debido a la extracción de compuestos volátiles durante la crianza en barrica, en la cual aparecen por 20 I. Introducción hidrólisis de la celulosa durante el tostado (Chatonnet et al, 1989; Cutzach et al, 1999; Cacho, 2006), frecuentemente a concentraciones inferiores a su umbral de percepción (20 mg/l) (Boidron et al, 1988; Spillman et al, 1998), extracción que depende del tipo de roble usado (francés o americano), edad del barril (nuevo tostado, usado, o nuevo sin tostar) y duración del envejecimiento (Quesada et al, 1996). La concentración de furfural en los vinos también depende de la técnica vinícola de elaboración empleada, así por ejemplo los vinos tintos suelen contener concentraciones entre 0,8 mg/l (Pérez-Prieto et al, 2003) hasta 8 mg/l (Garde et al, 2005). En otros vinos como los de Oporto 7,8 mg/l (Ho et al, 1999), o en los de Madeira hasta 24 mg/l (Câmara et al, 2006). Aporta aromas a almendras y almendras tostadas (Zamora, 2005) aunque también se ha relacionado con sabores a caramelo y cereal (Scarpellino y Soukup, 1993). El furfural es importante también porque tiene un efecto potenciador sobre la percepción de las whiskylactonas, relacionadas con los aromas a coco y vainilla (Reazin, 1991). En vinos blancos puede formar furfuriltiol al reaccionar con el SH2, que proporciona un fuerte aroma a café (Blanchard et al, 2001), también reacciona con los antocianos de los vinos tintos formando compuestos colorantes más estables (Es-Safi et al, 2003). I.3.1.2. Efecto inhibitorio del furfural Dentro de los compuestos furánicos que tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad fermentativa de S. cerevisiae están el furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF) o el alcohol furfurílico, siendo el furfural el que mayor efecto inhibitorio presenta (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002). El modo por el cual afectan el metabolismo en las levaduras fermentativas no es completamente conocido, aunque se sugiere que estos aldehídos al 21 I. Introducción ser químicamente reactivos, pueden formar compuestos con determinadas moléculas biológicas como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Singh y Khan, 1995). Algunos estudios indican que causan daños en la pared y membrana celulares, inhiben el crecimiento celular, causan daños en el ADN, inhiben la síntesis de proteínas y ARN y reducen la producción de etanol (Zaldivar et al, 1999; Modig et al, 2002; Liu y Blaschek 2009). El furfural produce la inhibición de enzimas glicolíticas y fermentativas (Banerjee et al, 1981; Zaldivar et al, 1999; Modig et al, 2002). Una de las enzimas más afectada es la alcohol deshidrogenasa (ADH) involucrada en la formación de etanol, lo cual podría explicar la mayor excreción de acetaldehído observada en la fermentación alcohólica al añadir furfural al medio (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002). También inhibe la actividad de la aldehído deshidrogenasa (AlDH) y de enzimas involucradas en el ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico (Taherzadeh et al, 2000). Además, se ha sugerido que el furfural inhibe otras enzimas glicolíticas como la hexoquinasa, fosfofructoquinasa, triosafosfato deshidrogenada, aldolasa (Banerjee et al, 1981), piruvato deshidrogenasa (Modig et al, 2002), piruvato descarboxilasa (Taherzadeh et al, 1999) o la glicerol-3fosfato deshidrogenasa (GPDH) (Palmqvist et al, 1999). Las propiedades inhibitorias del furfural y otros derivados furánicos han sido evaluadas en el marco de la producción de biocombustibles (Azhar et al, 1981; Banerjee et al, 1981; Boyer et al, 1992), dada la elevada concentración en que aparecen tras la hidrólisis de la lignocelulosa, así el furfural aparece a concentraciones de hasta 620 mg/l en hidrolizados de madera de chopo (Oliva, 2003), 1180 mg/l en hidrolizados de madera de pino (Hawkins y Doran-Peterson, 2011), 1700 mg/l en hidrolizados de fibra de maíz 22 I. Introducción (Samala et al, 2012) o inclusive hasta 2500 mg/l en hidrolizados de bagazo de caña de azúcar (Laser et al, 2002). Otros derivados como el HMF y el ácido furoico han sido identificados en hidrolizados de madera de pino en concentraciones de 18 y 2153 mg/l respectivamente (Hawkins y Doran-Peterson, 2011). Bajo estas condiciones, es conocido el descenso que origina el furfural sobre la tasa de producción de etanol y sobre la tasa de crecimiento específico de las levaduras (Taherzadeh et al, 1999), pudiendo inhibir la producción de etanol hasta en un 78% a una concentración de 0,46 g/l, mientras que con 1,2 g/l la inhibición puede ser total (Banerjee y Viswanathan, 1974) e inhibir el crecimiento celular a una concentración de 1 g/l, aunque la resistencia de la levadura a sus efectos podría mejorar incrementando la concentración de glucosa en el medio (Lu et al, 2007). Además de su concentración, su efecto inhibitorio varía en función de la densidad celular (Chung y Lee, 1985; Navarro et al, 1994), del tipo de levadura (Lu et al, 2007; Ábalos et al, 2011), de las condiciones de cultivo (fermentación continua, alimentada o discontinua) (Fireoved y Mutharasan, 1986; Villa, 1992) y de la aireación (Díaz de Villegas et al, 1992). Se ha propuesto la inhibición de tipo competitivo que ejerce el furfural sobre las enzimas encargadas de la producción de etanol (alcohol deshidrogenasa, ADH) y ácido acético (aldehído deshidrogenasa, AlDH), ambos a partir del acetaldehído (Modig et al, 2002). El furfural es “tóxico” para las levaduras, de modo que éstas lo convierten en compuestos menos perjudiciales (Nilsson et al, 2005), principalmente por reducción a alcohol furfurílico (Liu et al, 2005) empleando NADH como cofactor (Palmqvist et al, 1999), de manera que la enzima encargada de reducir el acetaldehído a etanol (ADH) por vía glicolítica (Figura I.5) es utilizada para este nuevo objetivo (inhibición competitiva), 23 I. Introducción disminuyendo por consiguiente la síntesis de etanol (Azhar et al, 1981; Navarro et al, 1994), lo cual podría explicar la mayor excreción de acetaldehído observada en la fermentación alcohólica tras añadir furfural al medio fermentativo (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002). Glucosa Alcohol furfurílico ETANOL NAD+ Gliceraldehído-3-fosfato ADH Piruvato CO2 CoA NAD+ NADH Furfural ACETALDEHÍDO NAD+ AlDH NADH Ciclo de Krebs CO2 Acetil CoA NADH Ácido acético Ácido furoico Figura I.5. Conversión enzimática del furfural (Adaptado de Modig et al, 2002). Otro metabolito fermentativo afectado por la acción inhibitoria del furfural es la glicerina, la cual se forma para mantener el equilibrio redox intracelular, mediante la producción de NAD+ a partir de la reoxidación del NADH citosólico. El NADH es el cofactor requerido por S. cerevisiae para reducir el acetaldehído a etanol así como para reducir el furfural a alcohol furfurílico (Figura I.5). Palmqvist et al (1999), han demostrado una mayor afinidad hacia el NADH por la enzima ADH (responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico) que por la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPDH, responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato y producir glicerina), generándose una inhibición de tipo competitiva, con lo cual podría esperarse 24 I. Introducción que la producción de glicerina sea menor en presencia del furfural. Sin embargo otros autores (Taherzadeh et al, 1999) han demostrado que la producción de glicerina puede incrementar después de la adición de furfural, lo cual podría indicar otras fuentes de NADH requerido para su reducción. Al respecto se ha sugerido al Ciclo de Krebs o Ciclo de los ácidos tricarboxílicos como una vía alternativa para generar NADH (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002), principalmente en las etapas iniciales del proceso fermentativo (Horváth et al, 2003), incrementándose además la producción de otros intermediarios metabólicos de interés (Figura 3) como el ácido succínico (Taherzadeh et al, 1999). La glicerina y el ácido succínico son dos metabolitos de un importante impacto en el vino, de modo que una interesante posibilidad sería evaluar el incremento de su producción en presencia de furfural u otro inhibidor metabólico. La glicerina es muy importante desde el punto de vista sensorial ya que aporta “dulzor” a los vinos y su viscosidad incrementa la suavidad, estructura y cuerpo (Hidalgo, 2010; Suárez–Lepe y Morata, 2012). Mientras que el ácido succínico confiere al vino notas saladas y amargas muy sutiles, y su síntesis por las levaduras fermentativas constituye una de las más importantes vías para incrementar la acidez titulable del vino (Coulter et al, 2004), especialmente en vinos producidos a partir de uvas procedentes de zonas cálidas, los cuales presentan baja acidez (Mira de Orduña, 2010). Además a partir del ácido succínico pueden formarse ésteres de aromas agradables mejorando el perfil aromático del vino, como son el succinato de etilo, presente en vinos de Jeréz (Webb et al, 1964) y en vinos espumosos donde aportan aroma a café con leche (Hidalgo, 2010); el succinato de dietilo, detectado en vinos de Madeira, Jeréz (Webb et al, 1964; Alves et al, 2005) y en vinos de 25 I. Introducción uva Verdejo (Herraiz et al, 1991), aportando además aroma a moka en vinos espumosos (Hidalgo, 2010); y finalmente el succinato de metilo, que confiere el característico aroma a los vinos de uva Muscadine (Lamikanra et al, 1996). A partir del furfural también se producen otros metabolitos como el ácido furoico (Villa et al, 1992), la furoína y el furil (Morimoto et al, 1969). El ácido furoico se produce a partir de la oxidación del furfural, proceso en el que estaría involucrada la enzima AlDH (Figura I.5) especialmente en presencia de oxígeno (Taherzadeh et al, 2000; Modig et al, 2002) empleando en este caso NAD+ como cofactor (Horváth et al, 2003). Como resultado de este proceso, se puede reducir la producción de ácido acético, mientras se incrementa la producción de ácido pirúvico (Taherzadeh et al, 1999), debido a que la capacidad para convertirlo en acetaldehído es afectada por la acumulación de este último cuando el furfural es añadido al medio (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002), aunque también puede ser causado por un efecto inhibitorio sobre la enzima piruvato descarboxilasa; a la vez que el ácido acético es convertido en acetil-CoA. Todo ello ocurre mientras el furfural añadido no es completamente metabolizado. También Saccharomyces tiene la capacidad de metabolizar el HMF y convertirlo en su derivado el 2,5-bis-hidroximetilfurano (alcohol 5-hidroximetilfurfurílico) (Liu et al, 2004; 2005) y la enzima codificada por el gen ADH6 (alcohol deshidrogenasa 6) de Saccharomyces cerevisiae sería la responsable del incremento de la tasa a la cual la levadura metaboliza este furano (Petersson et al, 2006). 26 I. Introducción I.3.2. Compuestos vainíllicos Naturalmente, los compuestos vainíllicos forman parte de la vainilla, uno de los aditivos alimentarios más usado en el mundo, siendo el compuesto mayoritario la vainillina (pvainillina) con un contenido aproximado en la vaina de vainilla de 2 - 2,5 % (Walton et al, 2003). Su uso en la industria alimentaria además puede extenderse a la función de preservante alimentario al mostrar propiedades antioxidantes y antimicrobianas (Davidson y Naidu, 2000), siendo de especial interés su efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae (Fitzgerald et al, 2003; 2004). También muestran este efecto inhibitorio sus isómeros isovainillina y o-vainillina (Larsson et al, 2000). En los vinos estos fenoles proceden del roble, como consecuencia de la termólisis parcial de la lignina durante el tostado de las barricas (Fiddler et al, 1966). Destacando por su importancia sensorial la vainillina, responsable del olor a vainilla que caracteriza a muchos vinos de crianza (Chatonnet, 1992; Boidron et al, 1998; Zamora, 2003; 2005). I.3.2.1. Efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos Aunque, el mecanismo de inhibición no se conoce completamente, se ha estudiado el efecto de estos aldehídos aromáticos sobre bacterias como Klebsiella pneumoniae (Tran y Chambers, 1986; Nishikawa et al, 1988) y Escherichia coli (Zaldivar et al, 1999; Zaldivar y Ingram, 1999). Su efecto inhibitorio puede deberse a una interacción con determinadas zonas hidrofóbicas de la célula y causar pérdida de la integridad de la membrana afectando su capacidad de actuar como barrera selectiva (Heipieper et al, 1994). Además, se han realizado diversos estudios sobre su efecto en levaduras (Mikulásová et al, 1990; 27 I. Introducción Delgenes et al, 1996), especialmente Saccharomyces cerevisiae (Jönsson et al, 1998; Palmqvist et al, 1996; Palmqvist, 1998; Larsson et al, 1999; 2000). Debido a que la estructura de la membrana plasmática en levaduras es similar a la de las procariotas, se postula que los mecanismos de inhibición pueden ser similares (Larsson, 2000). Determinados microorganismos como las bacterias Klebsiella pneumoniae (Nishikawa et al, 1988) o Zymomona mobilis (Delgenes et al, 1996) y levaduras de los géneros Saccharomyces, Pichia, Pachysolen y Candida (De Wulf et al, 1986; Delgenes et al, 1996; Larsson et al, 2000) son capaces de metabolizar los compuestos vainíllicos. Sin embargo, los datos referentes al papel de la enzima ADH de Saccharomyces cerevisiae en la conversión de estos compuestos no son del todo claros (Bowen et al, 1986). Además se considera que otras enzimas involucradas serían la vainillina oxidoreductasa (De Wulf et al, 1986), aldosa reductasa (Kuhn et al, 1995) o la arilalcohol deshidrogenasa (Delnieri et al, 1999). En cuanto al origen de estos compuestos, se ha demostrado que los derivados de la degradación de la lignina, como los compuestos vainíllicos, tienen un mayor efecto inhibitorio en S. cerevisiae que los derivados de la degradación de azúcares como el furfural y el HMF (Lee et al, 1999), destacando además que el efecto inhibitorio depende de la concentración de azúcares en el medio fermentativo, pues al aumentar la concentración de glucosa, el efecto de los bloqueadores metabólicos disminuye, tal como se menciona en otros estudios (Chung y Lee, 1985; Navarro et al, 1994). En cuanto a su estructura química, en el anillo aromático de estos aldehídos la posición de los sustituyentes (como el -OH) tiene mayor relevancia en su efecto inhibitorio que 28 I. Introducción su naturaleza (sean -OH o -CH3) (Figura I.6). Así la posición orto del hidroxilo (-OH) en la vainillina (o-vainillina) determina un mayor efecto inhibitorio que la posición para (p-vainillina). Mientras que si se compara la isovainillina con la p-vainillina, no se observa una diferencia importante (Mikulásová et al, 1990). Por otro lado, el incremento en grupos metilo (-CH3) como sustituyentes en el anillo aromático, puede reducir el efecto inhibitorio de estos compuestos (Lee et al, 1999), además estos compuestos son más tóxicos en su forma aldehído, y en menor grado como ácidos y menos aún como alcoholes (Mikulásová et al, 1990; Larsson et al, 2000; Huang et al, 2011). CHO CHO CHO OH OH OCH3 OCH3 OH Vainillina o p-vainillina OCH3 Isovainillina o-Vainillina Figura I.6. Compuestos vainíllicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae. A escala industrial, las propiedades inhibitorias de los compuestos vainíllicos se han evaluado en el marco de la producción de biocombustibles (Mikulásová et al, 1990; Lee et al, 1999; Larsson et al, 2000; Huang et al, 2011), dada su elevada concentración tras la hidrólisis de la lignocelulosa, donde la vainillina y su derivado el ácido vainíllico pueden aparecer en concentraciones de hasta 22 y 50 mg/l respectivamente (Hawkins y Doran-Peterson, 2011). 29 I. Introducción I.3.2.2. Efecto inhibitorio de la vainillina y o-vainillina La vainillina, también conocida como p-vainillina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído, 4hidroxi-m-anisaldehído o aldehído vainíllico, ejerce un importante efecto inhibitorio sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae (Fitzgerald et al, 2003; 2004; Lee et al, 1999), originando una disminución de la actividad fermentativa a dosis comprendidas entre 1 – 2,5 g/l, sobre todo en las etapas iniciales tras su dosificación en el medio fermentativo, aunque una vez que la levadura se ha adaptado puede recuperar su capacidad, no viéndose alterada la producción final de etanol, mientras que a dosis mayores a 3 g/l puede causar una inhibición total de la levadura (Lee et al, 1999). La o-vainillina, también conocida como 2-vainillina, 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído, 3-metoxisalicilaldehído o 2-hidroxi-m-anisaldehído, puede ser sintetizada industrialmente a partir del guayacol como producto intermedio durante la producción de vainillina a través de la síntesis de Reimer-Tieman (Geissman, 1974) o a partir de procesos de recuperación de aguas de licor del proceso kraft usado en la fabricación de papel (Major y André, 1977). La o-vainillina inhibe totalmente la producción de etanol y crecimiento celular en S. cerevisiae a 200 mg/l. Una dosis de 20 mg/l no inhibe la producción de etanol y apenas tiene efectos sobre el crecimiento celular, siendo el alcohol o-vainíllico el principal producto de su metabolismo, el cual al parecer es menos nocivo para la levadura (Larsson et al, 2000), análogamente a la producción de alcohol vainíllico a partir de la vainillina (Figura I.7) y de alcohol furfurílico a partir del furfural (Liu et al, 2005). 30 I. Introducción CH2OH COOH CHO NAD+ NADH Oxidación Reducción OCH3 OCH3 OH Alcohol vainíllico OH Vanillina OCH3 OH Ácido vainíllico Figura I.7. Conversión de la vainillina en alcohol vainíllico (Adaptado de Fitzgerald et al, 2003). La conversión de la vainillina a alcohol vainíllico (Figura I.7) y su posterior trasformación durante la fermentación es mencionada en la elaboración de cerveza o vino (Chatonnet et al, 1992), así como en medios modelo (Humphries et al, 1992). Bioconversión catalizada por un grupo especial de enzimas oxidoreductasas, que requieren un cofactor como NADH, NADPH, FADH2 o FMN. La enzima responsable de dicha reducción no está claramente dilucidada (De Wulf et al, 1986), sugiriendo dichos autores que no se trataría de la enzima ADH, sino de una oxidoreductasa inducida por la vainillina, pues trabajando con una levadura S. cerevisiae sin actividad ADH, obtuvieron la misma producción de alcohol vainíllico que con una levadura normal, con una producción del 95% de alcohol vainíllico con respecto a la vainillina adicionada. 31 I. Introducción 32 I. Introducción I.3.3. Glicolaldehído El glicolaldehído, llamado también diosa, 2-hidroxietanal, hidroxiacetaldehído, etc., es el azúcar más simple (Figura I.8), que al combinarse con otras moléculas puede formar azúcares más complejos como ribosa y glucosa. Se encuentra naturalmente formando parte de muchos alimentos y en la industria alimentaria es un compuesto bastante deseable, usualmente como intermedio en la preparación de otros productos, ya sea como producto puro, en soluciones acuosas o en soluciones mezclado con otros compuestos carbonilos de bajo peso molecular. Figura I.8. Molécula de glicolaldehído. Importantes fuentes de glicolaldehído son la termólisis a partir de soluciones de carbohidratos como glucosa o almidón (Majerski et al, 2006; Scott, 1991; Underwood et al, 1994; 1995), del metabolismo del sorbitol (un edulcorante hipocalórico) y a partir de la degradación oxidativa del ascorbato y del xilitol (O’Brien et al, 2005). También puede ser sintetizado a partir de ácido dihidroximaleico (Majerski et al, 2006), del etilenglicol (Seto et al, 1991) y de la pirolisis de materiales lignocelulósicos para la producción de biocombustibles, encontrándose a concentraciones entre 60 – 1440 mg/l (Katsunobu y Shiro, 2002; Piskorz et al, 1986; Xin et al, 2009). En la industria alimentaria es de gran utilidad para mejorar el color de los alimentos, debido a que su naturaleza de compuesto carbonilo le confiere una alta capacidad 33 I. Introducción pardeante (Hayashi y Namiki, 1986; Vitasari, 2010). Una interesante aplicación del glicolaldehído o sus mezclas con otros productos carbonilos, es como promotor de pardeamientos durante la elaboración de alimentos cocidos, en las cuales los aldehídos, cetonas y azúcares reductores reaccionan con aminas, aminoácidos y proteínas; dentro de las cuales las reacciones más importantes son las de tipo amino-carbonilo o reacciones de Maillard (Majerski et al, 2006), sin impartir el indeseable sabor ahumado de otras técnicas a los alimentos tratados (Underwood et al, 1995). Además puede ser aplicado como un agente de entrecruzamiento en materiales de naturaleza proteica (Geoghegan et al, 1979), siendo una ventajosa aplicación en este sentido su uso en el fortalecimiento de envolturas para embutidos. En vinos, el glicolaldehído aparece principalmente gracias a la actividad de las bacterias lácticas durante la fermentación maloláctica (FML) debido a la reducción del glioxal procedente de la degradación de los azúcares (Flamini y Dalla Vedova, 2003). Su concentración en vinos Cabernet sauvignon varía tras la FML, siendo antes de ésta de 0,05 mg/l y tras la FML puede llegar a valores de 0,39 mg/l. Mientras que en otras variedades como Chardonnay puede pasar de 0,04 a 0,11 mg/l (Flamini y Traldi, 2010). I.3.3.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído El efecto inhibitorio del glicolaldehído en Saccharomyces cerevisae ha sido evaluado durante la fermentación alcohólica para producir biocombustibles (Jayakody et al, 2011; Katsunobu y Shiro, 2002; Piskorz et al, 1986; Xin et al, 2009), ya que posee un átomo de carbono altamente electrofílico, el cual interacciona con moléculas de carga negativa dentro de la célula (Jayakody et al, 2011), lo cual incluye la interacción con el par de 34 I. Introducción electrones del nitrógeno de los grupos amino de las proteínas, conduciendo a la formación de bases de Schiff (Glomb y Monnier, 1995). Estas bases de Schiff a su vez sufren reordenamientos de Amadori, formando cetoaminas estables, que interaccionan con el nitrógeno de otras proteínas, resultando en el entrecruzamiento de proteínas y una eventual formación de melanoidinas (Hayashi y Namiki, 1986). Por otro lado, la cisteína con bajo pKa puede convertirse en anión tiolato; el glicolaldehído interacciona con las cargas negativas de estes anión, conduciendo a la inactivación de las enzimas que contengan cisteína (Jayakody et al, 2011). Reacciones que causan efectos en la actividad metabólica de la levadura. Un estudio reciente ha mostrado que el glicolaldehído ejerce un mayor efecto inhibitorio en el crecimiento celular de S. cerevisiae que otros bloqueadores metabólicos como el furfural y el HMF, aunque su efecto inhibitorio en la producción de etanol no se ha evaluado en dicho estudio (Jayakody et al, 2012), destacando además que la levadura convierte el glicolaldehído en etilenglicol como estrategia para disminuir su efecto inhibitorio, y al parecer la enzima involucrada sería la ADH (Figura I.9), proceso análogo a la conversión de otros bloqueadores como el furfural (Liu et al, 2005) y la ovainillina (Larsson et al, 2000) antes mencionados. NAD+ NADH HO HO O OH Reducción Glicolaldehído Etilenglicol Figura I.9. Conversión del glicoladehído a etilenglicol por S. cerevisiae (Jayakody et al, 2012). 35 I. Introducción Con respecto a su efecto sobre S. cerevisiae, Jayakody et al (2011) demostraron que se inhibe hasta el 58 y 83 % del crecimiento celular de al dosificar concentraciones de glicolaldehído (en su forma de dímero, masa molecular: 120 g/mol) de 600 y 1200 mg/l respectivamente, en un medio modelo suplementado con 10 % de glucosa. Además a una concentración de glicolaldehído de 120 mg/l, la producción de etanol es inhibida un 43 % con respecto al control, mientras que a 600 mg/l la inhibición es del 72 %. A 1200 mg/l, la producción de etanol es casi nula, aunque a concentraciones de glicolaldehído superiores a 240 mg/l se puede reducir el consumo de azúcares por la levadura. 36 I. Introducción I.3.4. Quinonas Las quinonas (Figura I.10) son moléculas presentes ampliamente en la naturaleza y tanto éstas como sus derivados han sido estudiados por su efecto inhibitorio en Saccharomyces cerevisiae, como la 2-metil-1,4-naftoquinona (menadiona), 9,10fenantrenoquinona (9,10-PQ) (Rodriguez et al, 2004; 2005) y la p-benzoquinona (Larsson et al, 2000). También se ha estudiado el efecto de sus derivados, sintetizados durante la hidrólisis de la lignocelusa para la producción de biocombustible como son el catecol (Jönsson et al, 1998) y de la hidroquinona (Larsson et al, 1999), derivados de los isómeros o-benzoquinona y p-benzoquinona, respectivamente. O O O O CH3 O p-Benzoquinona O Menadiona 9,10-Fenantrenoquinona Figura I.10. Moléculas de quinonas con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae. De todas estas moléculas, la p-benzoquinona, llamada también 1,4-benzoquinona, pquinona, benzoquinona o simplemente quinona, es la que mayor efecto inhibitorio presenta sobre el crecimiento celular y producción de etanol en S. cerevisiae, mucho mayor que su derivado hidroquinona (Larsson et al, 2000), efecto inhibitorio que como para la mayoría de las quinonas depende también de sus propiedades químicas. 37 I. Introducción I.3.4.1. Efecto inhibitorio de las quinonas En Saccharomyces cerevisiae el efecto inhibitorio de las quinonas se manifiesta por dos mecanismos: la formación de enlaces covalentes con moléculas biológicas por adición química de Michael (Figura I.11a), y la reducción catalítica del oxígeno a superóxido y otras especies oxígeno reactivas (ERO) (Figura I.11b) (Rodriguez et al, 2004). a. Adición química de Michael O O + OH RS- RS- O RS OH O RS-: Nucleófilo p-Benzoquinona b. Generación de ERO O O O. -O 1/2 NADPH 1/2 NADP+ OH HO 1/2 NADPH 1/2 NADP+ O CH3 O2.- O2.Menadiona O2 O2 O 9,10-PQ Figura I.11. Mecanismos involucrados en el efecto inhibitorio de las quinonas sobre Saccharomyces cerevisiae (Rodriguez et al, 2004). En el primer caso pueden actuar como electrófilos vía adición química en los carbonos 1 y 4, conduciendo a una modificación covalente de moléculas biológicas en sus sitios nucleofílicos, como en los tioles de las proteínas. En el segundo caso, pueden 38 I. Introducción oxidarse/reducirse en presencia de un reductante biológico y oxígeno para generar ERO tales como superóxido (O2-) o peróxido de hidrógeno (H2O2), los cuales pueden ser perjudiciales (O’Brien, 1991; Monks et al, 1992; Kumagai et al, 2002). Tal es el caso de la pbenzoquinona en el primer caso, y las quinonas 2-metil-1,4-naftoquinona (menadiona) y 9,10-fenantrenoquinona (9,10-PQ) en el segundo caso. Rodriguez et al (2004) evaluaron el efecto de las quinonas antes mencionadas en un medio con 2% de glucosa, observando que su efecto inhibitorio sobre la tasa de crecimiento celular (IC50) en S. cerevisiae era variable en función del mecanismo de inhibición. La menadiona a menor dosis fue más efectiva en condiciones de aerobiosis (5,7 mg/l) que en anaerobiosis (24,3 mg/l), al igual que la 9,10-PQ a concentraciones de 2,9 y 7,5 mg/l para condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, respectivamente. En contraste, la p-benzoquinona, en anaerobiosis mostró un mayor efecto inhibitorio a una menor dosis (3,2 mg/l) frente a los 5,3 mg/l necesarios en aerobiosis. Además, la sensibilidad de S. cerevisiae a las quinonas depende del momento en el cual se dosifican en el medio. Una concentración de 1 mg/l de 9,10-PQ dosificada en las primeras etapas de la fase exponencial en condiciones aeróbicas produjo una reducción de la viabilidad celular en más del 90%, así como una pérdida en la actividad de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada (GAPDH) en un 70% en comparación a las dosificaciones en otras etapas de la fermentación. En base a estos resultados, los mismos autores llevaron a cabo otro estudio con la 9,10-PQ dosificada al principio de la fase logarítmica pero bajo condiciones de anaerobiosis, obteniendo resultados similares a los anteriores. 39 I. Introducción Por otro lado, al comparar el efecto inhibitorio de la 9,10-PQ y la p-benzoquinona en condiciones anaeróbicas sobre la actividad enzimática de la GAPDH de S. cerevisiae, se observó una mayor afinidad de la p-benzoquinona con respecto a la enzima - clave en la síntesis de ATP glicolítico y en la producción de ácido pirúvico como intermediario en la producción de etanol -, a una dosis mucho menor que la 9,10-PQ (Rodriguez et al, 2005). Resultados comparables a los obtenidos por Larsson et al (2000), quienes evaluaron comparativamente el efecto de diferentes concentraciones de derivados lignocelulósicos y la p-benzoquinona sobre el crecimiento celular y la producción de etanol en S. cerevisiae, siendo la p-benzoquinona la que mayor efecto mostró, inhibiendo totalmente la producción de etanol y el crecimiento celular a dosis de 20 mg/l. 40 I. Introducción I.3.5. Ácido cinámico El crecimiento celular y producción de etanol en Saccharomyces cerevisiae son afectados por derivados fenilpropanos producidos durante la hidrólisis de lignocelulosa para la producción de biocombustibles, dentro de los cuales están los ácidos p-cumárico, ferúlico y 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico, el coniferil aldehído (Larsson et al, 1999), coniferil alcohol, eugenol e isoeugenol (Jönsson et al, 1998). También se ha evaluado el efecto de otro derivado fenilpropano, el ácido cinámico (Larsson et al, 2000), conocido también como ácido fenilacrílico, ácido 3-fenilacrílico, ácido 3-fenilpropenoico o ácido 3-fenil-2-propenoico (Figura I.12). Ácido utilizado en la industria farmacéutica y en perfumería (Villavecchia y Eigenmann, 1982), así como saborizante en la industria alimentaria (FDA, 2011; Adams et al, 2004), cuyas concentraciones van desde 0,01 ppm en caramelos hasta 712 ppm en bebidas alcohólicas (Waddell et al, 2007). Siendo también utilizado en productos de panadería, bebidas no alcohólicas, gelatinas, lácteos congelados, etc. Además está incluido en la lista de sustancias permitidas en alimentos por el Consejo Europeo (Council of Europe, 2000). Naturalmente, el ácido cinámico se forma en las plantas superiores como un producto intermedio en la biosíntesis de isoflavonoides (Harada y Mino, 1973; Kape et al, 1991), encontrándose en forma libre o esterificado en productos como el bálsamo de Perú (Myroxylon balsamum), bálsamo de Tolú (Myroxylon toluiferum o Toluifera balsamum) o canela de Ceilán (Cinnamomum zeylanicum o Cinnamomum verum) (Villavecchia y Eigenmann, 1982). En vinos se encuentran sus derivados hidroxicinámicos como son los ácidos cafeico, ferúlico y p-cumárico, procedentes de la uva, ya sea esterificados con ácido tartárico o con glucosa, o en forma libre, más abundantes en uvas tintas que en 41 I. Introducción blancas, llegando hasta 100 ppm en vinos tintos y hasta 5 ppm en vinos blancos (Gil Hernández, 2010). COOH CH COOH COOH COOH CH CH CH CH CH CH CH OCH3 OCH3 H3CO OH OH OH Ácido cinámico Ácido ferúlico CHO CH2OH CH2 CH3 CH CH CH CH CH CH CH2 CH OCH3 OH Coniferil aldehído Ácido p-cumárico OCH3 Ácido 3,5-dimetoxi-4hidroxicinámico OCH3 OCH3 OH OH Coniferil alcohol Eugenol OH Isoeugenol Figura I.12. Derivados fenilpropanos evaluados como inhibidores de Saccharomyces cerevisiae. I.3.5.1. Efecto inhibitorio del ácido cinámico Su efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiado en la producción de biocombustibles (Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2000), ya que puede inhibir el 95% del crecimiento celular y el 58% de la producción de etanol a una dosis de 1 g/l. Mientras que una dosis de 200 mg/l tan sólo inhibe el crecimiento celular en un 76% (Larsson et al, 2000). 42 I. Introducción Como estrategia para disminuir su efecto inhibitorio, diferentes microorganismos fermentativos han mostrado su capacidad de metabolizar el ácido cinámico, convirtiéndolo principalmente en estireno (llamado también vinilbenceno, cinameno, feniletileno o etenilbenceno), por ejemplo las levaduras Cryptococcus elinovii (Middelhoven y Gelpke, 1995) y Pichia carsonii (Shimada et al, 1992), ambas en condiciones aeróbicas, o por la levadura Saccharomyces cerevisiae, en condiciones anaeróbicas (Chen y Peppler, 1956; Schwarz et al, 2012a; 2012b). El mecanismo mediante el cual el ácido cinámico es convertido en estireno no está claramente dilucidado, sin embargo, podría ser parcialmente explicado por el trabajo de Chen y Peppler (1956) en el cual utilizaron cinamaldehído, que fue convertido por S. cerevisiae en estireno, proceso que tiene como metabolito intermedio al ácido cinámico, para lo cual utilizaron una cepa mutante en un medio con sacarosa y en condiciones anaeróbicas. En base a sus resultados propusieron dos alternativas, en primer lugar que el cinamaldehído podría ser oxidado a ácido cinámico (Figura I.13a), el cual a su vez se convertiría en estireno por simple descarboxilación. Como segunda alternativa, propusieron una hidratación del cinamaldehído, para posteriormente liberar estireno y ácido fórmico (Figura I.13b). Aunque sus resultados no respaldan la última propuesta, puede constituir una alternativa para explicar la formación de estireno. 43 I. Introducción a. Alternativa 1: Formación y descarboxilación del ácido cinámico COOH CHO CH2 CH CH H2O CO2 CH Cinamaldehído deshidrogenasa Cinamaldehído CH CH Descarboxilasa Estireno Ácido cinámico b. Alternativa 2: Formación y escisión del hidrato de cinamaldehído OH HO CH CHO CH H2O CH CH CH2 CH CH + Estireno Cinamaldehído HCOOH Ácido fórmico Figura I.13. Posibles mecanismos propuestos para la formación de estireno a partir de cinamaldehído por Saccharomyces cerevisiae (Chen y Peppler, 1956). Con respecto a la descarboxilación propuesta por Chen y Peppler (1956) como vía para metabolizar y eliminar el ácido cinámico del medio fermentativo, en trabajos posteriores también se ha descrito dicho proceso (Gramatica et al, 1981; Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010; Schwarz et al, 2012a), el cual se llevaría a cabo de manera simultánea por las enzimas descarboxilasa del ácido fenilacrílico (PAD) y descarboxilasa del ácido ferúlico (FDC) de Saccharomyces cerevisiae, para convertir los ácidos cinámico, ferúlico y pcumárico en sus derivados vinilos tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas (Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2001), los dos últimos en 4-vinilguayacol y 4-vinilfenol respectivamente (Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010). La conversión del ácido 44 I. Introducción cinámico en estireno ocurriría mucho más rápido sobre todo durante las primeras etapas de la fermentación (Schwarz et al, 2012a; 2012b), iniciándose inmediatamente después de la inoculación de la levadura sin un periodo de adaptación al nuevo medio. Por otro lado, Shimada et al (1992), trabajaron con una cepa de Pichia carsonii capaz de tolerar hasta 200 mg/l de ácido cinámico (en su forma trans), cepa que tiene la capacidad de producir estireno a partir de los ácidos trans-p-cumárico y cafeico, ácidos asociados a la degradación microbiana del ácido trans-cinámico, lo cual indicaría una nueva vía mediante la cual las levaduras podrían metabolizar el ácido cinámico, utilizando dichos ácidos como intermediarios (Figura I.14). Proceso que podría ocurrir en simultáneo con la descarboxilación propuesta por Chen y Peppler (1956). COOH COOH COOH CH CH CH CH CH CH HO OH Ácido trans-cinámico Ácido trans-p-cumárico OH Ácido cafeico CH2 CH CO2 Estireno Figura I.14. Vía de degradación del ácido trans-cinámico por la levadura Pichia carsonii propuesta por Shimada et al (1992). 45 I. Introducción 46 I. Introducción I.3.6. Otros ácidos orgánicos En el contexto de la producción de biocombustibles también se ha evaluado el efecto inhibitorio de ácidos orgánicos como el benzoico, acético, butanoico, propiónico, fórmico, láctico, succínico y levulínico (Hawkins y Doran-Peterson, 2011; Huang et al, 2011), algunos de los cuales forman parte de los alimentos (Cubero et al, 2002), ya sea de forma natural o como aditivos (European Union, 2011; FDA, 2013; García Araez 1953). Dichos ácidos son producidos durante el pretratamiento de la lignocelulosa, encontrándose por ejemplo en hidrolizados de madera de pino hasta en concentraciones de: ácido benzoico (15 mg/l), fórmico (425 mg/l), láctico (100 mg/l), acético (2153 mg/l), succínico (28 mg/l) y levulínico (410 mg/l) (Hawkins y Doran-Peterson, 2011). Estos ácidos han sido identificados como los principales inhibidores de la fermentación alcohólica por S. cerevisiae (Huang et al, 2011), siendo el benzoico el que mayor efecto presenta y a menor concentración, pues a 1 g/l puede reducir en un 75% la producción de etanol con respecto al control, siendo su concentración crítica de inhibición 2 g/l. Nivel crítico que para el ácido acético fue 6 g/l, fórmico 4 g/l, butanoico 3 g/l y propiónico 4 g/l. La vainillina mostró este nivel en 4 g/l, mientras que el furfural y el HMF mostraron niveles críticos mayores a 4 g/l. Siendo el nivel crítico la concentración mínima a la cual la inhibición de la síntesis de etanol es mayor al 90%. I.3.6.1. Efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos Los ácidos débiles producen un descenso en la producción de etanol y biomasa (Pampulha y Loureiro-Dias, 1989; Taherzadeh et al, 1997; Hazan et al, 2004; Hawkins y 47 I. Introducción Doran-Peterson, 2011; Huang et al, 2011), aunque el mecanismo por el que se produce el efecto inhibitorio no está completamente aclarado. Uno de los mecanismos propuesto es la teoría del desacoplamiento. Según esta teoría, el efecto depende del pKa de los ácidos y del pH del medio. Únicamente la forma no disociada de los ácidos penetra en la célula por difusión (Verduyn et al, 1992), donde, debido al mayor pH intracelular se disocia, provocando un descenso del pH (Pampulha y Loureiro-Dias, 1989) que debe ser compensado por una ATPasa de membrana que bombea protones al exterior a costa de la hidrólisis de ATP. La menor cantidad de ATP disponible para la formación de biomasa explicaría la disminución del crecimiento celular en presencia de los ácidos. Cuando la concentración de ácido es suficientemente alta, se supera la capacidad de bombeo de protones, lo que origina la acidificación del citoplasma y la muerte celular (Imai y Ohono, 1995). Otro mecanismo propuesto, es la acumulación intracelular de aniones (Russel, 1992), según la cual, mientras que los protones son excretados los aniones son acumulados en el interior celular. La inhibición podría estar relacionada con la toxicidad de estos aniones. Probablemente, el efecto de estos ácidos también se deba a una acción directa sobre la integridad de la membrana (Heipieper et al, 1994), mediante una inserción que altera su estructura e hidrofobicidad, produciendo un aumento de la permeabilidad de la misma y afectando a su función de barrera selectiva. 48 I. Introducción I.3.7. Metales La presencia de metales pesados constituye un problema en los procesos fermentativos, teniendo muchas veces que recurrir a su eliminación mediante diferentes procedimientos (Ergun et al, 1997). Los iones metálicos pueden cambiar la tasa de glicólisis y por tanto la conversión del piruvato a etanol (Pons y Chanel, 1991; Chandrasena et al, 1997; Walker y Maynard, 1997). Sin embargo los mecanismos mediante los cuales estos metales actúan no están del todo claros. I.3.7.1. El cobre El cobre (Cu) es un nutriente esencial para todos los organismos, siendo el tercer metal de transición más abundante en organismos vivos y es un grupo prostético esencial de enzimas como la citocromo oxidasa en la mitocondria (Silva y Williams, 1993), superóxido dismutasa en el citosol, requerida para la detoxificación de radicales libres (Brandolini et al, 2002) y ferrooxidasa en la membrana plasmática. Es uno de los microelementos esenciales requerido en numerosas actividades celulares, incluyendo la absorción de hierro (Dancis et al, 1994; Eide, 1998; Linder et al, 1996; Stearman et al, 1996; Fernandez et al, 1998; O’Halloran y Culotta, 2000). A bajas concentraciones, puede actuar como un micronutriente esencial para el crecimiento microbiano, sirviendo como cofactor enzimático y como resultado de su capacidad para experimentar transiciones de Cu (I) a Cu (II), desempeña un importante rol en las reacciones redox (Cervantes y Gutierrez-Corona, 1994; Stohs y Bagchi, 1995). 49 I. Introducción Uno de sus orígenes más comunes está en el tratamiento de los viñedos contra el hongo del mildiu mediante la utilización de sustancias como el sulfato de cobre (Pons y Chanel, 1991). En los mostos usualmente el cobre se puede encontrar en concentraciones entre 0,64 – 6,40 mg/l (Curvelo-Garcia, 1988) y algunas veces es añadido al vino para reducir los niveles de sulfuroso y sustancias relacionadas. El contenido en vinos, como algunos de los elaborados en Estados Unidos, se encuentra en el rango entre 0,1 – 0,3 mg/l, aunque el Código Internacional de Prácticas Enológicas (OIV, 2008) acepta un límite máximo de 1 mg/l. A mayores concentraciones, el Cu puede inducir la oxidación de los compuestos fenólicos y a concentraciones superiores a 9 mg/l puede inhibir la fermentación alcohólica (Zoecklein et al, 1999). I.3.7.2. Efecto inhibitorio del cobre Se conoce que el Cu es transportado al interior celular por las proteínas transportadoras Ctr1p y Ctr3p (copper transporter protein), y distribuido entre las proteínas para las cuales es requerido. Además existen sensores celulares que detectan altas concentraciones de Cu, activando los mecanismos de protección (producción de metalotioneínas, que se unen al Cu) y desactivando los mecanismos de transporte (Knight et al, 1996; Santoro y Thiele, 1997). En general se han descrito algunos mecanismos de toxicidad de los metales pesados sobre Saccharomyces cerevisiae (Blackwell et al, 1995), toxicidad que depende de la cepa y de las condiciones de crecimiento (Sarais et al, 1994; Pearce y Sherman, 1999). Del mismo modo se han documentado los mecanismos de protección y desarrollo de tolerancia (Paraggio et al, 1997; Perego y Howell, 1997). La tolerancia de algunas cepas se 50 I. Introducción ha asociado con el incremento de la actividad de determinadas enzimas como la Cu/ZnSOD o la H(+)ATPasa (Fernandes y Sá-Correia, 1999), tolerancia que incrementa al realizar cultivos repetidos de la levadura en presencia de los metales y que afecta la absorción de estos metales por la célula (White y Gadd, 1986; Brady et al, 1994a). Los efectos del Cu están relacionados a la fuerte capacidad de coordinación de los metales pesados, y ellos incluyen bloqueo de grupos funcionales y modificación conformacional de macromoléculas celulares, desplazamiento de iones esenciales y disrupción de membranas organelares y celulares (Gadd, 1993). Interactúa con los ácidos nucleicos celulares y con sitios activos de las enzimas, aunque se considera que la membrana plasmática es el principal sitio de acción (disrupción de la membrana) (Ohsumi et al, 1988; Cervantes y Gutierrez-Corona, 1994; Stohs y Bagchi, 1995). Por tanto, la exposición a elevadas concentraciones de Cu puede conducir a un rápido debilitamiento de la membrana celular, lo cual generalmente se manifiesta a través de la pérdida de solutos celulares como el potasio (K+) y la muerte celular (Ohsumi et al, 1988; Avery et al, 1996). Otros metales menos tóxicos como el Zn, Co y Mn no inducen un eflujo de K+ de esta naturaleza (Ohsumi et al, 1988). Además, su efecto inhibitorio podría deberse presumiblemente a la unión indiscriminada del Cu a restos tiol, o por catalizar reacciones tipo Fenton, produciendo el radical hidroxilo (OH-) altamente dañino (Stillman y Presta, 2000), a partir del peróxido de hidrógeno (H2O2) y del anión superóxido (O-2) (Halliwell y Gutteridge, 1999; Avery, 2001). La exposición a niveles sub letales de Cu induce un estrés oxidativo similar al inducido por los radicales libres (ERO) (Shanmuganathan et al, 2004). 51 I. Introducción Efectos similares reportados en organismos superiores son atribuidos a la naturaleza redox del Cu y a su capacidad de catalizar la generación de ERO y promover la peroxidación lipídica de la membrana (Mehlhorn, 1986; Halliwell y Gutteridge, 1999; Stohs - - y Bagchi, 1995). Las ERO como H2O2, O 2 y OH se generan normalmente durante el metabolismo aeróbico (Richter y Schweizer, 1997), pudiendo comprometer severamente la salud y viabilidad celular al causar daño en macromoléculas como ácidos nucleicos y proteínas celulares, ya sea a través de la oxidación de aminoácidos a derivados hidroxilo o carbonilo, o por ruptura de sus enlaces peptídicos (Cabiscol et al, 2000; Costa et al, 2002). Las proteínas individualmente muestran diferentes susceptibilidades al ataque oxidativo, dependiendo de su composición en grupos sulfhidrilo, clusters Fe-S, fracciones hemo y grupos prostéticos de cobre (Davies, 1995). El daño oxidativo a las membranas lipídicas, ha sido identificado como un modo de acción sobre Saccharomyces cerevisiae (Avery et al, 1996; Howlett y Avery, 1997), toxicidad que incrementa considerablemente con la insaturación de los ácidos grasos de la membrana plasmática, promoviendo una mayor permeabilización de ésta (Avery et al, 1996), convirtiendo a los ácidos grasos poliinsaturados en el principal objetivo de los radicales libres (Halliwell y Gutteridge, 1999). El estrés oxidativo ocurre durante las primeras horas de exposición y es un proceso dinámico que involucra a enzimas claves en el catabolismo de la glucosa como la alcohol deshidrogenasa (ADH), enolasa, fructosabifosfato aldolasa (aldolasa), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfoglicerato quinasa, entre otras (Shanmuganathan et al, 2004). La oxidación de la enzima ADH es un mecanismo por el cual la fermentación de la glucosa puede ser rápidamente afectada, que junto con la aparente oxidación de otras enzimas 52 I. Introducción glicolíticas, produce una respuesta metabólica celular similar a otras formas de estrés oxidativo (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003). Esta respuesta involucra un redireccionamiento metabólico transitorio de equivalentes de glucosa a través de la vía de la pentosa fosfato (que resulta de la inactivación selectiva de determinadas enzimas glicolíticas). Se ha propuesto que este cambio metabólico puede proveer el poder reductor necesario (NADPH2) para las enzimas antioxidantes como las glutaredoxina (Holmgren, 1989; Godon et al, 1998; Cabiscol et al, 2000). Los organismos aeróbicos han desarrollado una red de mecanismos de defensa contra las ERO, que incluyen moléculas encargadas de eliminarlas (por ejemplo superóxido dismutasas, catalasas), enzimas reparadoras del daño oxidativo (por ejemplo metionina sulfóxido reductasa) (Cadenas, 1989; Santoro y Thiele, 1997; Jamieson, 1998; Avery y Avery, 2001), y mecanismos tales como la S-tiolación de proteínas susceptibles de oxidación, lo cual previene la oxidación por formación reversible de enlaces disulfuro mixtos con tioles (Grant et al, 1998). 53 I. Introducción 54 II. Objetivos CAPÍTULO II: OBJETIVOS 55 II. Objetivos 56 II. Objetivos II.1. Objetivo general Realizar una valoración sobre el efecto de los diferentes bloqueadores metabólicos sobre la producción de etanol por la levadura Saccharomyces cerevisiae en diferentes condiciones de fermentación y su repercusión en la composición de los vinos elaborados, estudiando las desviaciones en los parámetros tecnológicos más representativos. II.2. Objetivos específicos - Verificar el grado de especificidad de cada bloqueador metabólico en relación a la levadura sobre la que actúa, así como el efecto con respecto a diferentes condiciones de fermentación como temperatura, pH y concentración de azúcares en el mosto. - Estudiar el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de metabolitos secundarios de importante repercusión en el vino como la glicerina, aldehídos, alcoholes, ácidos, ésteres y cetonas. Así como su efecto sobre los parámetros colorimétricos más importantes, especialmente en vinos tintos. - Estudiar el momento óptimo de adición de los bloqueadores metabólicos, determinando la etapa fermentativa en la que tienen un mayor efecto inhibitorio, así como los mecanismos mediante los cuales son metabolizados por las levaduras y la síntesis de compuestos derivados que puedan tener repercusión en el vino. 57 II. Objetivos 58 III. Materiales y métodos CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS III.1. Levaduras empleadas III.2. Medios de fermentación III.3. Bloqueadores metabólicos utilizados III.4. Fermentaciones III.5. Análisis realizados tras las fermentaciones III.6. Análisis estadístico 59 III. Materiales y métodos 60 III. Materiales y métodos III.1. Cepas de levaduras utilizadas Se han empleado diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae: 7VA (D.O. Ribera del Duero) y CM15 (D.O. Somontano), aisladas por el Grupo de Investigación enotecUPM de la Universidad Politécnica de Madrid. Además de las cepas comerciales Distinction y AWRI796 (Maurivin, Queensland, Australia). La cepa AWRI796, catalogada como una levadura de bajo rendimiento de etanol y alta producción de glicerina (Maurivin, 2013), ha sido previamente evaluada como una cepa glicolíticamente ineficiente al producir bajas cantidades de etanol (Loira et al, 2012). III.2. Medios de fermentación Se han utilizado tres tipos de medios fermentativos: - Medio sintético a base de extracto de levadura (3 g/l), peptona (3 g/l), tartrato de potasio (0,8 g/l) (Pronadisa, España) y de concentraciones variables de azúcar, principalmente glucosa (Panreac, Barcelona, España). - Medios a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen suplementandos con 200 mg/l de activador de fermentación Actimax PLUS (Agrovin, España). - Medios fermentativos a partir de mosto fresco de uva tinta de las variedades Tempranillo y Syrah, para estudiar el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros tecnológicos más representativos en vinos tintos. 61 III. Materiales y métodos Los medios fermentativos se han utilizado a concentraciones variables de azúcar para verificar el efecto de los bloqueadores en función del grado alcohólico probable (GAP). El pH se ha estandarizado a 3,5 mediante la adición de ácido tartárico (Pronadisa, Madrid, España), excepto en los ensayos en los que se ha estudiado el efecto de diferentes valores de pH, lo cual se indica en el apartado correspondiente. Antes de inocular los medios con las respectivas levaduras, se han sometido a un proceso de pasteurización a 100 ºC por 3 minutos con el fin de reducir la carga microbiana que pueda estar presente en los medios fermentativos. III.3. Bloqueadores metabólicos utilizados Se han utilizado los siguientes compuestos reportados en la bibliografía por su capacidad para inhibir la fermentación alcohólica en Saccharomyces cerevisiae: furfural (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Alemania), o-vainillina, glicolaldehído, pbenzoquinona, ácido trans-cinámico (Fluka, Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza) y cobre como CuSO4.5H2O (Panreac, Barcelona, España). Todos ellos adicionados en los medios fermentativos según se describe en los apartados correspondientes. III.4. Fermentaciones Las microfermentaciones se han realizado con los medios fermentativos inoculados con las cepas de Saccharomyces cerevisiae a una densidad celular del orden de 108 UFC/ml sincronizadas en medio YEPD (Yarrow, 1998). Los microvinificadores en los cuales se han realizado las fermentaciones han variado en función del volumen de medio utilizado 62 III. Materiales y métodos y de los análisis a realizar para cada ensayo. Todos ellos con un volumen de operación equivalente al 70% de su capacidad. En los ensayos para determinar únicamente el grado alcohólico y azúcares residuales se han utilizado microvinificadores de 10 ml, mientras que para realizar los análisis antes mencionados además de glicerina, acidez volátil, parámetros colorimétricos y compuestos volátiles, se han utilizado microvinificadores de 60 ml. Todos ellos sellados con el fin de mantener las condiciones amicróbicas y tan sólo permitir la salida de CO2, como se muestra en la Figura III.1. Los microvinificadores de 60 ml se han sellado con válvulas Müller llenas con H2SO4 al 98 % (Panreac, Barcelona, España). 10 ml 60 ml Figura III.1. Microvinificadores utilizados en las fermentaciones. En la mayoría de los experimentos la temperatura se ha mantenido constante, en torno a 22 ºC, excepto en la prueba donde se estudió el efecto de diferentes temperaturas en la inhibición de la fermentación alcohólica por el furfural, a 18 y 25 ºC. Los viales se han pesado diariamente con el fin de determinar gravimétricamente el final de la 63 III. Materiales y métodos fermentación, tras lo cual se ha procedido a realizar los diferentes análisis descritos a continuación. III.5. Análisis realizados tras las fermentaciones III.5.1. Determinación del grado alcohólico El grado alcohólico final alcanzado en las diferentes fermentaciones se ha determinado mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección por índice de refracción (HPLC-RI), para lo cual se ha utilizado un cromatógrafo Waters e2695 Alliance (Waters, EE.UU.) acoplado a un detector RI 2412 (Figura III.2). La separación se ha realizado utilizando una columna PhenoSphere-Next 5u C18 de tamaño 150 x 4,6 mm (Phenomenex, EE.UU.). Previo al análisis cromatográfico se ha realizado un calibrado con soluciones de 5, 10, 15 y 20 % de etanol grado HPLC al 99,5% (Panreac, España). Aproximadamente 1 ml de muestra fue filtrada en membrana de 0,45 μm (Teknokroma, Barcelona, España) y añadido en viales de vidrio de 2 ml con tapa de PTFE/silicona. III.5.2. Determinación de azúcares residuales y glicerina En base a los métodos oficiales de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) para azúcares residuales (OIV-MA-AS311–02) y para glicerina (OIV-MAAS312-05). Con este propósito se ha utilizado un equipo automático de análisis mediante test enzimático Biosystems Y15 (Biosystems S.L., España) (Figura III.2). 64 III. Materiales y métodos A B Figura III.2. A: Equipo HPLC-RI (Waters) para determinar el grado alcohólico. B: Analizador automático (Biosystems Y15) para determinar azúcares residuales y glicerina. III.5.3. Parámetros colorimétricos Las variables de color se han determinado por absorbancia utilizando un espectrofotómetro Agilent 8453 UV-visible System, a 420, 520 y 620 nm utilizando una cubeta de cuarzo de 1 mm de longitud de paso de luz, en base a la metodología propuesta por Glories (1984a; 1984b). Se han calculado la intensidad colorante (IC), tonalidad (T) y los porcentajes de rojo, amarillo y azul. III.5.4. Determinación de la acidez volátil La acidez volátil se ha determinado mediante el Método Oficial de la Organización Internacional de la Viña y el Vino para acidez volátil (OIV-MA-AS313–02), el cual consiste en una valoración ácido–base de los ácidos volátiles, los cuales se han separado 65 III. Materiales y métodos haciendo uso de un destilador automático DEE Gibertini conectado a una unidad generadora de vapor VADE 3 Gibertini (Gibertini Electrónica SRL, Novate, Italia). III.5.5. Análisis de compuestos volátiles de origen fermentativo El análisis de los compuestos volátiles de origen fermentativo se ha realizado por cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID), empleando el cromatógrafo Agilent Technologies 6850 (Network GC System) equipado con un detector de ionización de llama integrado (Figura III.3). Se ha empleado una columna DB-624 (60 m x 250 μm x 1,4 μm nominal). La temperatura del inyector fue de 250 ºC y la del detector 300 ºC. La temperatura de la columna fue de 40 ºC durante los 5 primeros minutos y linealmente programada a 10 ºC/min hasta 250 ºC, manteniendo a esa temperatura final durante 5 minutos. El gas de arrastre fue hidrógeno, suministrado mediante el generador LNI Schmidlin SA, con un flujo de 22,1 l/min. La inyección fue de tipo split, con un split ratio de 1:10. El límite de detección fue de 0,1 mg/l. Se ha utilizado 4-metil-2-pentanol como estándar interno y como patrones de referencia externos: acetaldehído, metanol, 1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, 2-metil-1butanol, 3-metil-1-butanol, 2-feniletanol, hexanol, 2,3-butanodiol, diacetilo, acetoína, acetato de etilo, lactato de etilo, acetato de isoamilo y acetato de 2-feniletilo (Fluka, Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza). 1 ml de muestra - filtrado en membrana de 0,45 μm (Teknokroma, Barcelona, España) fue añadido y mezclado con 100 μl del estándar interno (4-metil-2-pentanol, concentración de 500 mg/l) en viales de vidrio de 2 ml con tapa de PTFE/silicona. 66 III. Materiales y métodos A B Figura III.3. Equipos (Agilent) para análisis cromatográfico. A: GC-FID para analizar compuestos volátiles fermentativos. B: GC-MS para analizar el contenido residual de los bloqueadores metabólicos y sus derivados. III.5.6. Análisis de los bloqueadores metabólicos y sus derivados tras las fermentaciones La metodología descrita a continuación se ha desarrollado para determinar el contenido residual de los diferentes bloqueadores metabólicos y/o sus derivados una vez finalizada la fermentación alcohólica. Dichos compuestos fueron separados del vino por extracción líquido-líquido con diclorometano (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Alemania) y luego identificados y cuantificados por cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas (GC-MS), para lo cual se utilizó un espectrómetro de masas Agilent 5973 Network acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 6890 N (Figura III.3). Empleando una columna Agilent 122-7032 DB-WAX (30 m x 250 μm x 0,25 μm nominal), calibrada con los siguientes patrones externos: alcohol vainíllico, o-vainillina y ácido transcinámico (Fluka, Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza), vainillina, furfural, alcohol furfurílico y 3,4-dimetilfenol como estándar interno (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Alemania). Utilizando un inyector Agilent 7683 Series con una temperatura de trabajo de 200 ºC y un volumen de inyección de 1 μl. La temperatura del 67 III. Materiales y métodos detector fue de 280 ºC. El gas de arrastre fue helio, con un flujo de 24,4 ml/min. La inyección fue de tipo split, con un ratio de 1:20. Trabajando en modo SCAN, e identificando los iones en modo SIM. Para lo cual se tomaron 10 ml del vino y se colocaron en tubos tipo Falcon de 15 ml, agregando a cada tubo 100 μl de estándar interno (3,4-dimetilfenol de 1000 mg/l en etanol), además de 1,5 g de cloruro sódico (Panreac, Barcelona, España) y 1 ml de diclorometano. Procediendo a agitar durante 5 minutos para facilitar la extracción, centrifugando luego 7 minutos a 7000 rpm y 4 ºC. Tras lo cual la fase orgánica se separó colocándola en viales de 2 ml y midiendo por GC-MS. El programa de temperatura utilizado se muestra en la Tabla III.1. Tabla III.1. Programa de temperaturas utilizado para análizar las cantidades residuales de los bloqueadores metabólicos y sus derivados por GC-MS. ºC/min Inicio Rampa 10 Temperatura (ºC) 50 240 Mantenimiento (min) 1 10 Tiempo total (min) 1 30 30 III.6. Análisis estadístico El análisis estadístico se ha realizado con el software para PC Statgraphics v.5 (Graphics Software Systems, Rockville, MD, USA), con un nivel de significancia del 95% (p < 0.05) utilizando el Test de Rangos Múltiples de Tukey (HSD) para determinar las diferencias significativas así como otros análisis que se describen en los apartados correspondientes. 68 IV. Resultados y discusión CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre el grado alcohólico IV.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos, producción de glicerina y producción de compuestos volátiles de origen fermentativo 69 IV. Resultados y discusión IV.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre el grado alcohólico - Efecto inhibitorio del furfural - Efecto inhibitorio de la o-vainillina - Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico - Efecto inhibitorio del glicolaldehído - Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona - Efecto inhibitorio del cobre 70 IV. Resultados y discusión IV.1.1. Efecto inhibitorio del furfural A continuación se describen los experimentos llevados a cabo con adición de furfural a diferentes dosis, con diferentes levaduras, en diferentes momentos de dosificación y en diferentes condiciones ambientales. Las concentraciones se han elegido de tal manera que sean equiparables a los diferentes compuestos volátiles del vino, y considerando las concentraciones máximas en las que el furfural se encuentra en muchos alimentos. Los primeros ensayos se han realizado con dosis de furfural de hasta 50 mg/l, con el fin de determinar la concentración a la que se obtiene un efecto inhibitorio considerable sobre la producción de etanol, incrementando posteriormente hasta 200 mg/l, con el fin de comprobar si a mayores dosis el efecto inhibitorio es mayor. IV.1.1.1. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP Se ha utilizado la levadura 7VA, a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 12,5 % v/v de grado alcohólico probable (GAP) (115 g/l de glucosa y 115 g/l de fructosa). Las concentraciones añadidas de furfural han sido de 1, 5, 10, 20 y 50 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.1.1.1. Grado alcohólico La Figura IV.1 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico tras las fermentaciones. Se observa como la adición de furfural ejerce un efecto inhibitorio sobre 71 IV. Resultados y discusión el metabolismo fermentativo de la levadura. Esta reducción es de 0,11 y 0,21 % v/v con respecto al control para los tratamientos de 1 y 5 mg/l de furfural respectivamente, y posteriormente se amplía hasta 0,37 % v/v al adicionar 10 mg/l de furfural. Dosis superiores no parecen propiciar reducciones de grado alcohólico relevantes (Apéndice B.1), pues tan sólo se logra reducir el grado alcohólico en 0,39 y 0,41 % v/v a las dosis de 20 y 50 mg/l de furfural añadido respectivamente. Considerando las cuestiones con respecto al uso de altas concentraciones de furfural como aditivo en la industria alimentaria, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos, las dosis de 10 y 50 mg/l de furfural presentan una aplicabilidad interesante de evaluar bajo otras condiciones de trabajo, lo cual se desarrolla en los ensayos posteriores. 12,5 Grado alcohólico % v/v 12,3 12,1 11,9 11,7 11,5 0 1 5 10 20 50 Furfural (mg/l) Figura IV.1. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con la levadura 7VA en un medio sintético con 12,5 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.1.1.2. Azúcares residuales Se analizó la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones (Tabla IV.1), y en base a los resultados obtenidos se puede concluir que el furfural no reduce la 72 IV. Resultados y discusión utilización de los azúcares por parte de la levadura, ya que las concentraciones residuales son muy bajas o nulas, independientemente del tipo de azúcar utilizado. Tabla IV.1. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural con la levadura 7VA en un medio sintético con 12,5 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 1 5 10 20 50 Azúcares residuales (g/l) Glucosa Fructosa 0,00 ± 0,00 a 0,09 ± 0,03 a 0,01 ± 0,01 a 0,09 ± 0,10 a 0,01 ± 0,01 a 0,02 ± 0,02 a 0,00 ± 0,00 a 0,04 ± 0,02 a 0,01 ± 0,01 a 0,08 ± 0,07 a 0,00 ± 0,00 a 0,06 ± 0,08 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el contenido de azúcares residuales (p < 0,05). IV.1.1.2. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de furfural sobre diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae en un medio sintético con alto contenido de azúcar Se ha trabajado con las levaduras 7VA, Distinction y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos con furfural han sido de 10 y 50 mg/l dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.1.2.1. Grado alcohólico La Figura IV.2 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico, los cuales varían en función de la cepa de levadura utilizada, tal como se ha reportado previamente (Lu et al, 2007). La cepa Distinction es la que muestra una diferencia más acusada al 73 IV. Resultados y discusión reducir el grado alcohólico en 0,69 % v/v con respecto al control a la dosis de 50 mg/l de furfural. La cepa AWRI796 reduce a esa concentración de furfural el grado alcohólico en 0,45 % v/v, mientras que la cepa 7VA reduce tan sólo en 0,17 % v/v el grado alcohólico con respecto al control. Estos resultados muestran además que el efecto del furfural varía en función de la concentración de azúcar en el medio fermentativo (Lu et al, 2007), pues a diferencia del ensayo anterior, en el cual la concentración de azúcar fue menor, en este ensayo la dosis de 10 mg/l de furfural parece no tener un efecto considerable en el grado alcohólico, pues se obtuvieron reducciones de tan sólo 0,10 y 0,25 % v/v para las cepas 7VA y AWRI796 respectivamente, mientras que en el caso de la cepa Distinction se observa un comportamiento opuesto, pues el grado alcohólico incrementa con respecto al control. Grado alcohólico % v/v 15,5 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 7VA Distinction Furfural (mg/l) 0 AWRI 796 10 50 Figura IV.2. Grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 74 IV. Resultados y discusión IV.1.1.2.2. Acidez volátil La Tabla IV.2 muestra los resultados obtenidos en la valoración de la acidez volátil, observándose variabilidad con respecto a la levadura utilizada. La cepa 7VA muestra un aumento en la acidez volátil a medida que la dosis de furfural se incrementa. En las cepas Distinction y AWRI796 no se puede establecer una correlación lineal entre la acidez volátil y la dosis de furfural añadida, llegando incluso a disminuir ligeramente la acidez volátil en el caso de la segunda. Tabla IV.2. Acidez volátil con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 10 50 7VA 0,70 ± 0,04 a 0,87 ± 0,12 b 0,91 ± 0,10 b Acidez volátil (g/l) Distinction 0,88 ± 0,09 a 0,91 ± 0,03 a 0,87 ± 0,00 a AWRI796 0,84 ± 0,04 a 0,79 ± 0,09 a 0,81 ± 0,10 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el contenido de acidez volátil (p < 0,05). Una posible explicación a la reducción de la acidez volátil en la cepa AWRI796 es que el furfural estaría inhibiendo la formación de ácido acético, favoreciendo la producción de ácido furoico (Villa et al, 1992) mediante un mecanismo de inhibición competitiva sobre la enzima AlDH (Horváth et al, 2003; Modig et al, 2002), proceso que se ilustra en la Figura I.5. Si bien la oxidación del furfural a ácido furoico es menos favorecida que su reducción a alcohol furfurílico, su utilización podría constituir una interesante alternativa para disminuir la acidez volátil (Taherzadeh et al, 1999), pues dichos autores lograron ralentizar la tasa de producción de ácido acético por S. cerevisiae inmediatamente después de dosificar furfural en las primeras etapas de la fermentación, aunque hacia el final la producción de acetato se recuperó hasta alcanzar 0,35 g/l. 75 IV. Resultados y discusión Otro trabajo con resultados similares es el realizado por Palmqvist et al (1999), en el cual se retrasó la producción de ácido acético por S. cerevisiae al dosificar furfural al inicio de la fermentación. Sin embargo, lo más destacable de ese estudio fue el incremento de la producción de ácido pirúvico, alcanzando niveles casi cinco veces superiores al control (88 mg/l con furfural añadido y 18 mg/l en el control). Fenómeno que estaría directamente relacionado con la disminución de la capacidad para convertir el piruvato a acetaldehído debido a la acumulación de este último en presencia de furfural, mientras que el ácido acético se convierte en acetil-CoA (Figura I.5); aunque también podría estar involucrado un efecto inhibitorio sobre la enzima piruvato descarboxilasa mientras el furfural añadido no es completamente metabolizado. En este contexto, se podría aprovechar la acumulación temporal de piruvato, el cual puede condensarse químicamente con la malvidina-3-glucósido de la uva para formar el pigmento piranoantociánico vitisina A (Morata et al, 2007; Súarez-Lepe y Morata, 2012), como interesante alternativa para mejorar la estabilidad del color en vinos tintos. IV.1.1.2.3. Compuestos volátiles de origen fermentativo Durante la fermentación alcohólica se genera una gran variedad de compuestos volátiles que tienen un importante impacto sensorial en el vino. Desde un punto de vista cuantitativo estos compuestos son los más abundantes en la fracción aromática del vino, proporción que depende del tipo de levadura utilizada, condiciones de fermentación, variedad de uva y composición del mosto. 76 IV. Resultados y discusión Las Tablas IV.3 y IV.4 y las Figuras IV.3 - IV.5 muestran la producción de compuestos volátiles fermentativos, los cuales varían en función de la cepa de S. cerevisiae utilizada, aunque todas las concentraciones determinadas se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación. En cuanto al análisis por grupos de compuestos, no se han encontrado diferencias en la producción de alcoholes, ésteres y cetonas por las diferentes levaduras a las dosis de furfural añadidas, mientras que para el acetaldehído sí se obtienen diferencias, como se puede apreciar en la Tabla IV.3. Con las levaduras Distinction y AWRI796 no se aprecia un efecto significativo del furfural en la producción acetaldehído, mientras que en la cepa 7VA se incrementa su producción en torno al 20 % con respecto al control a medida que se incrementa la dosis de furfural hasta 10 mg/l, una dosis superior de furfural no parece propiciar un incremento significativo. Tabla IV.3. Producción de acetaldehído por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 10 50 Acetaldehído (mg/l) 7VA Distinction AWRI 796 53,95 ± 1,83 a 30,48 ± 11,06 a 34,65 ± 7,78 a 64,72 ± 9,30 b 34,61 ± 7,01 a 36,77 ± 4,03 a 65,05 ± 2,04 b 27,98 ± 4,71 a 33,92 ± 4,71 a Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). Estos resultados concuerdan con trabajos previos (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002) en los cuales se observó un incremento en la producción de acetaldehído. Aunque en el trabajo de Palmqvist et al (1999) la concentración de glucosa del medio fue mucho menor (30 g/l) y la concentración inicial de furfural dosificada fue mucho más alta (2,8 g/l), se obtuvieron en las primeras etapas de la fermentación una producción de hasta 92 mg/l de 77 IV. Resultados y discusión acetaldehído, la cual fue disminuyendo en el transcurso del tiempo. Al finalizar el proceso fermentativo siguió siendo superior con respecto al control (la producción máxima del control fue de 4,4 mg/l). Lo cual podría ser explicado en base a otros trabajos (Liu et al, 2005; Nilsson et al, 2005), quienes propusieron que el furfural es convertido en alcohol furfurílico (Figura I.5), menos perjudicial para S. cerevisiae, utilizando para ello la enzima ADH (Modig et al, 2002) en detrimento de la conversión de acetaldehído a etanol (inhibición competitiva) (Azhar et al, 1981; Navarro et al, 1994), acumulándose por tanto el acetaldehído en el medio. Este incremento temporal en la producción de acetaldehído podría ser de utilidad en vinificación debido a su capacidad para condensarse químicamente con la malvidina-3glucósido de la uva y formar el pigmento piranoantociánico vitisina B (Morata et al, 2007; Súarez-Lepe y Morata, 2012) así como favorecer la formación de nuevos pigmentos actuando como puente en la condensación entre la (-)-epicatequina y la malvidina-3glucósido (Sun et al, 2008). Interesante alternativa para mejorar la estabilidad del color en vinos tintos. En los demás compuestos volátiles fermentativos no se aprecia un efecto considerable sobre su producción, lo cual indica que las dosis de furfural añadidas serían las adecuadas con el fin de no afectar su síntesis por la levadura y alterar la composición del vino. 78 IV. Resultados y discusión Tabla IV.4. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/L) 1-Propanol Diacetilo Acetato de etilo 2-Butanol Isobutanol 1-Butanol 2-Metil-1- 3-Metil-1- Butirato Lactato Acetato de butanol butanol de etilo de etilo isoamilo 2-Feniletanol Levadura 7VA 0 10,10 ± 0,98 12,33 ± 3,81 21,92 ± 2,72 0,74 ± 0,13 11,04 ± 0,31 2,85 ± 1,04 47,40 ± 1,30 21,53 ± 0,76 14,55 ± 2,62 13,61 ± 15,88 5,29 ± 4,17 11,19 ± 1,19 10 11,65 ± 1,33 4,91 ± 4,22 27,70 ± 1,52 0,76 ± 0,08 11,89 ± 0,44 6,02 ± 1,24 51,76 ± 1,91 23,58 ± 1,50 3,19 ± 5,52 16,31 ± 13,88 1,52 ± 2,64 11,41 ± 2,24 50 10,72 ± 1,40 6,06 ± 2,48 24,92 ± 2,03 0,71 ± 0,06 11,30 ± 0,50 4,48 ± 2,86 49,26 ± 3,90 20,36 ± 3,09 9,14 ± 8,97 8,66 ± 6,68 1,87 ± 3,25 13,11 ± 1,61 Levadura Distinction 0 30,75 ± 8,06 18,07 ± 9,75 33,09 ± 7,24 0,67 ± 0,03 27,71 ± 4,04 1,47 ± 2,08 75,96 ± 2,29 30,09 ± 6,54 25,55 ± 13,74 16,59 ± 19,67 6,48 ± 9,16 13,58 ± 2,98 10 29,97 ± 3,97 18,34 ± 6,59 42,69 ± 3,99 0,68 ± 0,09 26,38 ± 1,68 3,03 ± 2,90 77,59 ± 1,66 28,91 ± 4,23 21,56 ± 8,84 13,34 ± 8,63 2,00 ± 3,47 17,52 ± 1,33 50 26,23 ± 4,08 18,79 ± 5,75 38,97 ± 4,45 0,57 ± 0,11 26,48 ± 2,34 3,36 ± 0,69 74,26 ± 4,68 26,35 ± 4,03 24,50 ± 6,09 15,59 ± 14,94 7,51 ± 4,63 16,93 ± 0,86 Levadura AWRI796 0 19,95 ± 5,54 18,79 ± 11,58 30,12 ± 1,56 0,71 ± 0,03 21,33 ± 3,04 4,53 ± 2,57 66,22 ± 9,06 27,35 ± 3,46 24,03 ± 7,82 10,03 ± 4,79 6,93 ± 3,78 6,77 ± 7,18 10 19,45 ± 6,73 14,52 ± 9,20 32,82 ± 6,16 0,80 ± 0,18 21,41 ± 2,53 2,65 ± 3,55 65,96 ± 10,97 26,86 ± 4,45 27,55 ± 10,32 12,84 ± 10,11 4,10 ± 3,91 11,06 ± 7,63 50 16,63 ± 3,14 16,67 ± 3,60 30,03 ± 3,60 0,69 ± 0,09 19,31 ± 1,05 3,34 ± 1,79 58,67 ± 5,07 23,04 ± 0,58 15,20 ± 13,96 5,62 ± 3,53 5,76 ± 5,80 9,99 ± 2,17 79 IV. Resultados y discusión Levadura 7VA 80 70 mg/L 60 50 40 30 20 10 Ac e ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol Di ac et ilo Ac et .e t il o 2Bu ta no l Is ob ut an ol 1bu ta no l 2M -1 -B ut . 3M -1 -B ut . Bu t. et ilo La ct at o et Ac ilo et .i so am Al c. ilo 2fe ni let ilo 0 Furfural (mg/l) 0 10 50 Figura IV.3. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Levadura Distinction 80 70 mg/L 60 50 40 30 20 10 Ac e ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol Di ac et ilo Ac et .e t il o 2Bu ta no l Is ob ut an ol 1bu ta no 2l M -1 -B ut . 3M -1 -B ut . Bu t. et ilo La ct at o et Ac ilo et .i so am Al c. ilo 2fe ni let ilo 0 Furfural (mg/l) 0 10 50 Figura IV.4. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura Distinction a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 80 IV. Resultados y discusión Levadura AWRI 796 80 70 mg/L 60 50 40 30 20 10 A ce ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol D ia ce til o A ce t. et ilo 2B ut an ol Is ob ut an ol 1bu ta no l 2M -1 -B ut . 3M -1 -B ut . B ut .e til L o ac ta to et A ilo ce t. iso am A lc ilo .2 -fe ni le t il o 0 Furfural (mg/l) 0 10 50 Figura IV.5. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.1.3. Efecto inhibitorio del furfural sobre diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae y evaluación del momento óptimo de adición en un medio sintético con alto contenido de azúcar Se ha trabajado con las cepas 7VA, Distinction y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en medio sintético con 14,5 % v/v de GAP (250 g/l de glucosa). Los tratamientos de furfural han sido: 10 mg/l añadidos al alcanzar un poder fermentativo de 8 (PF = 8) y 50 mg/l de furfural adicionados periódicamente desde el inicio y cada tres días (10 mg/l en cada adición hasta alcanzar 50 mg/l), además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.1.3.1. Grado alcohólico La Figura IV.6 muestra el grado alcohólico obtenido con las diferentes levaduras, obteniéndose la mayor reducción con la cepa comercial Distinction cuando la adición de 81 IV. Resultados y discusión furfural fue de 10 mg/l al alcanzar PF = 8, reduciéndose con respecto al control en 0,43 % v/v. Sin embargo, la adición de manera periódica hasta alcanzar 50 mg/l de furfural originó un efecto inhibitorio menor, pues tan sólo se logró una reducción del 0,28 % v/v. Se deduce de estos resultados que para esta cepa, la etapa fermentativa en que se añade el bloqueador es un factor clave que puede determinar la intensidad de su efecto. En la cepa 7VA se obtuvo el mayor efecto en el grado alcohólico a 50 mg/l de furfural añadido de manera periódica, con una reducción de 0,28 % v/v. Mientras que a la dosis de 10 mg/l añadida a PF = 8 no se observó un efecto inhibitorio significativo con respecto al control (Apéndice B.3). Mientras que el comportamiento de la cepa AWRI796 es opuesto al de la cepa Distinction, pues incrementa su producción de etanol tras la adición de 10 mg/l de furfural a PF = 8, y la reduce tras la adición de 50 mg/l de manera periódica. Lo cual demuestra que el efecto inhibitorio es variable en función de la cepa de levadura utilizada, como se ha reportado previamente (Lu et al, 2007). 14,5 Grado alcohólico % v/v 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 7VA Distinction Furfural (mg/l) 0 AWRI 796 10 50 Figura IV.6. Grado alcohólico en un medio sintético con 14,5 % de GAP con diferentes cepas de S. cerevisiae. “10”: adición de 10 mg/l a PF = 8; “50”: adición de 10 mg/l cada tres días desde el inicio hasta alcanzar 50 mg/l de furfural. Media ± desviación estándar (n = 4). 82 IV. Resultados y discusión IV.1.1.4. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto inhibitorio del furfural en un medio sintético con altas concentraciones de azúcar Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperaturas constantes de 18 y 25 ºC y a valores de pH de 3,2 y 3,8. El GAP del medio sintético ha sido de 14,5 % v/v (250 g/l de glucosa). Se han mantenido los ritmos de adición de furfural de la prueba anterior, aunque en este caso, tanto la adición a PF = 8 como la de manera periódica, se han realizado hasta alcanzar una concentración de 50 mg/l; además de un control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.1) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.1.4.1. Grado alcohólico Las diferencias en el grado alcohólico son variables dependiendo de las condiciones ambientales. La Tabla IV.5 muestra que el tratamiento con pH 3,2 es el que menor grado alcohólico presenta con respecto a los otros, incluso en el control. Con respecto al momento de dosificación de furfural en estas condiciones, no se aprecia una reducción importante en la producción de etanol y el efecto se debe más al pH y la temperatura. Tabla IV.5. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto del furfural en el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). pH / ºC Control PF X3 Grado alcohólico (% v/v) 3,2/18 3,8/18 14,10 ± 0,00 a 14,35 ± 0,00 b 14,00 ± 0,09 a 14,10 ± 0,00 a 14,02 ± 0,09 a 14,10 ± 0,00 ab 3,8/25 14,30 ± 0,07 b 14,22 ± 0,00 b 14,19 ± 0,06 b Letras diferentes en la misma fila indican que existen diferencias significativas con respecto a la variación del pH y temperatura (p < 0,05). 83 IV. Resultados y discusión En los tratamientos con pH 3,8 (Figura IV.7), se logran reducciones del grado alcohólico similares a los ensayos anteriores, especialmente al dosificar 50 mg/l de furfural de manera periódica a razón de 10 mg/l cada tres días (X3), pues tanto a 18 como a 25 ºC, se logra reducir el grado alcohólico en un 0,25 y 0,12 % respectivamente con respecto al control, aunque estos resultados no muestran diferencias significativas (Apéndice B.4) con el tratamiento en el cual se dosificó el furfural a PF = 8. Grado alcohólico % v/v 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 3,2/18 3,8/18 0 PF 3,8/25 X3 Figura IV.7. Incidencia del pH y la temperatura sobre el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 % de GAP. “PF”: adición de 50 mg/L a PF = 8; “X3”: adición de 10 mg/L de furfural cada tres días desde el inicio hasta alcanzar 50 mg/L. Media ± desviación estándar (n = 4). Dado que cualquier reacción enzimática puede verse influenciada por el pH y/o la temperatura, resulta interesante constatar que la inhibición que ejerce el furfural no se ve significativamente alterada por estos factores en los rangos habituales en vinificación. IV.1.1.4.2. Azúcares residuales La Tabla IV.6 muestra la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones, en base a las cuales se puede concluir de manera favorable que en los rangos habituales 84 IV. Resultados y discusión de pH y temperatura en la industria enológica, el furfural no reduce la utilización de los azúcares por parte de la levadura, ya que las concentraciones residuales son bajas. Tabla IV.6. Azúcares residuales tras fermentar a diferentes valores de pH y temperatura con la levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Tratamiento 0 PF X3 Azúcares residuales – glucosa (g/l) pH 3,2/18 ºC pH 3,8/18 ºC pH 3,8/25 ºC 1,71 ± 0,31 a 1,05 ± 0,22 a 0,50 ± 0,14 ab 2,50 ± 0,40 b 0,83 ± 0,51 a 0,32 ± 0,28 a 1,24 ± 0,43 a 0,82 ± 0,32 a 1,11 ± 0,56 b Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el contenido de azúcar residual (p < 0,05). IV.1.1.5. Efecto inhibitorio de altas dosis iniciales de furfural y conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético Se ha trabajado con las cepas 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos de furfural han sido de 50, 100 y 200 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del bloqueador. Al finalizar las fermentaciones se ha determinado el furfural residual y el alcohol furfurílico producido mediante el análisis cromatográfico descrito en la sección III.5.6. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.1.5.1. Grado alcohólico En la Figura IV.8 se puede apreciar el efecto de las diferentes concentraciones de furfural sobre ambas levaduras. En la levadura 7VA se logró la mayor reducción del grado alcohólico de 0,26 % v/v a la dosis de 50 mg/l de furfural, sin embargo a mayores dosis 85 IV. Resultados y discusión parece que el efecto no es muy significativo (Apéndice B.5), pues tan sólo se reduce el grado alcohólico en 0,24 y 0,15 % v/v a 100 y 200 mg/l de furfural respectivamente con respecto al control. Una posible explicación de este fenómeno sería que el furfural en altas concentraciones ralentiza la producción de etanol al inicio de la fermentación (Boyer et al, 1992), estimulando la glicólisis como fuente de poder reductor en forma de NADH (generado en la conversión de gliceraldehido-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato) que la levadura utiliza para reducirlo a alcohol furfurílico como método de detoxificación, por lo cual la demanda de azúcares se vería incrementada (Modig et al, 2002) sin afectar el grado alcohólico final, y a medida que se incrementas las dosis de furfural, la levadura puede activar mecanismos alternativos para generar poder reductor extra, a través del Ciclo de Krebs (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002) y por activación de la vía de las pentosa fosfato, generando NADPH (Petersson et al, 2006; Liu et al, 2008; Heer et al, 2009). La levadura AWRI796, glicolíticamente ineficiente (Loira et al, 2012), mostró una producción de etanol mucho menor que la levadura 7VA, incluso en el control. Posiblemente esta levadura utilice parte del azúcar para producir biomasa y otros metabolitos secundarios en detrimento de la producción de etanol, lo cual demuestra que el efecto inhibitorio es variable en función de la cepa de levadura utilizada, como se ha descrito en trabajos previos (Lu et al, 2007). En cuanto al grado alcohólico obtenido se aprecia una reducción del 0,41 % v/v a la dosis de 50 mg/l de furfural, mientras que a mayores dosis no se aprecia un efecto importante, pues tan sólo se reduce 0,36 y 0,21 % v/v a las dosis de 100 y 200 mg/l de furfural respectivamente. Comportamiento similar a la levadura 7VA, aunque el análisis estadístico no muestra diferencias significativas (Apéndice B.5). 86 IV. Resultados y discusión 15,0 Grado alcohólico % v/v 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 50 100 7VA 200 Furfural (mg/L) AWRI 796 Figura IV.8. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En base a estos resultados se puede concluir que la dosis de 50 mg/l sería la más adecuada, ya que el efecto no incrementa a mayores concentraciones de furfural. IV.1.1.5.2. Azúcares residuales Se analizó la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones (Tabla IV.7), encontrándose diferencias en función de la levadura utilizada. En la cepa 7VA, al igual que en los ensayos anteriores, con las cantidades obtenidas se puede concluir de manera favorable que el furfural no reduce la utilización de los azúcares, ya que las concentraciones residuales son bajas. Con la levadura AWRI796 se obtuvieron cantidades de glucosa más altas, que representan un grado alcohólico en torno a 0,35 - 0,40 % v/v, ya que aproximadamente se requieren de 17 g/l de glucosa para incrementar el contenido de alcohol en 1 %. 87 IV. Resultados y discusión Tabla IV.7. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 50 100 200 Azúcares residuales (g/l) 7VA 0,92 ± 0,28 a 1,98 ± 1,36 a 3,16 ± 0,65 a 2,19 ± 1,82 a AWRI796 6,10 ± 0,28 a 5,82 ± 0,81 a 6,95 ± 0,85 a 6,54 ± 0,59 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.1.5.3. Furfural residual y alcohol furfurílico producido por las levaduras La Tabla IV.8 muestra las concentraciones de furfural residual al finalizar las fermentaciones, así como la cantidad de alcohol furfurílico producido por las levaduras. Tabla IV.8. Furfural residual y alcohol furfurílico (GC-MS) producido tras las fermentaciones con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % v/v de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/L) 7VA 0 50 100 200 AWRI796 0 50 100 200 Levadura Residual (mg/L) Furfural Alc. furfurílico 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,26 ± 0,01 37,47 ± 1,4 0,29 ± 0,13 75,19 ± 1,14 0,23 ± 0,01 159,5 ± 2,58 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,00 35,57 ± 1,21 0,12 ± 0,01 74,74 ± 1,73 0,19 ± 0,00 158,31 ± 5,38 Furfural residual (%) * 0,52 0,29 0,12 0,14 0,13 0,10 Conversión (%) ** 74,95 75,19 79,75 71,14 74,74 79,16 * Cantidad residual en base al furfural añadido al medio. ** Alcohol furfurílico producido a partir del furfural añadido. Como puede apreciarse las cantidades de furfural residual son prácticamente despreciables, con valores máximos de 0,52 y 0,14 % para las levaduras 7VA y AWRI796 respectivamente a la dosis de 50 mg/l de furfural añadido, lo que indica que 88 IV. Resultados y discusión prácticamente todo ha sido metabolizado y a medida que se incrementa la dosis de furfural añadido la concentración de furfural residual es menor en ambas levaduras. En cuanto a la cantidad de alcohol furfurílico producido a partir de la conversión enzimática del furfural (Liu et al, 2005; Nilsson et al, 2005), se puede apreciar que aumenta a medida que se incrementa la dosis de furfural con ambas levaduras (Figura IV.9), llegando a valores de conversión en torno al 79 % a 200 mg/l de furfural añadido, mientras que la menor conversión se obtuvo a la dosis de 50 mg/l, con valores de 75 y 71 % para las levaduras 7VA y AWRI796 respectivamente. Valores comparables a otro estudio en el que se determinaron porcentajes de producción de alcohol furfurílico por S. cerevisiae en torno al 70 % a partir del furfural añadido (Díaz de Villegas et al, 1992). 0,6 0,5 78 0,4 76 0,3 74 0,2 72 Furfural residual (%) Alcohol furfurílico (%) 80 0,1 70 0,0 0 50 100 150 200 250 Furfural añadido (mg/l) 7VA AWRI 796 7VA AWRI 796 Figura IV.9. Furfural residual (líneas discontinuas) y alcohol furfurílico producido (líneas continuas) tras las fermentaciones con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % v/v de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Otro aspecto a resaltar es que la conversión de furfural en alcohol furfurílico aumenta a medida que se incrementa la dosis de furfural añadido al medio (Figura IV.9). Una 89 IV. Resultados y discusión posible explicación sería que la levadura aumenta su capacidad metabólica para detoxificar el medio en presencia de cantidades altas de furfural, activando otros mecanismos además de la habitual producción de NADH, como por ejemplo el Ciclo de Krebs (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002) y la vía de las pentosa fosfato para generar NADPH (Petersson et al, 2006; Liu et al, 2008; Heer et al, 2009). IV.1.1.6. Efecto inhibitorio de altas concentraciones de furfural dosificadas en fase de crecimiento exponencial y conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético Se ha trabajado con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos de furfural han sido de 50 y 200 mg/l, dosificados en fase de crecimiento exponencial (PF = 8), y un tratamiento control sin adición del bloqueador. Al finalizar las fermentaciones se ha determinado el furfural residual y el alcohol furfurílico producido mediante el análisis cromatográfico descrito en la sección III.5.6. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.2) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.1.6.1. Grado alcohólico La Figura IV.10 muestra el grado alcohólico a distintas dosis de furfural, cuyo efecto inhibitorio es variable para todas las cepas evaluadas. Un mayor efecto se observa en la levadura CM15 al reducir en 0,53 % v/v la producción de etanol a una dosis de 200 mg/l, mientras que a 50 mg/l de furfural tan sólo se logra reducir el grado alcohólico en 90 IV. Resultados y discusión 0,29 % v/v, reducciones que son significativamente diferentes en ambas dosis de furfural con respecto al control (Apéndice B.6). En las levaduras 7VA y AWRI796 no se aprecian reducciones del grado alcohólico que sean relevantes con respecto al control (Apéndice B.6), lo que indica que estas cepas podrían no ser sensibles al efecto inhibitorio del furfural en la fase de crecimiento exponencial, en la que existe una mayor densidad celular, de modo que su resistencia al efecto inhibitorio podría ser mayor, tal como se menciona en otros trabajos (Chung y Lee, 1985; Boyer et al, 1992; Navarro, 1994). No obstante se mantiene la diferencia de producción de etanol entre las levaduras 7VA y AWRI796 mostrada en ensayos anteriores, incluso en el control, lo que indica la naturaleza de la levadura AWRI796 como glicolíticamente ineficiente (Loira et al, 2012). Grado alcohólico % v/v 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 50 7VA AWRI 796 200 CM15 Furfural (mg/L) Figura IV.10. Grado alcohólico obtenido con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 91 IV. Resultados y discusión IV.1.1.6.2. Azúcares residuales La Tabla IV.9 muestra las concentraciones de azúcares residuales en las microvinificaciones, encontrándose diferencias en función de la levadura utilizada. En la cepa 7VA, con las cantidades obtenidas se puede concluir de manera favorable que el furfural no afecta el consumo de azúcares, como en los ensayos anteriores. Con las cepas AWRI796 y CM15 se obtienen concentraciones de azúcar residual mucho más altas. Esto indica que estas levaduras podrían ser sensibles a las altas concentraciones sacarimétricas del medio. Siendo de especial relevancia la cepa CM15 a 200 mg/l de furfural, con un mayor contenido de azúcar residual (12,72 g/l), que equivale a 0,75 % v/v de grado alcohólico probable, lo cual concuerda con el grado alcohólico obtenido (Figura IV.10), que fue el menor en comparación a los otros tratamientos. Tabla IV.9. Azúcares residuales tras las fermentaciones con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 50 200 Azúcares residuales (g/l) 7VA AWRI 796 0,71 ± 0,75 a 8,94 ± 2,95 a 1,34 ± 0,96 a 7,71 ± 2,85 a 0,54 ± 0,68 a 8,67 ± 1,91 a CM15 7,15 ± 1,33 a 6,83 ± 0,78 a 12,72 ± 0,91 b Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el contenido de azúcar residual (p < 0,05). En base a estos resultados se puede concluir que la dosificación en fase de crecimiento exponencial no muestra un efecto inhibitorio considerable sobre la síntesis de etanol, 92 IV. Resultados y discusión con respecto al obtenido en las dosificaciones al inicio de las fermentaciones de los ensayos anteriores. IV.1.1.6.3. Furfural residual y alcohol furfurílico producido por las levaduras La Tabla IV.10 resume las cantidades de furfural residual que son prácticamente despreciables, con valores máximos de 0,36; 0,29 y 0,25 % para las levaduras 7VA, AWRI796 y CM15 respectivamente a la dosis de 50 mg/l de furfural añadido, lo que indica que prácticamente todo ha sido metabolizado. Con respecto al alcohol furfurílico producido, se puede apreciar que aumenta a medida que se incrementa la dosis de furfural con todas las levaduras, llegando a valores de conversión en torno al 71, 74 y 67 % para las levaduras 7VA, AWRI796 y CM15 respectivamente a la dosis de 200 mg/l de furfural añadido, mientras que a 50 mg/l se obtuvieron concentraciones de 69, 71 y 65 % respectivamente (Tabla IV.10 y Figura IV.11). Valores comparables a los obtenidos en el ensayo anterior (Tabla IV.8) y en torno al 70 %, obtenido por Díaz de Villegas et al (1992). 93 IV. Resultados y discusión Tabla IV.10. Furfural residual y alcohol furfurílico producido tras las fermentaciones con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % v/v de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Levadura 7VA AWRI796 CM15 Furfural (mg/L) 0 50 200 0 50 200 0 50 200 Residual (mg/L) Furfural Alc. furfurílico 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,18 ± 0,01 34,63 ± 1,45 0,20 ± 0,01 142,50 ± 3,16 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,14 ± 0,03 35,56 ± 3,14 0,26 ± 0,05 148,83 ± 2,96 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,12 ± 0,02 32,58 ± 2,62 0,32 ± 0,01 133,96 ± 4,23 Furf. residual (%) * 0,36 0,10 0,29 0,12 0,25 0,16 Conversión (%) ** 69,28 71,25 71,13 74,42 65,17 66,98 * Cantidad residual en base al furfural añadido al medio. ** Alcohol furfurílico producido a partir del furfural añadido. 0,6 0,5 72 0,4 69 0,3 66 0,2 63 Furfural residual (%) Alcohol furfurílico (%) 75 0,1 60 0,0 0 50 100 150 200 250 Furfural añadido (mg/l) 7VA AWRI 796 CM15 7VA AWRI 796 CM15 Figura IV.11. Furfural residual (líneas discontinuas) y alcohol furfurílico producido (líneas continuas) al dosificar furfural a PF = 8 con las levaduras 7VA, AWRI796 y CM15 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 94 IV. Resultados y discusión IV.1.1.7. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado Se ha trabajado con las cepas 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 15 % v/v de GAP. Los tratamientos con furfural han sido de 50 y 100 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, y un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.3) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.1.7.1. Grado alcohólico La Figura IV.12 muestra el grado alcohólico a las distintas dosis de furfural. Un mayor efecto se observa en la levadura AWRI796 al reducir en 0,71 % v/v el grado alcohólico con respecto al control a 100 mg/l de furfural, mientras que a la dosis de 50 mg/l tan sólo se logra reducir el grado alcohólico en 0,64 % v/v. Valores de grado alcohólico que son significativamente menores al control en ambas dosis de furfural (Apéndice B.7). En la levadura 7VA no se aprecia una reducción del grado alcohólico que sea estadísticamente significativa a la dosis de 50 mg/l (Apéndice B.7), ya que sólo se consigue reducir en 0,13 % v/v con respecto al control, contrario a lo observado a la dosis más alta de furfural (100 mg/l), en la que el grado alcohólico incluso incrementa. Se mantiene la diferencia de producción de etanol entre las levaduras 7VA y AWRI796 mostrada en los ensayos anteriores, incluso en el control, aunque dicha diferencia es 95 IV. Resultados y discusión menor, lo que pone de manifiesto nuevamente la naturaleza de la levadura AWRI796 como glicolíticamente ineficiente. Otro aspecto a tener en cuenta es la naturaleza del medio, pues en este ensayo se ha utilizado un medio a base de mosto concentrado, cuya composición es más compleja que el medio sintético, lo cual podría influir en la levadura; incluso algunos de los componentes del mosto podrían interactuar con el inhibidor, disminuyendo su disponibilidad, tal como se menciona en otro trabajo de temática similar en el que se evalúa el efecto inhibitorio del cobre en la fermentación alcohólica (Azenha et al, 2000). 15,5 Grado alcohólico % v/v 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 0 50 7VA 100 Furfural (mg/l) AWRI 796 Figura IV.12. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.1.7.2. Azúcares residuales En la Tabla IV.11 se pueden observar las cantidades de glucosa residual, que fueron bajas o nulas con ambas levaduras, mientras que las cantidades de fructosa fueron superiores. Posiblemente las levaduras hayan tenido dificultades para consumir completamente los 96 IV. Resultados y discusión azúcares debido a la naturaleza del medio, preparado a partir de un mosto concentrado, el cual no tuviese los suficientes nutrientes requeridos. Con la levadura AWRI796 las cantidades residuales de fructosa son más altas, lo cual indicaría una mayor sensibilidad de esta levadura a altas concentraciones de azúcar del medio. Tabla IV.11. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 50 100 Azúcares residuales (g/l) 7VA AWRI 796 Glucosa Fructosa Glucosa Fructosa 0,39 ± 0,78 a 6,70 ± 2,18 a 0,00 ± 0,00 10,67 ± 0,33 a 0,51 ± 0,67 a 6,78 ± 3,39 a 0,00 ± 0,00 13,74 ± 3,98 a 0,00 ± 0,00 a 4,16 ± 3,37 a 0,00 ± 0,00 15,51 ± 2,73 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el contenido de azúcares residuales (p < 0,05). IV.1.1.7.3. Producción de glicerina La glicerina se forma para mantener el equilibrio redox intracelular, mediante la producción de NAD+ a partir del NADH citosólico. El NADH es el cofactor requerido para reducir el acetaldehído a etanol, pero además es utilizado como poder reductor por la levadura para convertir el furfural en alcohol furfurílico (Modig et al, 2002). Al respecto, Palmqvist et al (1999), observaron una mayor afinidad hacia el NADH por la enzima ADH (responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico) que por la enzima GPDH (responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato y producir glicerina), generándose una inhibición de tipo competitiva. Con lo cual podría esperarse que la producción de glicerina sea menor en presencia de furfural. 97 IV. Resultados y discusión La Tabla IV.12 muestra la producción de glicerina por ambas levaduras, la cual no es afectada a las diferentes dosis de furfural añadidas, aunque si se observan diferencias en función de la cepa, mostrando la levadura AWRI796 menor producción, lo cual no era lo esperado pues en base a la información brindada por la firma que la comercializa, se trata de una cepa con una producción de glicerina mayor a las usuales (Maurivin, 2013). Sin embargo en un estudio previo (Loira et al, 2012), se obtuvieron con esta levadura producciones de glicerina en torno a los valores mostrados en la Tabla IV.12, aunque en dicho estudio se utilizó un medio sintético pero con un contenido de azúcares similar al medio preparado en nuestro ensayo. Otros estudios han demostrado que la producción de glicerina podría incrementar en presencia de furfural en el medio (Taherzadeh et al, 1999), lo cual indicaría otras fuentes de NADH para la enzima GPDH, por ejemplo el Ciclo de Krebs (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002), principalmente en las etapas iniciales del proceso fermentativo (Horváth et al, 2003), incrementándose además la producción de otros metabolitos como el ácido succínico (Taherzadeh et al, 1999), de especial interés en cuanto a la mejora de la acidez (Coulter et al, 2004) y del perfil aromático del vino (Hidalgo, 2010). Tabla IV.12. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Furfural (mg/l) 0 50 100 Glicerina (g/l) 7VA 7,09 ± 0,26 a 7,06 ± 0,08 a 7,39 ± 0,36 a AWRI 796 6,01 ± 0,26 a 5,92 ± 0,28 a 5,89 ± 0,13 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 98 IV. Resultados y discusión IV.1.2. Efecto inhibitorio de la o-vainillina En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de ovainillina a diferentes dosis, con diferentes levaduras, a diferentes concentraciones de azúcar en el medio y en combinación con furfural a fin de evaluar el posible efecto sinérgico de ambos bloqueadores metabólicos. La elección de la o-vainillina para estos ensayos se basa en la información disponible en la literatura consultada con respecto al efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos (Mikulásová et al, 1990; Larsson et al, 2000), en donde se destaca que dicho efecto es mayor que sus isómeros isovainillina y p-vainillina (vainillina) (Figura I.6). Por otro lado, no se ha considerado en los ensayos con o-vainillina su dosificación en diferentes etapas de la fermentación, pues en base a los resultados obtenidos para el furfural, la etapa en la cual se añade el inhibidor no parece ser relevante a altas concentraciones de azúcar en el medio, ya que la levadura es más resistente al poseer una mayor densidad celular, tal como lo demostraron trabajos previos (Chung y Lee, 1985; Boyer et al, 1992; Navarro, 1994). 99 IV. Resultados y discusión IV.1.2.1. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético con alto contenido de azúcares Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos con ovainillina han sido de 20, 50, 200 y 500 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.2.1.1. Grado alcohólico La Figura IV.13 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido con ambas levaduras. Observándose el mayor efecto inhibitorio en la levadura AWRI796 con una reducción del 0,53 % v/v a la dosis de 50 mg/l de o-vainillina, mientras que a 20 mg/l tan sólo se obtuvo una reducción del 0,25 % v/v con respecto al control. El análisis estadístico (Apéndice C.1), indica una diferencia significativa en el grado alcohólico a la dosis de 50 mg/l de o-vainillina, aunque al finalizar las fermentaciones las cantidades de azúcares residuales fueron altas (Tabla IV.13). Con la levadura 7VA se obtuvo la mayor reducción del grado alcohólico a la dosis de 20 mg/l de o-vainillina, aunque a la dosis de 50 mg/l la reducción no fue significativamente diferente, obteniéndose valores de 0,34 y 0,24 % v/v respectivamente para ambas dosis con respecto al control. A las dosis de 200 y 500 mg/l de o-vainillina ambas levaduras fueron inhibidas totalmente, resultados que concuerdan con lo descrito por Larsson et al (2000), quienes a 100 IV. Resultados y discusión 200 mg/l observaron una inhibición total del crecimiento celular y de la producción de etanol por S. cerevisiae, aunque el medio que utilizaron solamente contenía 20 g/l de glucosa y la inhibición a menores dosis de o-vainillina fue mayor en el crecimiento celular que en la producción de etanol. Grado alcohólico % v/v 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 20 7VA AWRI 796 50 o -vainillina (mg/L) Figura IV.13. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.2.1.2. Azúcares residuales La Tabla IV.13 muestra las concentraciones de azúcares residuales tras las fermentaciones para ambas levaduras, observándose que en el caso de la levadura 7VA las cantidades obtenidas fueron bajas, lo que indicaría que este inhibidor no afecta el consumo de azúcares por esta levadura, al igual que en el caso del furfural. Un comportamiento diferente al observado con la levadura AWRI796, con la cual el contenido de azúcares residuales fue alto. Resultados comparables a los obtenidos con el 101 IV. Resultados y discusión furfural al mismo GAP (Tabla IV.11), lo que podría evidenciar que esta levadura es sensible a altas concentraciones de azúcares en el medio fermentativo. Tabla IV.13. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ovainillina con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales (g/l) o-Vainillina (mg/l) 7VA 2,40 ± 1,45 a 0 3,18 ± 1,59 a 20 4,71 ± 0,76 a 50 * 200 * 500 AWRI 796 13,72 ± 1,48 a 13,50 ± 1,82 a 11,55 ± 1,49 a * * (*) La inhibición fue total. Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.2.2. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio sintético Se ha trabajado con la levadura 7VA, a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 12,5 % v/v de GAP (220 g/l de glucosa). Las concentraciones añadidas de o-vainillina han sido de 20, 50, 100 y 200 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento combinado de o-vainillina y furfural (V+F) de 50 mg/l cada uno, y un control sin adición de bloqueador. Se ha utilizado un medio de menor GAP con el objetivo de verificar el efecto inhibitorio en función de la concentración de azúcares en el medio. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. 102 IV. Resultados y discusión IV.1.2.2.1. Grado alcohólico La Figura IV.14 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico. Se observa como la adición de o-vainillina ejerce un efecto inhibitorio sobre el metabolismo fermentativo de la levadura a medida que se incrementa la dosis. Esta reducción es mayor a 50 mg/l, con una disminución del grado alcohólico de 0,31 % v/v, mientras que a 20 mg/l tan sólo se reduce en un 0,18 % v/v con respecto al control. A las dosis de 100 y 200 mg/l la inhibición fue total, lo que concuerda con el ensayo anterior. En el tratamiento en el cual se evaluó el efecto combinado de la o-vainillina y furfural a 50 mg/l cada uno, se logra reducir el grado alcohólico en 0,38 % v/v con respecto al control. De acuerdo al análisis estadístico no se obtiene una diferencia significativa en el grado alcohólico, tanto a las diferentes dosis de o-vainillina como al evaluar la posible sinergia entre o-vainillina y furfural (Apéndice C.2), al menos con esta cepa de S. cerevisiae a la concentración de azúcares y el tipo de medio fermentativo utilizados. Grado alcohólico % v/v 13,0 12,6 12,2 11,8 11,4 11,0 0 20 50 V50+F50 o -vainillina (mg/L) Figura IV.14. Grado alcohólico tras las fermentaciones en un medio sintético con 12,5 % de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno. Media ± desviación estándar (n = 4). 103 IV. Resultados y discusión IV.1.2.2.2. Azúcares residuales La Tabla IV.14 muestra los azúcares residuales a las diferentes dosis de o-vainillina, las cuales son bajas, lo que indicaría que este inhibidor no afecta el consumo de azúcares por la levadura 7VA, al igual que en el ensayo anterior y en los ensayos con furfural. Tabla IV.14. Azúcares residuales en un medio sintético con 12,5 % de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de ovainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales (g/l) o-Vainillina (mg/l) Glucosa 1,59 ± 0,31 a 0 3,04 ± 0,47 b 20 4,27 ± 1,08 b 50 * 100 * 200 2,98 ± 0,40 b V50+F50 (*) La inhibición fue total. Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.2.3. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con alto contenido de azúcares Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796, a temperatura constante de 22 ºC en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo a 15 % v/v de GAP. Las concentraciones añadidas de o-vainillina han sido de 20, 50 y 100 mg/l al inicio de las fermentaciones, un tratamiento control sin adición del bloqueador y un tratamiento combinado de o-vainillina y furfural a 50 mg/l cada uno con el fin de verificar el efecto sinérgico de ambos bloqueadores. Todos los ensayos se 104 IV. Resultados y discusión han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.4) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.2.3.1. Grado alcohólico La Figura IV.15 muestra el grado alcohólico a distintas dosis de o-vainillina. Un mayor efecto se observa en la levadura AWRI796 al reducir el grado alcohólico en 0,46 % v/v con respecto al control a la dosis de 50 mg/l de o-vainillina, mientras que a 20 mg/l se logra reducir en 0,37 % v/v. Reducciones que sin embargo no son significativamente diferentes al control (Apéndice C.3), mientras que al combinar o-vainillina y furfural a 50 mg/l cada uno, se logra reducir el grado alcohólico en 0,63 % v/v, lo que indicaría que con esta levadura el efecto sinérgico de ambos bloqueadores puede constituir una interesante alternativa para reducir el grado alcohólico. No obstante, como en ensayos anteriores con esta levadura, se siguen obteniendo altos contenidos de azúcares residuales (Tabla IV.15). En la levadura 7VA no se aprecia una reducción del grado alcohólico a las dosis de 20 y 50 mg/l de o-vainillina, incluso se observa un incremento a medida que aumenta la concentración de o-vainillina en el medio. En cuanto a la combinación de la o-vainillina y furfural, no se observa un efecto sinérgico en la reducción del grado alcohólico, resultado que concuerda con el ensayo anterior. En lo que se refiere al tratamiento con 100 mg/l de o-vainillina, se obtienen reducciones de 1,12 % v/v con la levadura 7VA y 1,13 % v/v con la levadura AWRI796 con respecto al control. Sin embargo las cantidades de azúcares residuales son muy altas (Tabla 105 IV. Resultados y discusión IV.15), lo que indicaría que a partir de determinadas concentraciones la o-vainillina inhibe el consumo de azúcares por S. cerevisiae. El comportamiento no lineal en la reducción del grado alcohólico a medida que se incrementa la dosis de o-vainillina con la levadura 7VA es comparable al observado con el furfural (Figura IV.8), en el cual a dosis superiores a 50 mg/l el efecto inhibitorio disminuye. Este fenómeno observado con la o-vainillina podría explicarse en base a lo ya mencionado para el furfural, pues al tratarse de aldehídos, sus modos de acción serían similares y su presencia en el medio fermentativo a altas concentraciones podría ralentizar la producción de etanol en las primeras etapas de la fermentación, estimulando la glicólisis como fuente de poder reductor en forma de NADH que la levadura utiliza para reducir la o-vainillina a alcohol o-vainíllico (Larsson et al, 2000), pero además se activarían otros mecanismos para generar poder reductor extra en forma de NADPH a través de la vía de las pentosa fosfato como en el caso del furfural (Petersson et al, 2006; Liu et al, 2008; Heer et al, 2009) así como la generación de otros cofactores como FADH2 o FMN (De Wulf et al, 1986), adaptándose así la levadura con la consiguiente conversión del inhibidor sin afectar el grado alcohólico final. 106 IV. Resultados y discusión 15,5 7VA AWRI 796 Grado alcohólico % v/v 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 0 20 50 100 V50+F50 o -Vainillina (mg/l) Figura IV.15. Grado alcohólico obtenido con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Tabla IV.15. Azúcares residuales con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). o-Vainillina mg/l 0 20 50 100 V50+F50 Azúcares residuales (g/l) 7VA AWRI 796 Glucosa Fructosa Glucosa Fructosa 0,39 ± 0,78 a 6,70 ± 2,18 a 0,00 ± 0,00 a 10,67 ± 0,33 a 0,00 ± 0,00 a 4,04 ± 4,01 a 0,00 ± 0,00 a 12,77 ± 4,26 a 0,00 ± 0,00 a 2,93 ± 1,17 a 0,00 ± 0,00 a 16,96 ± 1,56 ab 5,23 ± 1,32 b 23,51 ± 3,70 b 0,27 ± 0,46 a 22,76 ± 3,38 b 0,00 ± 0,00 a 4,84 ± 0,60 a 0,00 ± 0,00 a 13,48 ± 2,58 a Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.2.3.2. Producción de glicerina La Tabla IV.16 muestra la producción de glicerina, la cual no es afectada a las diferentes dosis de o-vainillina añadida al medio, aunque si se observa una diferencia en función de la cepa utilizada, mostrando la levadura comercial AWRI796 menor producción, lo cual 107 IV. Resultados y discusión concuerda con los resultados obtenidos con el furfural (Tabla IV.12) y con un estudio previo con la misma levadura (Loira et al, 2012). Tabla IV.16. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). o-Vainillina (mg/l) 0 20 50 100 V50+F50 Glicerina (g/l) 7VA 7,09 ± 0,26 a 7,30 ± 0,22 a 7,46 ± 0,58 a 6,95 ± 0,29 a 7,25 ± 0,23 a AWRI 796 6,01 ± 0,26 a 6,13 ± 0,25 a 6,04 ± 0,39 a 5,84 ± 0,31 a 5,56 ± 0,31 a Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas en el contenido de glicerina (p < 0,05). IV.1.2.4. Conversión enzimática de la o-vainillina y el furfural en sus respectivos derivados por la levadura Saccharomyces cerevisiae a diferentes momentos de dosificación en mosto tinto Se han dosificado furfural y o-vainillina en un mosto tinto de uva variedad Tempranillo con un GAP de 14,6 % v/v utilizando la levadura 7VA. Las dosis han sido de 50 y 100 mg/l, añadidas en dos etapas fermentativas diferentes: - Un lote de microfermentadores se han dosificado al inicio de las fermentaciones, tomando muestras a las 20, 30 y 48 horas de fermentación. - Otro lote de microfermentadores se han dosificado al alcanzar las fermentaciones el final de la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente a un PF = 10), tomando muestras a las 48 y 72 horas a partir de la dosificación. 108 IV. Resultados y discusión Todas las muestras se han analizado por cromatografía de gases (GC-MS), siguiendo el procedimiento descrito en la sección III.5.6, con el fin de verificar el momento en el cual la levadura metaboliza por completo los bloqueadores añadidos. Previamente se ha reportado la conversión de la o-vainillina en alcohol o-vainíllico por S. cerevisiae (Larsson et al, 2000) como un proceso análogo al mostrado en la Figura I.7, mediante el cual su isómero vainillina es convertida en alcohol vainíllico (Chatonnet et al, 1992; Humphries et al, 1992; Fitzgerald et al, 2003). Aunque la enzima involucrada en este proceso de bioconversión no está claramente dilucidada, se trataría de una enzima oxidoreductasa diferente a la ADH (De Wulf et al, 1986). En el Apéndice J se muestran los cromatogramas en los cuales en base al tiempo de retención (TR) obtenido con un patrón externo se ha identificado el alcohol furfurílico (TR = 11,56 min.). Además al analizar todos los picos cromatográficos se ha identificado el alcohol o-vainíllico a un TR de 21,80 minutos; ambos alcoholes, como productos derivados del furfural y la o-vainillina, respectivamente. El alcohol furfurílico se ha identificado al comparar su espectro de masas (m/z = 98/97/81) con el espectro del patrón de referencia externo, mientras que en el caso del alcohol o-vainíllico, al no contar con un patrón de referencia externo, se ha identificado en base a su espectro de masas (m/z = 65/136/154), el cual coincidió con el obtenido de la base de datos NIST MS Search 2.0. Para cuantificar el alcohol o-vainíllico, se ha utilizado como referencia la relación de producción de alcohol vainíllico a partir de la vainillina, de modo que los resultados mostrados en las figuras y tabla siguientes para la cantidad de alcohol ovainíllico producido, están calculados en base al alcohol vainíllico producido en 109 IV. Resultados y discusión fermentaciones paralelas en las cuales se ha dosificado vainillina en las mismas condiciones que las utilizadas para la o-vainillina. IV.1.2.4.1. Dosificaciones al inicio de las fermentaciones La Figura IV.16 muestra las cantidades residuales de furfural y o-vainillina así como sus alcoholes derivados al dosificar los bloqueadores al inicio de las fermentaciones. En la Tabla IV.17 se resumen las cantidades determinadas a diferentes tiempos. En el caso del furfural, la tasa de producción de alcohol furfurílico (calculado a partir del furfural añadido), está en torno al 84 % para la dosis de 50 mg/l, mientras que a la dosis de 100 mg/l, está en torno a 68 % (Tabla IV.17). Valores parecidos a los obtenidos en el medio sintético fermentado con la misma cepa de levadura ( Tabla IV.8), y comparables a los obtenidos en otro trabajo previo (Díaz de Villegas et al, 1992), en el cual se obtuvo una conversión en torno al 70 %. En cuanto al tiempo que la levadura necesita para eliminar los bloqueadores del medio, el furfural fue metabolizado antes de las 20 horas, como puede apreciarse en la Figura IV.16. Al analizar nuevamente a las 30 horas no se obtuvieron cambios considerables en las cantidades de alcohol furfurílico a ambas dosis de furfural, mientras que la ovainillina fue eliminada del mosto después de 30 horas de fermentación, con producciones de alcohol o-vainíllico en torno al 32 y 25 % con respecto a la o-vainillina añadida a las dosis de 50 y 100 mg/l respectivamente (Tabla IV.17). 110 IV. Resultados y discusión 100 Furfural - inicio mg/l 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 Horas F (50 mg/l) AF F (100mg/l) 100 AF o -Vainillina - inicio mg/l 80 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Horas OV (50 mg/l) AOV OV (100mg/l) AOV Figura IV.16. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción de sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a partir de su dosificación en mosto tinto al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA. IV.1.2.4.2. Dosificaciones al finalizar la fase de crecimiento exponencial La Figura IV.17 muestra las cantidades de furfural y o-vainillina residuales así como sus alcoholes derivados al dosificar estos bloqueadores en el mosto al finalizar la fase de crecimiento exponencial. En la Tabla IV.17 se resumen las cantidades determinadas a los diferentes tiempos de fermentación. 111 IV. Resultados y discusión En el caso del furfural, la tasa de producción de alcohol furfurílico está en torno al 76 % para la dosis de 50 mg/l, y en torno al 71 % a la dosis de 100 mg/l (Tabla IV.17). Valores parecidos a los obtenidos en el medio sintético fermentado con la misma cepa de levadura y dosificado con furfural en fase de crecimiento exponencial (Tabla IV.10), y comparables a los obtenidos por Díaz de Villegas et al (1992), en torno al 70 %. En cuanto al tiempo que la levadura necesita para eliminar los bloqueadores del medio, el furfural fue metabolizado antes de las 48 horas de fermentación, como puede apreciarse en la Figura IV.17. La o-vainillina también fue metabolizada antes de las 48 horas, con producciones de alcohol o-vainíllico en torno al 30 % con respecto a la ovainillina añadida a ambas dosis (Tabla IV.17). Si bien no se tienen referencias bibliográficas sobre la tasa de conversión de la ovainillina en alcohol o-vainíllico, existen estudios previos que reportan la producción de alcohol vainíllico en torno a un 95 % con respecto a la vainillina adicionada a una dosis de 500 mg/l tras 48 horas de fermentación con S. cerevisiae (De Wulf et al, 1986), bioconversión que es óptima a 30 ºC y a un pH de 3 (aunque entre pHs de 2,5 y 5,0 los efectos no fueron muy diferentes), trabajando con una concentración de glucosa de 20 g/l y la vainillina añadida en fase de crecimiento exponencial. En otro estudio con S. cerevisiae se obtuvo una completa bioconversión en alcohol vainíllico a una dosis de 150 mg/l de vainillina tras 24 horas de fermentación (Fitzgerald et al, 2003), mientras que esta conversión era menor a medida que se incrementaban las concentraciones de vainillina, así, a concentraciones de 750, 1500 y 2250 mg/l, la producción de alcohol vainíllico fue del 69, 41 y 2%, respectivamente. Destacando 112 IV. Resultados y discusión además en dicho estudio y tras la comparación con las curvas de crecimiento, que la bioconversión podría sólo llevarse a cabo durante el crecimiento celular, pues al dosificar la vainillina en la fase estacionaria la bioconversión fue mucho más baja para todas las concentraciones utilizadas. 100 Furfural - log mg/l 80 60 40 20 0 0 10 20 F (50 mg/l) 30 40 AF 50 60 70 F (100mg/l) 100 80 Horas AF o -Vainillina - log mg/l 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Horas OV (50 mg/l) AOV OV (100mg/l) AOV Figura IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción de sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a partir de su dosificación en mosto tinto al finalizar la fase de crecimiento exponencial (fase log) con la levadura 7VA. 113 IV. Resultados y discusión Tabla IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción de sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a partir de su dosificación en mosto tinto con la levadura 7VA. Dosificación Al inicio de las fermentaciones 20 horas F 50 F 100 OV 50 OV 100 30 horas Al finalizar la fase exponencial 48 horas mg/l % mg/l % n.d. 0,00 n.d. % mg/l % 0,00 n.d. 0,00 n.d. 0,00 42,40 ± 1,82 84,80 41,86 ± 1,80 83,73 36,40 ± 0,40 72,80 38,30 ± 0,87 76,60 n.d. 0,00 n.d. 0,00 n.d. 0,00 n.d. 0,00 Alcohol furfurílico 67,70 ± 1,35 67,70 63,66 ± 4,34 63,67 71,56 ± 1,86 71,57 71,63 ± 1,02 71,63 o-Vainillina 11,03 ± 1,84 22,07 1,10 ± 0,43 2,20 n.d. 0,00 n.d. 0,00 n.d. 0,00 Alcohol o-vainíllico 12,78 ± 2,16 25,57 16,20 ± 2,15 32,40 15,88 ± 1,54 31,76 14,47 ± 2,31 28,95 16,27 ± 3,83 32,55 o-Vainillina * * 11,53 ± 2,17 11,53 n.d. 0,00 n.d. 0,00 n.d. 0,00 Alcohol o-vainíllico * * 21,97 ± 2,56 21,98 25,52 ± 2,26 25,52 29,67 ± 1,62 29,68 30,70 ± 1,00 30,70 Alcohol furfurílico Furfural residual n.d.: No detectado. (*) Inhibición total de la fermentación. 114 % 72 horas mg/l Furfural residual mg/l 48 horas IV. Resultados y discusión IV.1.3. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de ácido cinámico (isómero trans) a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones de azúcar en el medio. Dadas las diferencias mostradas en los ensayos con furfural y o-vainillina con respecto a la composición del medio fermentativo, en el caso del ácido trans-cinámico sólo se han utilizado medios preparados a partir de mosto concentrado o con mosto fresco. La elección de éste ácido como posible bloqueador metabólico para reducir el grado alcohólico en vinos se hizo en base a la literatura consultada, al mostrar mayores propiedades inhibitorias sobre la actividad celular en comparación con otros derivados fenilpropanos como el ácido p-cumárico, ácido 3-metoxi-cinámico, ácido 4-metoxicinámico, ácido ferúlico, etc. Ello debido a su estructura molecular, al tratarse de un compuesto bencílico con menos sustituyentes laterales (Figura I.12), tal como se ha demostrado en un estudio previo (Larsson et al, 2000), y cuyo efecto inhibitorio es mayor a menores concentraciones que otros ácidos orgánicos como el benzoico, fórmico, acético, propiónico o butanoico (Huang et al, 2011). 115 IV. Resultados y discusión IV.1.3.1. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico en mosto tinto con diferentes concentraciones de azúcar y análisis del estireno producido Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en mosto tinto de uva Tempranillo con 11,5 y 14,4 % v/v de GAP. Las dosis de ácido trans-cinámico han sido de 100, 200 y 500 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.5) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.3.1.1. Grado alcohólico En un trabajo previo (Larsson et al, 2000), a una dosis de 1000 mg/l de ácido cinámico (aunque no se informa el isómero con el que se trabaja), se inhibió en un 58 % la producción de etanol por S. cerevisiae. En nuestros resultados, se puede apreciar que las levaduras 7VA y AWRI796 fueron inhibidas totalmente a la dosis de 500 mg/l (Figura A.5) y a la dosis de 200 mg/l apenas se pudo observar actividad fermentativa. A la dosis de 100 mg/l se produjo un retraso en el inicio de la fermentación, tardando para ambas levaduras 6 y 8 días en iniciar en los medios de 11,5 y 14,4 % de GAP respectivamente, sin embargo el final de la fermentación no fue afectado. La Figura IV.18 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido a las diferentes concentraciones de azúcar. En el mosto con una GAP de 11,5 %, el mayor efecto se obtuvo con la levadura AWRI796, con una reducción del grado alcohólico de 0,30 % v/v a la dosis de 100 mg/l, mientras que con la levadura 7VA prácticamente no hubo un efecto apreciable con respecto al control. 116 IV. Resultados y discusión Similar comportamiento se observó en el mosto con una GAP de 14,4 % v/v, en el cual con la levadura AWRI796 se logró una reducción del grado alcohólico de 0,41 % v/v a la dosis de 100 mg/l, mientras que la levadura 7VA no se vio afectada, incluso se observó un incremento del grado alcohólico con respecto al control. El análisis estadístico (Apéndice D.1), muestra una diferencia significativa en el grado alcohólico para la levadura AWRI796 con respecto al control a la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico en el medio con 11,5 % de GAP, mientras que para el medio con 14,4 % de GAP la diferencia no es significativa. Lo cual pone de manifiesto que el efecto inhibitorio de este ácido sobre esta cepa de levadura podría verse influenciado por la concentración de azúcar en el medio fermentativo, análogamente a lo observado en los ensayos con o-vainillina y furfural. Con la levadura 7VA no se obtienen diferencias significativas con respecto al control en ninguno de los medios a las diferentes dosis de ácido cinámico, lo que permitiría asumir que en esta levadura la fermentación alcohólica no es inhibida por este bloqueador, poniendo de manifiesto la variación de la sensibilidad a los bloqueadores metabólicos cuando se utilizan diferentes levaduras (Lu et al, 2007). Además cabe mencionar lo reportado por Larsson et al (2000), quienes en su trabajo observaron que a 200 mg/l únicamente se veía afectado el crecimiento celular, pero no la producción de etanol, para lo cual se requerirían mayores dosis de ácido cinámico. Considerando lo expuesto anteriormente sobre la total inhibición de las levaduras 7VA y AWRI796 a la dosis de 200 mg/l, la utilización de 100 mg/l constituye una interesante alternativa a evaluar. 117 IV. Resultados y discusión Grado alcohólico % v/v 12,0 11,5 % GAP 7VA 11,5 AWRI 796 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 0 100 Ácido cinámico (mg/l) Grado alcohólico % v/v 15,0 14,4 % GAP 7VA 14,5 AWRI 796 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 100 Ácido cinámico (mg/l) Figura IV.18. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.3.1.2. Azúcares residuales La Tabla IV.18 muestra las cantidades de azúcares residuales obtenidos con ambas levaduras. En el mosto con 11,5 % de GAP, el ácido trans-cinámico no afecta el consumo de azúcares por S. cerevisiae al obtener bajas concentraciones residuales, mientras que en los fermentados con 14,4 % de GAP, el ácido trans-cinámico afecta el 118 IV. Resultados y discusión consumo de azúcares al contener mayores cantidades residuales, sobre todo con la levadura AWRI796. Tabla IV.18. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Ácido trans-cinámico mg/l 0 100 200 500 Azúcares residuales (g/l) 11,5 % GAP 14,4 % GAP 7VA AWRI 796 7VA AWRI 796 1,99 ± 0,42 a 1,70 ± 0,05 a 3,60 ± 0,13 a 4,28 ± 0,25 a 1,96 ± 0,20 a 2,35 ± 0,29 b 3,39 ± 0,14 a 6,13 ± 1,28 b * * * * * * * * (*) La inhibición fue total. Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.3.1.3. Análisis cromatográfico del ácido trans-cinámico residual y del estireno producido Diferentes trabajos previos mencionan la conversión del ácido cinámico en estireno por la levadura S. cerevisiae. Al respecto Chen y Peppler (1956), propusieron de que dicha conversión se llevaría a cabo mediante la descarboxilación del ácido ( Figura I.13a), teoría posteriormente respaldada por otros estudios (Gramatica et al, 1981; Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010; Schwarz et al, 2012a), proceso que involucraría a la enzima ácido fenilacrílico descarboxilasa (PAD) (Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2001). No obstante, Shimada et al (1992), propusieron otro mecanismo de conversión del ácido cinámico en estireno, el cual involucraría primero la conversión de ácido cinámico a ácido pcumárico, posteriormente a ácido cafeico y finalmente a estireno (Figura I.14), lo que podría ocurrir simultáneamente con lo propuesto por Chen y Peppler (1956). Con lo cual, la levadura eliminaría del medio fermentativo el ácido cinámico y su efecto inhibitorio sería menor. 119 IV. Resultados y discusión En el Apéndice K se puede observar el cromatograma en el cual se identificó el estireno a un TR = 6,46 min. y cuyo espectro de masas (m/z = 104/103/78) coincidió con el obtenido de la base de datos NIST MS Search 2.0, sin embargo con el método utilizado para analizar el furfural y la o-vainillina, no se han podido obtener picos cromatográficos con buena resolución que permitan identificar y cuantificar las cantidades residuales del ácido trans-cinámico, aunque en los cromatogramas se han identificado algunos picos (TR = 24,80 min.) cuyo espectro de masas (m/z = 147/148/103) coincidió con el del patrón externo y con el espectro de la base de datos NIST MS Search 2.0. Dichos picos corresponden a la dosis de 100 mg/l, tal como puede apreciarse en el Apéndice K, y se han detectado a las 48 y 72 horas a partir de su dosificación en el mosto, con lo cual, podría considerarse que a diferencia del furfural y la o-vainillina, los cuales tras 48 horas de fermentación desde su dosificación son metabolizados completamente (Figuras IV.16 y IV.17), la levadura necesitaría un mayor tiempo para eliminar totalmente el ácido trans-cinámico del medio fermentativo. IV.1.3.2. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico a diferentes concentraciones de azúcar en un medio a base de mosto concentrado Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en medios a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 12 y 15 % v/v de GAP. Las dosis de ácido trans-cinámico han sido de 50 y 100 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. 120 IV. Resultados y discusión IV.1.3.2.1. Grado alcohólico La Figura IV.19 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido. Al igual que en el ensayo anterior, la levadura AWRI796 es la que más sensibilidad muestra al efecto inhibitorio, pues a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico logra reducir el grado alcohólico en 0,18 y 0, 27 % v/v con respecto al control en los medios fermentativos con 12 y 15 % de GAP respectivamente. A diferencia del ensayo anterior con mosto tinto, en el presente ensayo la dosis de 100 mg/l inhibe totalmente a la levadura AWRI796, mientras que a la misma dosis en la levadura 7VA causa un retraso del inicio de la fermentación de manera similar al ensayo anterior, además en la levadura 7VA no se observa inhibición en la producción de etanol, lo que indicaría que esta levadura activa de manera más eficiente mecanismos para metabolizar el ácido trans-cinámico y detoxificar el medio, principalmente mediante su conversión en estireno, como se ha mencionado en diferentes trabajos previos (Chen y Peppler, 1956; Gramatica et al, 1981; Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010; Schwarz et al, 2012a; Shimada et al, 1992), lo cual concuerda con los resultados obtenidos en el análisis anterior cuyos cromatogramas se muestran en el Apéndice K. Finalmente, considerando lo observado con la levadura AWRI796, la cual fue inhibida totalmente a la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico, posiblemente la naturaleza del medio fermentativo haya causado algún efecto, pues las dosis añadidas son las mismas que en el ensayo anterior y las concentraciones de azúcar de los medios son similares. Además, en este ensayo se obtienen concentraciones de azúcares residuales altas, como se muestra en la Tabla IV.19, lo cual indicaría una escasez de nutrientes 121 IV. Resultados y discusión requeridos por las levaduras al tratarse de medios a base de mosto concentrado, como ya se ha observado en los ensayos con o-vainillina y furfural. Grado alcohólico % v/v 12,0 12 % GAP 7VA 11,5 AWRI 796 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 0 50 100 Ácido cinámico (mg/l) Grado alcohólico % v/v 15,5 15 % GAP 7VA AWRI 796 15,0 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 0 50 Ácido cinámico (mg/l) 100 Figura IV.19. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado de 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 122 IV. Resultados y discusión Tabla IV.19. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado de 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Ácido trans-cinámico mg/l 0 50 100 Azúcares residuales totales (g/l) 12 % GAP 15 % GAP 7VA AWRI 796 7VA AWRI 796 7,04 ± 0,49 a 6,60 ± 0,12 a 7,98 ± 0,09 a 8,42 ± 0,23 a 6,57 ± 0,10 a 6,76 ± 0,18 a 7,97 ± 0,09 a 8,65 ± 0,20 a 6,65 ± 0,18 a * 8,43 ± 0,40 a * (*) La inhibición fue total. Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.3.2.2. Compuestos volátiles de origen fermentativo Todas las concentraciones de compuestos volátiles fermentativos se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación, observándose para ambas levaduras un efecto en las producciones de 1-propanol y 2,3-butanodiol en los medios con 12 y 15 % de GAP, del 2-metil-1-butanol en los medios con 15 % de GAP y del acetato de etilo en los medios con 12 % de GAP. El 1-propanol incrementa con ambas levaduras. Con la levadura 7VA a 100 mg/l de ácido trans-cinámico incrementa su producción en 23 y 36% en los medios con 12 y 15% de GAP respectivamente (Tabla IV.20), mientras que con la dosis de 50 mg/l no se observa un efecto en su producción. Con levadura AWRI796 se observa a la dosis de 50 mg/l un incremento del 11 y 18% en los medios con 12 y 15% de GAP respectivamente con respecto al control (Tabla IV.21). Comportamiento similar se observa con el 2,3-butanodiol, que a 50 mg/l de ácido transcinámico no se observa ningún efecto con la levadura 7VA, mientras que a la dosis de 123 IV. Resultados y discusión 100 mg/l se incrementa su producción en 40 y 41% con respecto al control en los medios con 12 y 15% de GAP respectivamente. Con la levadura AWRI796 se incrementa su producción en 14 y 16% en los medios con 12 y 15% de GAP respectivamente (Tabla IV.21). Como se ha indicado en estudios previos, la síntesis del 2,3-butanodiol sería un mecanismo de producción de metabolitos neutros para contrarrestar los altos niveles de acidez y prevenir la acidificación celular (Nakashimada et al, 2000), activando enzimas involucradas en su síntesis (Bryn et al, 1973). Además otra importante función de la producción del 2,3-butanodiol es la regeneración del exceso de poder reductor asociado a la glicolisis, regulando el ratio NADH/NAD+ (Celińska y Grajek, 2009). Lo cual podría explicar el incremento en su producción con ambas cepas de levaduras. En cuanto al 2-metil-1-butanol, el cual solamente varía en los medios con 15 % de GAP, a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico incrementa su producción en un 19% con la levadura AWRI796 (Tabla IV.21) y con la levadura 7VA disminuye un 10% con respecto al control, mientras se produce un incremento del 24% a 100 mg/l de ácido trans-cinámico con la última levadura (Tabla IV.20). Con respecto al acetato de etilo, cuya producción sólo fue afectada en el medio con 12 % de GAP, con la levadura 7VA disminuye en 41% con respecto al control a 100 mg/l de ácido trans-cinámico, mientras que a 50 mg/l no se aprecia un efecto importante (Tabla IV.20). Con la levadura AWRI796 (Tabla IV.21), a 50 mg/l de ácido transcinámico, se incrementa su producción en un 13% con respecto al control. 124 IV. Resultados y discusión Tabla IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico (mg/l) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). (mg/L) Metanol 1-Propanol Diacetilo Acetato de etilo Isobutanol 1-Butanol Acetoína 2-Metil-1-butanol 3-Metil-1-butanol Lactato de etilo 2,3-Butanodiol Acetato de isoamilo Hexanol 2-Feniletanol Acetato de 2-feniletilo Control 3,67 ± 0,15 a 28,36 ± 3,24 a 2,37 ± 0,30 a 44,89 ± 12,63 a 13,48 ± 0,74 a 4,16 ± 0,26 a 13,25 ± 1,75 a 70,35 ± 7,02 a 15,83 ± 0,96 a 6,23 ± 0,32 a 618,10 ± 60,56 a 2,24 ± 0,25 a 0,93 ± 1,87 a 19,95 ± 2,08 a 7,63 ± 0,15 a 12 % GAP 50 3,76 ± 0,11 a 30,66 ± 1,75 ab 2,34 ± 0,15 a 47,05 ± 3,86 a 11,86 ± 0,63 b 4,09 ± 0,08 a 12,91 ± 4,81 a 71,73 ± 3,81 a 14,45 ± 0,54 b 6,37 ± 0,32 a 588,36 ± 17,21 a 2,16 ± 0,11 a 0,94 ± 1,88 a 21,01 ± 1,37 a 7,82 ± 0,23 a 100 3,58 ± 0,15 a 34,94 ± 1,01 b 2,43 ± 0,17 a 26,58 ± 2,17 b 11,45 ± 0,22 b 4,13 ± 0,04 a 12,71 ± 0,75 a 63,54 ± 4,85 a 16,36 ± 0,32 a 5,87 ± 0,02 a 867,10 ± 53,36 b 2,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 18,30 ± 0,92 a 7,57 ± 0,19 a Control 35,87 ± 3,00 a 40,75 ± 4,06 a 2,25 ± 0,11 a 57,31 ± 9,75 a 11,33 ± 0,82 a 4,82 ± 0,28 a 10,17 ± 0,41 a 101,44 ± 6,74 a 18,44 ± 1,51 a 6,28 ± 0,22 a 1086,55 ± 50,66 a 2,68 ± 0,44 a 4,70 ± 0,19 a 24,37 ± 1,17 ab 7,98 ± 0,42 a Letras diferentes en la misma fila para cada GAP indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 125 15 % GAP 50 35,23 ± 1,66 a 41,21 ± 0,85 a 2,48 ± 0,11 a 54,50 ± 2,71 a 9,54 ± 0,40 b 4,95 ± 0,21 a 9,94 ± 1,94 a 90,64 ± 2,85 b 15,89 ± 0,60 b 8,19 ± 2,41 a 1153,77 ± 16,99 a 2,61 ± 0,15 a 4,82 ± 0,26 ab 25,32 ± 2,35 a 9,91 ± 0,56 b 100 40,13 ± 1,06 b 55,28 ± 2,55 b 2,79 ± 0,13 b 55,07 ± 8,68 a 11,89 ± 0,41 a 5,22 ± 0,19 a 13,94 ± 1,00 b 125,06 ± 5,33 c 21,42 ± 1,00 c 6,54 ± 0,16 a 1536,74 ± 143,40 b 2,55 ± 0,48 a 5,20 ± 0,12 b 21,97 ± 0,62 b 8,28 ± 0,75 a IV. Resultados y discusión 100 7VA - 12 % GAP mg/l 80 60 40 20 Ac e ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol Di ac et Ac ilo et at o de et ilo Is ob ut an ol 1Bu ta no l Ac et 2oi M na et il1b ut 3an M et ol il1bu ta La no ct l at o Ac d ee et at til o o de iso am ilo Al H co ex ho an l2 ol - fe Ac ni et l e at tíl o ico de 2fe ni let ilo 0 Ácido trans -cinámico (mg/l) 0 50 100 Figura IV.20. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 140 7VA - 15 % GAP 120 mg/l 100 80 60 40 20 Ac e ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol Di ac et Ac ilo et at o de et ilo Is ob ut an ol 1Bu ta no l Ac et 2oi M na et il1b ut 3an M et ol il1bu ta La no ct l at o Ac de et et at ilo o de iso am ilo Al H co e xa ho no l2 l - fe Ac n ile et at t í lic o de o 2fe ni let ilo 0 Ácido trans -cinámico (mg/l) 0 50 100 Figura IV.21. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 126 IV. Resultados y discusión Tabla IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico (mg/l) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). (mg/L) Metanol 1-Propanol Diacetilo Acetato de etilo Isobutanol 1-Butanol Acetoína 2-Metil-1-butanol 3-Metil-1-butanol Lactato de etilo 2,3-Butanodiol Acetato de isoamilo Hexanol 2-Feniletanol Acetato de 2-feniletilo 12 % GAP 15 % GAP Control 50 Control 50 3,89 ± 0,14 a 65,17 ± 4,02 a 2,16 ± 0,27 a 45,98 ± 3,22 a 17,19 ± 0,30 a 4,16 ± 0,08 a 9,33 ± 1,18 a 77,41 ± 2,53 a 18,66 ± 2,29 a 6,78 ± 0,17 a 532,48 ± 29,76 a 2,37 ± 0,24 a 0,93 ± 1,86 a 20,11 ± 1,02 a 7,39 ± 0,31 a 4,02 ± 0,14 a 72,47 ± 1,99 b 2,17 ± 0,08 a 51,79 ± 3,35 b 16,81 ± 0,24 a 4,57 ± 0,23 a 10,01 ± 1,02 a 84,63 ± 1,12 a 21,83 ± 1,33 a 6,20 ± 0,12 b 605,33 ± 45,87 b 2,41 ± 0,22 a 0,00 ± 0,00 a 20,86 ± 0,95 a 7,45 ± 0,27 a 31,65 ± 4,41 a 66,17 ± 0,16 a 2,29 ± 0,27 a 46,27 ± 1,51 a 14,63 ± 0,28 a 4,30 ± 0,30 a 9,61 ± 0,98 a 85,55 ± 0,58 a 20,71 ± 2,60 a 6,46 ± 0,06 a 923,01 ± 28,48 a 2,66 ± 1,17 a 4,93 ± 0,21 a 21,99 ± 0,39 a 8,57 ± 0,68 a 31,86 ± 4,32 a 77,94 ± 2,83 b 2,11 ± 0,15 a 48,22 ± 8,37 a 16,19 ± 2,66 a 4,69 ± 0,44 a 8,73 ± 0,91 a 102,12 ± 8,99 b 21,11 ± 0,87 a 7,16 ± 1,34 a 1073,56 ± 49,01 b 2,16 ± 0,26 a 4,99 ± 0,14 a 24,09 ± 1,52 b 9,59 ± 0,08 b Letras diferentes en la misma fila para cada GAP indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 127 IV. Resultados y discusión 100 AWRI796 - 12 % GAP mg/l 80 60 40 20 M et an ol 1Pr op an ol Di ac et Ac ilo et at o de et ilo Is ob ut an ol 1Bu ta no l Ac et 2oi M na et il1bu 3ta M no et l il1bu ta La no l ct at o Ac de et et at ilo o de iso am ilo Al H co ex ho an l2 ol - fe Ac ni let et at íli o co de 2fe ni let ilo Ac e ta ld eh íd o 0 Ácido trans -cinámico (mg/l) 0 50 Figura IV.22. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 120 AWRI796 - 15 % GAP 100 mg/l 80 60 40 20 Ac e ta ld eh íd o M et an ol 1Pr op an ol Di ac et Ac ilo et at o de et ilo Is ob ut an ol 1Bu ta no l Ac et 2oi M na et il1b ut 3an M et ol il1bu ta La no ct l at o Ac de et et at ilo o de iso am ilo Al H co ex ho an l2 ol fe Ac ni et let at íli o co de 2fe ni let ilo 0 Ácido trans -cinámico (mg/l) 0 50 Figura IV.23. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 128 IV. Resultados y discusión IV.1.3.2.3. Producción de acetaldehído La Tabla IV.22 muestra las producciones de acetaldehído. Con la levadura AWRI796 en ambos medios a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico se observa un incremento en la producción de acetaldehído, aunque estadísticamente dicho incremento no es significativo con respecto al control. Mientras que a la misma dosis de ácido transcinámico con la levadura 7VA en el medio con 12 % de GAP se aprecia un incremento de 65 % con respecto al control, mientras que en el medio con 15 % de GAP el incremento es del 37 %, aunque no es significativamente diferente al control. A la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico como previamente ya se ha mencionado, la levadura AWRI796 fue inhibida completamente. Con la levadura 7VA a esta dosis, la producción de acetaldehído aumenta considerablemente con respecto al control, alcanzando incrementos superiores al 100% en ambos medios. Tabla IV.22. Producción de acetaldehído a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Ác. trans-cinámico (mg/l) 0 50 100 Acetaldehído (mg/l) 12 % GAP 15 % GAP 7VA AWRI 796 7VA AWRI 796 40,46 ± 9,13 a 27,44 ± 1,65 a 48,85 ± 17,54 a 37,28 ± 2,41 a 66,90 ± 7,01 b 29,65 ± 2,83 a 66,86 ± 7,29 ab 42,21 ± 4,35 a 82,72 ± 12,17 b * 102,06 ± 22,75 b * (*): La inhibición fue total. Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). Con la levadura 7VA, los resultados concuerdan con los obtenidos para el furfural (Tabla IV.3) en los cuales también se observa un incremento del acetaldehído. 129 IV. Resultados y discusión 130 IV. Resultados y discusión IV.1.4. Efecto inhibitorio del glicolaldehído En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de glicolaldehído a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones de azúcar en el medio. IV.1.4.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con alto contenido de azúcar Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 15 % v/v de GAP. Las dosis de glicolaldehído han sido de 100 y 200 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.6) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.4.1.1. Grado alcohólico La Figura IV. 24 muestra el grado alcohólico obtenido. En ambas levaduras a 100 mg/l de glicolaldehído no se apreció un efecto inhibitorio significativo, mientras que a la dosis de 200 mg/l se logró reducir el grado alcohólico con la levadura 7VA en 0,31 % v/v con respecto al control, mientras que con la levadura AWRI796 la reducción fue de 0,76 % v/v. Resultados considerablemente diferentes a los obtenidos por Jayakody et al (2011), quienes a una dosis de 240 mg/l de glicolaldehído obtuvieron una reducción del 131 IV. Resultados y discusión grado alcohólico aproximada del 51% con respecto al control, mientras que a 120 mg/l obtuvieron una reducción del 43%, aunque en dicho estudio utilizaron un medio con una concentración de glucosa de 100 g/l. El análisis estadístico indica que la reducción más significativa del grado alcohólico fue la obtenida con la levadura AWRI796 a la dosis de 200 mg/l (Apéndice E.1), lo cual constituye una interesante alternativa a considerar, dado que a dosis superiores a 240 mg/l, el glicolaldehído podría disminuir considerablemente el consumo de azúcares por la levadura (Jayakody et al, 2011). 15,0 7VA AWRI 796 Grado alcohólico % v/v 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 100 200 Glicolaldehído (mg/l) Figura IV.24. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicoladehído con las levaduras 7VA y AWRI 796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.1.4.1.2. Azúcares residuales La Tabla IV.23, muestra los azúcares residuales con ambas levaduras, las cuales indican que estas dosis de glicolaldehído constituyen una interesante alternativa a evaluar en 132 IV. Resultados y discusión otras condiciones de fermentación con el fin de reducir el grado alcohólico sin afectar el consumo de azúcares por S. cerevisiae. Tabla IV.23. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicoladehído con las levaduras 7VA y AWRI 796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Glicolaldehído mg/l 0 100 200 Azúcares residuales (g/l) 7VA AWRI 796 Glucosa Fructosa Glucosa Fructosa 0,25 ± 0,51 a 4,87 ± 2,64 a 0,21 ± 0,42 a 6,10 ± 3,98 a 0,88 ± 1,77 a 5,07 ± 4,69 a 0,00 ± 0,00 a 6,46 ± 3,78 a 1,14 ± 1,35 a 5,39 ± 4,05 a 0,27 ± 0,54 a 3,91 ± 4,84 a Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.4.1.3. Producción de glicerina La Tabla IV.24 muestra la producción de glicerina, la cual no es afectada a las diferentes dosis de glicolaldehído añadidas con ambas levaduras, valores que concuerdan con los obtenidos para el furfural (Tabla IV.12) y la o-vainillina (Tabla IV.16), lo cual pone de manifiesto que el glicolaldehído no afecta la producción de glicerina por S. cerevisiae. Tabla IV.24. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de glicoladehído en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Glicolaldehído (mg/l) 0 100 200 Glicerina (g/l) 7VA 7,76 ± 0,57 a 7,21 ± 0,53 a 7,32 ± 0,51 a AWRI 796 7,73 ± 0,43 a 7,70 ± 0,04 a 7,58 ± 0,11 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 133 IV. Resultados y discusión IV.1.4.2. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en mosto de uva tinta variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP. La dosis de glicolaldehído ha sido de 200 mg/l, dosificada al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.4.2.1. Grado alcohólico La Figura IV.25 muestra el grado alcohólico obtenido. Con ambas levaduras se observa que la adición de glicolaldehído a 200 mg/l no causa ningún efecto inhibitorio sobre la producción de etanol, al contrario de lo observado en el ensayo anterior (Figura IV.24). En presencia de glicolaldehído en el medio, la levadura lo convierte en sustancias menos perjudiciales, principalmente en etilenglicol (Jayakody et al, 2012) como se muestra en la Figura I.9, y al parecer en dicho proceso estaría involucrada la enzima ADH utilizando NADH como cofactor, análogamente a la conversión del furfural (Liu et al, 2005) y la ovainillina (Larsson et al, 2000), de modo que cabría esperar que la producción de etanol a partir de la reducción del acetaldehído sea menor, al utilizar la levadura la ADH para reducir el glicolaldehído a etilenglicol (inhibición competitiva). Sin embargo en este ensayo no se observa dicho fenómeno, pues la producción de etanol no se ve afectada, incluso se incrementa, lo cual podría deberse a que la levadura utiliza otros mecanismos para detoxificar el medio, como la activación de vías alternativas para generar poder reductor en forma de NADPH, FADH2 o FMN (De Wulf et al, 1986; Petersson et al, 2006; 134 IV. Resultados y discusión Liu et al, 2008; Heer et al, 2009), sin afectar la producción de etanol ni el consumo de azúcares, los cuales son bajos (Tabla IV.25). 15,0 7VA AWRI 796 Grado alcohólico % v/v 14,5 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 200 Glicolaldehído (mg/l) Figura IV.25. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Tabla IV.25. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales totales (g/l) Glicolaldehído (mg/l) 7VA AWRI 796 2,84 ± 0,08 a 2,69 ± 0,33 a 0 2,86 ± 0,09 a 2,76 ± 0,11 a 200 Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). Finalmente, el cambio en el comportamiento de las levaduras en la producción de etanol podría deberse al medio fermentativo utilizado, pues en el ensayo anterior el medio fue preparado a base de mosto concentrado, mientras que este ensayo se ha hecho con un mosto fresco, y la disponibilidad de nutrientes pudo haber sido diferente en ambos medios a pesar de contener cantidades similares de azúcares. 135 IV. Resultados y discusión IV.1.4.3. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de grado alcohólico probable Se ha trabajado con la levadura 7VA; a temperatura constante de 22 ºC en mosto de uva tinta variedad Tempranillo con 12 % v/v de GAP. La dosis de glicolaldehído utilizada ha sido de 200 mg/l, dosificada al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.4.3.1. Grado alcohólico La Figura IV.26 muestra el grado alcohólico obtenido. Al igual que en el ensayo anterior (Figura IV.25) se observa que en mosto tinto fresco el glicolaldehído no inhibe la producción de etanol, ni siquiera a un menor contenido de azúcares. Grado alcohólico % v/v 12,0 11,5 11,0 10,5 10,0 9,5 9,0 0 200 Glicolaldehído (mg/l) Figura IV.26. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído con la levadura 7VA en mosto tinto con 12 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 136 IV. Resultados y discusión En cuanto a los azúcares residuales, al igual que en los ensayos anteriores, se observa que su consumo no es afectado a la dosis de glicolaldehído utilizada, así como tampoco es afectada la producción de glicerina (Tabla IV.26). Tabla IV.26. Azúcares residuales y producción de glicerina por la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Glicolaldehído (mg/l) 0 200 Glicerina (g/l) 6,36 ± 0,19 a 5,83 ± 0,24 a Azúcares residuales totales (g/L) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 137 IV. Resultados y discusión 138 IV. Resultados y discusión IV.1.5. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de pbenzoquinona a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones de azúcar en el medio. Se ha elegido la p-benzoquinona en base a la literatura consultada con respecto a su efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae (Larsson et al, 2000), además, a diferencia de otras quinonas, su naturaleza química y su mecanismo de acción le confieren un mayor efecto inhibitorio a bajas dosis en condiciones de anaerobiosis (Rodriguez et al, 2004). IV.1.5.1. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en medios a base de mosto concentrado con diferentes concentraciones de azúcar Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 12 y 15 % v/v de GAP. Las dosis de p-benzoquinona han sido de 20 y 100 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.5.1.1. Grado alcohólico La Figura IV.27 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico a las diferentes dosis de p-benzoquinona. 139 IV. Resultados y discusión En el medio con menor contenido de azúcares (12 % de GAP), el mayor efecto sobre el grado alcohólico se observa con la levadura 7VA, en la cual a 20 mg/l de pbenzoquinona se logra una reducción de 0,52 % v/v con respecto al control, mientras que a 100 mg/l se reduce el grado alcohólico en 0,71 % v/v. No obstante, el análisis estadístico (Apéndice F.1) no muestra diferencias significativas con respecto al control. En un trabajo previo (Larsson et al, 2000), se observó que una dosis de 20 mg/l de pbenzoquinona inhibía totalmente tanto el crecimiento celular como la producción de etanol en S. cerevisiae, aunque en dicho estudio la concentración de azúcar en el medio fue mucho menor (100 g/l de glucosa). Con la levadura AWRI796, se observa un comportamiento opuesto, pues el grado alcohólico incrementa en presencia de ambas dosis de p-benzoquinona, lo que demuestra que el efecto varía en función de la cepa de levadura, como se ha observado con otros bloqueadores utilizados en ensayos anteriores. Con respecto al medio con mayor concentración de azúcares (15 % de GAP), la reducción del grado alcohólico es menor, corroborando la influencia de la concentración azucarada en el efecto inhibitorio, pues con la levadura 7VA a la dosis de 20 mg/l de pbenzoquinona tan sólo se reduce el grado alcohólico un 0,37 % v/v con respecto al control, mientras que a la dosis de 100 mg/l apenas se observa el efecto. El análisis estadístico no muestra diferencias significativas en la reducción del grado alcohólico a las diferentes dosis de p-benzoquinona con respecto al control (Apéndice F.1). Con la levadura AWRI796 a 15 % de GAP aparentemente se consigue una mayor reducción del grado alcohólico a las dosis de 20 y 100 mg/l de p-benzoquinona (0,78 y 140 IV. Resultados y discusión 1,29 % v/v respectivamente con respecto al control), sin embargo en la Tabla IV.27 se puede apreciar altas cantidades de azúcares residuales, de modo que no se puede establecer que la p-benzoquinona en este medio inhiba considerablemente la producción de etanol con esta levadura. Grado alcohólico % v/v 12,0 12 % GAP 7VA AWRI 796 11,0 10,0 9,0 8,0 0 20 100 p -Benzoquinona (mg/L) Grado alcohólico % v/v 15,0 15 % GAP 7VA AWRI 796 14,0 13,0 12,0 11,0 0 20 100 p -Benzoquinona (mg/L) Figura IV.27. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 141 IV. Resultados y discusión IV.1.5.1.2. Azúcares residuales La Tabla IV.27 muestra las cantidades de azúcares residuales para ambas levaduras, que en todos los casos son altas, lo que indicaría que el medio fermentativo no ha tenido los nutrientes necesarios, afectando la actividad de ambas levaduras, más notorio en la levadura AWRI796. Tabla IV.27. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). p-Benzoquinona mg/l 0 20 100 Azúcares residuales totales (g/l) 12 % GAP 15 % GAP 7VA AWRI 796 7VA AWRI 796 14,39 ± 0,33 a 21,64 ± 1,02 a 18,80 ± 0,44 a 21,73 ± 4,30 a 15,05 ± 0,62 a 15,59 ± 1,27 b 19,41 ± 0,83 a 29,75 ± 4,42 a 14,85 ± 0,26 a 15,91 ± 1,12 b 18,97 ± 1,10 a 41,6 ± 14,11 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.5.2. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en mosto de uva tinta Syrah con 14,3 % v/v de GAP. Las dosis de p-benzoquinona han sido de 20 y 50 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición de bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.5.2.1. Grado alcohólico La Figura IV. 28 muestra el grado alcohólico obtenido con ambas levaduras. El único caso en el que se observa un efecto inhibitorio es a 50 mg/l de p-benzoquinona con la 142 IV. Resultados y discusión levadura 7VA, con la cual se reduce el grado alcohólico en 0,19 % v/v con respecto al control. Mientras que la dosis de 20 mg/l no se observa un efecto inhibitorio apreciable sobre la producción de etanol. Con la levadura AWRI796, la producción de etanol incrementa con ambas dosis de p-benzoquinona, comportamiento similar al observado en el ensayo anterior con el medio a 12 % de GAP (Figura IV.27). Estos comportamientos en las levaduras podrían deberse a la influencia del medio fermentativo utilizado en este ensayo, pues al tratarse de un mosto fresco, la disponibilidad de nutrientes es diferente que con el medio a base de mosto concentrado, como se ha observado en el caso del glicolaldehído (Figuras IV.26 y IV.27). 14,5 Grado alcohólico % v/v 7VA AWRI 796 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 20 50 p -Benzoquinona (mg/l) Figura IV.28. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 143 IV. Resultados y discusión IV.1.5.2.2. Azúcares residuales La Tabla IV.28 muestra los azúcares residuales determinados después de las fermentaciones, los cuales a diferencia del ensayo anterior son bajos, razón por la cual se podría concluir en este caso que la p-benzoquinona a las dosis utilizadas no afecta negativamente el consumo de azúcares por S. cerevisiae. Tabla IV.28. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de pbenzoquinona con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales totales (g/l) p-Benzoquinona (mg/l) 7VA 2,84 ± 0,08 a 0 2,80 ± 0,07 a 20 2,73 ± 0,03 a 50 AWRI 796 2,69 ± 0,33 a 2,78 ± 0,11 a 2,89 ± 0,07 a Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 144 IV. Resultados y discusión IV.1.6. Efecto inhibitorio del cobre En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de cobre (como sulfato de cobre: CuSO4.5H20) a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones de azúcar en el medio. Igualmente se ha realizado un ensayo combinando del cobre con furfural a fin de evaluar el posible efecto sinérgico. Cabe destacar que de todos los bloqueadores evaluados, únicamente el cobre ha sido utilizado en fermentaciones con mostos de uva en estudios previos. La elección del cobre como bloqueador metabólico se ha basado en la literatura consultada, el cual tiene un efecto superior a otros metales sobre S. cerevisiae (Avery et al, 1996; Howlett y Avery, 1997), afectando tanto el crecimiento celular como la fermentación alcohólica (Zoecklein et al, 1999; Azenha et al, 2000; Brandolini et al, 2002; Shanmuganathan et al, 2004). Si bien los mecanismos de acción no están del todo claros, se considera entre otros que actúa bloqueando grupos funcionales, desplazando iones esenciales (Gadd, 1993), interactuando con los ácidos nucleicos y sitios activos de las enzimas, y principalmente se considera de relevancia la disrupción de la membrana plasmática (Ohsumi et al, 1988; Cervantes y Gutierrez-Corona, 1994; Avery et al, 1996) y la peroxidación lipídica de la membrana (Mehlhorn, 1986; Halliwell y Gutteridge, 1999; Stohs y Bagchi, 1995). En cuanto a la fermentación alcohólica, afecta a varias enzimas glicolíticas (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004), produciendo un efecto inhibitorio sobre la síntesis de etanol (Pons y Chanel, 1991; Azenha et al, 2000; Brandolini et al, 2002), de allí su posible aplicación como bloqueador metabólico. 145 IV. Resultados y discusión Las dosis utilizadas se han elegido en base a las concentraciones en las cuales puede encontrarse en los mostos, pudiendo llegar hasta 6,4 mg/l (Curvelo-Garcia, 1988), aunque se ha informado que presenta un efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica a concentraciones superiores a 9 mg/l (Zoecklein et al, 1999), razón por la cual se han incluido en los ensayos dosis superiores a dicha cantidad, tal como se ha utilizado en otros trabajos (Pons y Chanel, 1991; Azenha et al, 2000; Brandolini et al, 2002). IV.1.6.1. Efecto inhibitorio del cobre en un medio sintético con diferentes concentraciones de azúcar Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético con 12 y 14 % v/v GAP (220 y 240 g/l de glucosa respectivamente). Las dosis de cobre han sido de 5, 10 y 50 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones y un control sin adición de cobre. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.7) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa. IV.1.6.1.1. Grado alcohólico A la dosis de 50 mg/l la levadura fue inhibida totalmente en ambos medios, mientras que a 10 mg/l se observó una actividad muy baja en el medio con 12 % de GAP (Figura A.7), en el cual no finalizó la fermentación. Resultados que difieren a lo referido por otros autores, quienes señalan que S. cerevisiae puede tolerar concentraciones superiores de cobre, como por ejemplo 64 mg/l (Azenha et al, 2000), 320 mg/l si se trata de una cepa 146 IV. Resultados y discusión resistente (Brandolini et al, 2002), o incluso hasta 500 mg/l, aunque sólo se menciona su efecto en el crecimiento celular (Shanmuganathan et al, 2004). La Figura IV.29 muestra el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA a diferentes concentraciones de azúcar en los medios fermentativos. En el medio con 12 % de GAP, se incrementa el grado alcohólico a la dosis de 5 mg/l de cobre, aunque dicho incremento no es estadísticamente diferente con respecto al control (Apéndice G.1). Este resultado concuerda con el obtenido por Azenha et al (2000), quienes estudiaron el efecto del cobre sobre S. cerevisiae en dos medios diferentes: mosto de uva blanca de mesa (no mencionado por los autores, pero al ser uva de mesa se asume entre 8,0 – 9,0 % de GAP) y medio sintético YNB con 100 g/l de glucosa (en torno a 5,8 % de GAP). Para lo cual utilizaron 32 y 64 mg/l de cobre, observando en ambos medios que a pesar de que el crecimiento celular puede verse afectado, no se altera la producción final de etanol, pues en el medio YNB el grado alcohólico incrementó a ambas dosis de cobre, alcanzando 4,3 y 4,1 % v/v respectivamente, mientras que el control alcanzó 2 % v/v. En el mosto de uva de mesa, el grado alcohólico alcanzado también incrementó a 32 mg/l de cobre, alcanzando 7,5 % v/v (el control alcanzó 7 % v/v), mientras que a 64 mg/l de cobre el grado alcohólico fue menor que en el control (6,5 % v/v). En el medio con 14 % de GAP (Figura IV.29), se observa que el grado alcohólico disminuye a la dosis de 5 mg/l de cobre hasta en 1 % v/v con respecto al control, diferencia que es estadísticamente significativa (Apéndice G.1). Resultado que concuerda con otros trabajos (Pons y Chanel, 1991; Brandolini et al, 2002) en los cuales la fermentación alcohólica fue inhibida, aunque en el trabajo de Brandolini et al (2002) no se menciona la cantidad de etanol producida, se evaluó el efecto sobre el poder 147 IV. Resultados y discusión fermentativo de dos cepas de S. cerevisiae, una sensible y una resistente, utilizando un mosto tinto con 19 % de azúcares. En la cepa sensible a 32 mg/l de cobre el poder fermentativo fue reducido hasta en un 80% con respecto al control, mientras que a 320 mg/l la levadura fue inhibida totalmente. En la cepa resistente, el poder fermentativo tan sólo fue inhibido en 8 y 39% a las dosis de 32 y 320 mg/l de cobre respectivamente. 14,0 Grado alcohólico % v/v 12 % GAP 14 % GAP 13,0 12,0 11,0 10,0 9,0 0 Cobre (mg/L) 5 Figura IV.29. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre con la levadura 7VA en un medio sintético con 12 y 14 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En ninguno de los trabajos referidos se menciona si el cobre afecta el consumo de azúcares, pero de acuerdo a lo mostrado en la Tabla IV.29, se puede considerar en base a nuestros resultados que el cobre afectaría el consumo de azúcares por la levadura, aunque en el control también se obtuvieron cantidades altas de azúcares residuales, lo cual podría estar relacionado con la escasez de nutrientes en el medio fermentativo. 148 IV. Resultados y discusión Tabla IV.29. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre con la levadura 7VA en un medio sintético con 12 y 14 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales totales (g/l) GAP % v/v Cobre (mg/l) 12 14 16,02 ± 0,58 a 20,34 ± 2,31 a 0 14,96 ± 0,96 a 19,95 ± 2,20 a 5 * * 10 * * 50 (*) La levadura fue inhibida a estas dosis de cobre. Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.6.2. Efecto inhibitorio del cobre y efecto sinérgico en combinaciones con furfural en medios a base de mosto concentrado Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperatura constante de 22 ºC en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 12 y 15 % v/v de GAP. Las dosis de cobre han sido de 5, 7, y 10 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de dos tratamientos de 5 mg/l de cobre en combinación con 50 y 100 mg/l de furfural con el fin de evaluar la posible sinergia de ambos bloqueadores. Se elige la dosis de 5 mg/l de cobre por ser con la que mejores resultados se obtuvieron en el ensayo anterior. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. Es de especial interés el efecto del cobre sobre las enzimas de la vía glicolítica como la alcohol deshidrogenasa, enolasa, aldolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfoglicerato quinasa, entre otras (Costa et al, 149 IV. Resultados y discusión 2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004), enzimas que también son inhibidas por el furfural, especialmente la alcohol deshidrogenasa, involucrada directamente en la síntesis de etanol a partir de acetaldehído (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002). De allí que un posible efecto sinérgico entre el cobre y el furfural podría constituir una alternativa para reducir la producción de etanol. IV.1.6.2.1. Grado alcohólico La Figura IV.30 muestra el grado alcohólico obtenido a las diferentes dosis de cobre y con las combinaciones de cobre y furfural. En el medio con 12 % de GAP, se logra reducir el grado alcohólico en 1,03 y 1,47 % v/v con respecto al control a las dosis de 5 y 7 mg/l de cobre respectivamente. Aunque estadísticamente es más significativa la diferencia de la dosis de 7 mg/l con respecto al control (Apéndice G.2). Mientras que a la dosis de 10 mg/l si bien se logra reducir el grado alcohólico en 0,52 % v/v con respecto al control, no constituye una reducción significativa. Con respecto a similar composición en el medio fermentativo, en un trabajo previo con mosto de uva tinta en torno a 10 % de GAP (Pons y Chanel, 1991), no obtuvieron un efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica a una dosis de 14 mg/l de cobre, mientras que a 25 mg/l consiguieron reducir la producción de etanol en un 35% y a 95 mg/l la inhibición fue del 86% con respecto al control, afectando además de manera considerable la producción de metabolitos secundarios como acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y 3-metil-1butanol, además de observar que el tiempo total de fermentación aumentaba a medida que se incrementaba la concentración de cobre en el mosto. Aunque en dicho trabajo las condiciones a las cuales se llevaron a cabo los experimentos fueron las aplicadas en la producción de biocombustibles, a una temperatura de fermentación de 30 ºC. 150 IV. Resultados y discusión En los tratamientos con combinación entre cobre (5 mg/l) y las dosis de 50 y 100 mg/l de furfural se logra una reducción del 0,49 y 0,19 % v/v respectivamente con respecto al control. Sin embargo estas reducciones no muestran una diferencia estadísticamente significativa, por lo que en estas condiciones no sería relevante el efecto sinérgico cobre-furfural. En el medio con 15 % de GAP, a la dosis de 5 mg/l el grado alcohólico reduce en 0,29 % v/v con respecto al control, resultado comparable al obtenido en el ensayo anterior en el medio con 14 % de GAP (Figura IV.29), aunque dicha reducción fue mayor. Mientras que a dosis superiores no se observa un efecto en la producción de etanol, incrementando el grado alcohólico incluso en los tratamientos con adición de furfural, lo cual a diferencia de lo observado entre el furfural y la o-vainillina (Figuras IV.15-IV.17), nos permitiría concluir que no existe un efecto inhibitorio sinérgico entre el cobre y el furfural. Como puede observarse, existe una variación en cuanto al comportamiento mostrado por la levadura a las mismas dosis de cobre utilizadas en el ensayo anterior en medios con diferentes concentraciones de azúcar. Esto podría explicarse por las diferencias en cuanto a la naturaleza del medio fermentativo, que en el presente ensayo fue preparado a base de mosto concentrado. Al respecto se ha reportado que la composición del medio podría influir en las posibles interacciones del cobre con otras moléculas del mosto, de naturaleza más compleja que el medio sintético, de modo que el cobre disponible para interactuar con la levadura sería menor (Azenha et al, 2000). 151 IV. Resultados y discusión 12,0 Grado alcohólico % v/v 12 % GAP 11,0 10,0 9,0 8,0 0 5 7 10 5+F50 5+F100 5+F50 5+F100 Cobre (mg/L) 15,0 Grado alcohólico % v/v 15 % GAP 14,0 13,0 12,0 11,0 0 5 7 10 Cobre (mg/L) Figura IV.30. Grado alcohólico con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de cobre y evaluación de la sinergia entre el cobre (5 mg/l) y el furfural (F) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En cuanto a los azúcares residuales, en la Tabla IV.30 se observa que al igual que en el ensayo anterior las cantidades determinadas son altas (Tabla IV.29). 152 IV. Resultados y discusión Tabla IV.30. Azúcares residuales con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de cobre y evaluación de la sinergia entre el cobre (5 mg/l) y el furfural (F) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales totales (g/l) GAP % v/v Cobre (mg/l) 12 15 14,52 ± 0,29 a 18,57 ± 0,74 a 0 14,78 ± 0,14 a 18,92 ± 0,54 a 5 15,19 ± 0,90 a 19,41 ± 1,34 a 7 15,77 ± 0,95 a 19,16 ± 0,52 a 10 15,04 ± 0,81 a 19,21 ± 1,02 a 5-F50 15,37 ± 0,47 a 19,07 ± 0,95 a 5-F100 Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). IV.1.6.3. Efecto inhibitorio del cobre en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico probable Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en mosto de uva tinta variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP. Las dosis de cobre han sido de 5, 7, y 10 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. IV.1.6.3.1. Grado alcohólico La Figura IV.31 muestra el grado alcohólico obtenido para ambas levaduras. Con la levadura 7VA se logran reducciones de 0,10; 0,15 y 0,28 % v/v con respecto al control, a las dosis de 5, 7 y 10 mg/l de cobre respectivamente. Al respecto, en el trabajo ya referido de Brandolini et al (2002) se obtuvo similar comportamiento con S. cerevisiae al disminuir su poder fermentativo a medida que se incrementaba la concentración de cobre en mosto tinto, aunque con un menor contenido de azúcares (19%), destacando 153 IV. Resultados y discusión además en dicho trabajo que la naturaleza de la cepa de levadura es determinante en cuanto al efecto inhibitorio del cobre, lo cual podría explicar el incremento en la producción de etanol por la levadura AWRI796, incremento del grado alcohólico que también fue observado previamente con S. cerevisiae (Azenha et al, 2000). 14,5 Grado alcohólico % v/v 7VA AWRI 796 14,0 13,5 13,0 12,5 12,0 0 5 7 10 Cobre (mg/l) Figura IV.31. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En cuanto al consumo de azúcares, a diferencia de los ensayos anteriores, en el presente ensayo (Tabla IV.31) los azucares residuales son bajos, lo cual podría ser explicado por la naturaleza del medio fermentativo, que posiblemente en los casos anteriores no hayan contado con los nutrientes necesarios requeridos por las levaduras. Tabla IV.31. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Azúcares residuales totales (g/l) Cobre (mg/l) 7VA AWRI 796 2,84 ± 0,08 a 2,69 ± 0,33 a 0 2,84 ± 0,10 a 3,05 ± 0,15 ab 5 2,93 ± 0,09 a 2,87 ± 0,15 ab 7 2,85 ± 0,05 a 3,30 ± 0,21 b 10 Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 154 IV. Resultados y discusión 155 IV. Resultados y discusión 156 IV. Resultados y discusión IV.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros colorimétricos y en la producción de metabolitos secundarios en vinificaciones en tinto IV.2.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros colorimétricos en vino tinto Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos de un vino tinto producido a partir de mosto de uva variedad Tempranillo con 14,1 % v/v de GAP, utilizando las cepas 7VA y AWRI796, para lo cual se han determinado la Intensidad Colorante (IC), Tonalidad (T) y porcentajes de color. La Tabla IV.32 resume los principales parámetros colorimétricos determinados tras las fermentaciones así como las diferencias estadísticamente significativas. 157 IV. Resultados y discusión Tabla IV.32. Intensidad colorante (IC), tonalidad (T) y porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con las levaduras 7VA y AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4). Levadura Bloqueador (mg/L) IC Control 0 0,55 ± 0,01 bcd 0,46 ± 0,01 bcd 28,11 ± 0,15 ab 60,91 ± 0,85 abc 10,97 ± 0,69 de Furfural 50 0,56 ± 0,01 bcd 0,45 ± 0,01 abcd 27,95 ± 0,26 ab 60,99 ± 0,97 abc 11,04 ± 0,73 e 100 0,56 ± 0,02 bcd 0,47 ± 0,01 cd 28,43 ± 0,21 abc 60,22 ± 0,60 ab 11,34 ± 0,48 e 50 0,57 ± 0,01 cd 0,47 ± 0,01 cd 28,63 ± 0,19 bc 59,73 ± 0,24 a 11,63 ± 0,06 e 100 0,54 ± 0,00 bc 0,47 ± 0,01 cd 28,75 ± 0,19 bc 60,59 ± 0,32 abc 10,65 ± 0,44 cde 100 0,55 ± 0,01 bcd 0,47 ± 0,01 cd 28,67 ± 0,21 bc 60,69 ± 0,14 abc 10,62 ± 0,30 bcde 200 0,55 ± 0,01 bcd 0,47 ± 0,01 d 28,99 ± 0,30 c 60,51 ± 0,62 abc 10,48 ± 0,34 bcde 20 0,47 ± 0,02 a 0,45 ± 0,02 abcd 28,31 ± 0,51 abc 62,51 ± 2,03 bcde 9,16 ± 1,51 abc 50 0,53 ± 0,01 b 0,43 ± 0,00 a 27,67 ± 0,19 a 64,19 ± 0,35 e 8,13 ± 0,15 a 5 0,56 ± 0,00 bcd 0,44 ± 0,00 ab 28,11 ± 0,31 ab 63,56 ± 0,27 de 8,32 ± 0,12 a 7 0,58 ± 0,01 de 0,45 ± 0,01 abc 28,28 ± 0,44 abc 62,75 ± 0,56 cde 8,96 ± 0,14 ab 10 0,62 ± 0,01 e 0,47 ± 0,01 bcd 29,05 ± 0,31 c 61,55 ± 0,81 abcd 9,39 ± 0,55 abcd Control 0 0,58 ± 0,01 bc 0,48 ± 0,01 c 29,09 ± 0,34 b 59,78 ± 0,45 a 11,11 ± 0,15 c Furfural 50 0,57 ± 0,03 bc 0,45 ± 0,01 ab 28,05 ± 0,15 ab 61,56 ± 0,41 bcde 10,38 ± 0,26 bc 100 0,49 ± 0,02 a 0,46 ± 0,01 abc 28,42 ± 0,23 ab 61,29 ± 0,77 abcd 10,28 ± 0,58 abc 50 0,54 ± 0,00 abc 0,47 ± 0,01 bc 28,65 ± 0,13 ab 60,50 ± 0,22 abc 10,84 ± 0,15 c 100 0,52 ± 0,01 abc 0,47 ± 0,01 bc 28,75 ± 0,18 ab 60,32 ± 0,37 ab 10,91 ± 0,20 c Glicolaldehído 100 0,50 ± 0,00 ab 0,43 ± 0,01 a 27,61 ± 0,42 a 63,01 ± 0,22 e 9,36 ± 0,21 a p-Benzoquinona 20 0,54 ± 0,03 abc 0,46 ± 0,01 abc 28,76 ± 0,71 b 61,53 ± 1,09 bcde 9,69 ± 0,39 ab 50 0,54 ± 0,01 abc 0,44 ± 0,01 ab 28,03 ± 0,56 ab 62,45 ± 0,83 de 9,51 ± 0,27 ab 5 0,57 ± 0,00 bc 0,46 ± 0,01 abc 28,58 ± 0,40 ab 62,04 ± 0,31 cde 9,36 ± 0,24 a 7 0,58 ± 0,00 c 0,45 ± 0,01 ab 28,29 ± 0,15 ab 62,17 ± 0,43 cde 9,53 ± 0,31 ab 0,60 ± 0,08 c 0,47 ± 0,01 bc 28,90 ± 0,76 b 60,54 ± 1,00 abc 10 Para cada levadura, letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05). 10,54 ± 0,77 bc o-Vainillina 7VA Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre o-Vainillina AWRI 796 Cobre 158 Tonalidad % Amarillo % Rojo % Azul IV. Resultados y discusión La Figura IV.32 muestra los valores de Intensidad colorante (IC) y Tonalidad (T) obtenidos con la levadura 7VA. En la mayoría de los tratamientos no se observó una diferencia significativa con respecto al control, cuya IC fue de 0,55. Las únicas diferencias fueron observadas con 20 mg/l de p-benzoquinona con un valor de 0,47 y con el cobre a 10 mg/l con un valor de 0,62. En los valores de Tonalidad, en el control se obtuvo un valor de 0,46, siendo el único tratamiento significativamente diferente la p-benzoquinona a 50 mg/l, con un valor de 0,43. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas como puede comprobarse en la respectiva columna de la Tabla IV.32. Con respecto a los porcentajes de color obtenidos en las fermentaciones con la levadura 7VA (Figura IV.33), se observa un mayor efecto de los bloqueadores en el porcentaje de color azul, el cual disminuyó en los tratamientos con 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y con 5 y 7 mg/l de cobre. Mientras que en el porcentaje de color rojo se obtuvo un incremento en los tratamientos con 50 mg/l de p-benzoquinona y 5 mg/l de cobre. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas con respecto al control, como puede comprobarse en la Tabla IV.32. 159 IV. Resultados y discusión 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 C 10 7 C 5 C 50 Q 20 Q 20 0 G G 10 0 10 0 V 50 V F1 00 F5 0 C on t ro l 0,0 IC Tonalidad Figura IV.32. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA. Media ± desviación estándar (n = 4). 70 60 50 40 30 20 10 10 C 7 C 5 C 50 Q 20 Q 20 0 G 10 0 G 10 0 V 50 V F1 00 F5 0 C on t ro l 0 Amarillo Rojo Azul Figura IV.33. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA. Media ± desviación estándar (n = 4). Con respecto a las fermentaciones con la levadura AWRI796, la Figura IV.34 muestra los valores obtenidos de Intensidad colorante (IC) y Tonalidad (T). En la mayoría de los tratamientos no se observó diferencias significativas con respecto al control, cuya IC fue de 0,58, mostrando una mayor homogeneidad entre tratamientos, excepto en el tratamiento con 100 mg/l de furfural, cuya IC fue de 0,49. En los valores de Tonalidad, en el control se obtuvo un valor de 0,48, siendo los tratamientos significativamente 160 IV. Resultados y discusión diferentes el furfural a 50 mg/l con una T de 0,45, el glicolaldehído a 100 mg/l con una T de 0,43, la p-benzoquinona a 50 mg/l con un valor de 0,44 y el cobre a 7 mg/l con una T de 0,45. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas (Tabla IV.32) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 C 10 7 C 5 C 50 Q 20 Q G 10 0 10 0 V 50 V F1 00 F5 0 C on t ro l 0,0 IC Tonalidad Figura IV.34. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4). 70 60 50 40 30 20 10 10 C 7 C 5 C 50 Q 20 Q 10 0 G 10 0 V 50 V F1 00 F5 0 C on t ro l 0 Amarillo Rojo Azul Figura IV.35. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4). Con respecto a los porcentajes de color obtenidos con la levadura AWRI796 (Figura IV.35), se observa un efecto de los bloqueadores en los porcentajes de color azul y rojo. 161 IV. Resultados y discusión En el porcentaje de color azul se obtuvo una disminución en los tratamientos con 100 mg/l de glicolaldehído, 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y con 5 y 7 mg/l de cobre. Mientras que en el porcentaje de color rojo se obtuvo un incremento en los tratamientos con 50 mg/l de furfural, 100 mg/l de glicolaldehído, 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y con 5 y 7 mg/l de cobre. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas como puede comprobarse en la Tabla IV.32. Comparando los resultados obtenidos para ambas levaduras, se podría concluir que la pbenzoquinona y el cobre pueden ejercer un efecto mediante la modificación de los parámetros colorimétricos en vinos tintos, principalmente en el porcentaje de color azul, el cual lo disminuyen y en el porcentaje de color rojo, el cual se incrementa, sobre todo con la levadura AWRI796. 162 IV. Resultados y discusión IV.2.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de glicerina en vino tinto Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de glicerina en vinos tintos producidos a partir de mostos de uva variedad Tempranillo con 10 y 14,1 % v/v de GAP, utilizando la levadura 7VA. La glicerina es un metabolito de importante impacto en el vino ya que aporta “dulzor” y su viscosidad incrementa la suavidad, estructura y cuerpo (Hidalgo, 2010; Suárez–Lepe y Morata, 2012). Desempeña diferentes funciones durante el desarrollo de la levadura, como por ejemplo en la biosíntesis de la membrana lipídica (Pretorius, 2000), donde un intermediario esencial es su precursor glicerol-3-fosfato (Figura IV.36). Además durante la fermentación, la síntesis de glicerina está vinculada entre otras funciones, a la resistencia al estrés osmótico y oxidativo y a mantener el equilibrio redox intracelular mediante la producción de NAD+ a partir de la reoxidación del NADH citosólico generado durante la producción de biomasa (Scanes et al, 1998). En presencia de furfural se ha observado una mayor afinidad hacia el NADH por la enzima ADH -responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico- que por la enzima GPDH -responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato a glicerol-3-fosfato, precursor de la glicerina-, generándose una inhibición competitiva (Palmqvist et al, 1999). Se podría esperar por tanto que la producción de glicerina sea menor en estas condiciones, pues el furfural requiere NADH cuando es convertido por S. cerevisiae en alcohol furfurílico (Figura I.5), del mismo modo como la vainillina y la o-vainillina son convertidas en los 163 IV. Resultados y discusión alcoholes vainíllico y o-vainíllico respectivamente (Figura I.7) o el glicolaldehído en etilenglicol (Figura I.9). D-glucosa D-glucosa D-fructosa D-fructosa 2 ATP 2 ADP + 2 Pi Fructosa 1,61,6-difosfato Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehído-3-fosfato NADH + H+ Glicerol 3-fosfato deshidrogenasa GAPDH NAD+ 1,3-difosfoglicerato Glicerol-3-fosfato Piruvato Glicerina Otros metabolitos Glicerina Acetaldehído NADH + H+ ADH NAD+ Etanol Etanol Figura IV.36. Fermentación gliceropirúvica en Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, otros estudios han demostrado que la producción de glicerina podría incrementarse en presencia de bloqueadores metabólicos (Taherzadeh et al, 1999), lo cual indicaría otras fuentes de poder reductor en forma de NADH para la enzima GPDH. Se ha sugerido como fuente alternativa al Ciclo de Krebs (Modig et al, 2002), principalmente en las etapas iniciales del proceso fermentativo (Horváth et al, 2003), incrementándose además la producción de otros intermediarios metabólicos como el ácido succínico (Taherzadeh et al, 1999), de especial interés en cuanto a la mejora de la acidez (Coulter et al, 2004) y del perfil aromático del vino (Hidalgo, 2010). 164 IV. Resultados y discusión La Figura IV.37 muestra la producción de glicerina en el mosto con 10 % de GAP, obteniéndose una mayor producción de glicerina en presencia de p-benzoquinona y cobre, aunque el análisis estadístico mostró diferencias significativas solamente con el cobre a 10 mg/l, con un incremento de 0,48 g/l con respecto al control. Por el contrario, en presencia de ácido trans-cinámico a 50 y 100 mg/l disminuye la producción de glicerina en 0,62 y 0,67 g/l respectivamente, diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (Apéndice H1). Los otros bloqueadores no muestran un efecto significativo sobre la producción de glicerina. 5 Glicerina (g/l) 4 3 2 1 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Cn50 Cn100 10 % GAP Figura IV.37. Producción de glicerina por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En el medio con 14,1 % de GAP, el efecto es más variable en función del bloqueador utilizado como se puede apreciar en la Figura IV.38. El furfural parece no afectar la producción de glicerina, resultados que concuerdan con los obtenidos con la levadura 7VA en un ensayo anterior (Tabla IV.12). Concentraciones de glicerina que no muestran diferencias significativas con respecto al control, al igual que en presencia de glicolaldehído, cobre y p-benzoquinona a la dosis de 50 mg/l. A la dosis de 20 mg/l de p-benzoquinona, la producción de glicerina incrementa en 0,54 g/l, producción que es significativamente diferente al control (Apéndice H2). 165 IV. Resultados y discusión En el caso de la o-vainillina a las dosis de 50 y 100 mg/l, se reduce la producción de glicerina en 0,71 y 0,57 g/l respectivamente con respecto al control, efecto que no se observó en el ensayo de la sección IV.1.2.3 (Tabla IV.16). Igualmente ocurre con el ácido trans-cinámico, el cual a las dosis de 50 y 100 mg/l, disminuye la producción de glicerina en 0,77 y 1,23 g/l respectivamente, producciones que son significativamente diferentes al control (Apéndice H2), lo cual concuerda con los resultados obtenidos con el medio a 10 % de GAP del ensayo anterior (Figura IV.37). 8 Glicerina (g/l) 7 6 5 4 3 2 1 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Cn50 Cn100 14,3 % GAP Figura IV.38. Producción de glicerina por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Comparando los resultados obtenidos para ambas concentraciones de azúcar en el mosto, se podría concluir que el ácido trans-cinámico además de inhibir la producción de etanol por la levadura 7VA, puede reducir la producción de glicerina, mientras que la p-benzoquinona y el cobre podrían incrementar su producción. Los demás bloqueadores parecen no tener un efecto considerable en su producción, al mostrar comportamientos diferentes en función del medio fermentativo. 166 IV. Resultados y discusión IV.2.3. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en vino tinto Durante la fermentación alcohólica se genera una amplia variedad de compuestos volátiles que tienen un importante impacto sensorial en el vino. Desde un punto de vista cuantitativo estos compuestos son los más abundantes en la fracción aromática y su presencia en determinadas concentraciones podría indicar algún tipo de desviación como consecuencia del efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos. IV.2.3.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles de origen fermentativo en vinos tintos producidos a partir de mosto de uva variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP utilizando la levadura 7VA. IV.2.3.1.1. Producción de acetaldehído Se considera importante la producción de acetaldehído por ser el metabolito precursor en la síntesis de etanol y su presencia en concentraciones no habituales puede indicar el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la levadura, especialmente porque algunos de estos bloqueadores actúan directamente sobre la enzima ADH. La Figura IV.39 muestra la producción de acetaldehído, la cual incrementa en presencia de furfural y o-vainillina a medida que aumentan las dosis de estos bloqueadores, aunque dicha producción es significativamente superior solamente con la o-vainillina a 167 IV. Resultados y discusión 100 mg/l. Con los demás bloqueadores no se obtienen producciones de acetaldehído que sean significativamente diferentes al control (Apéndice I.1). En el caso del furfural el incremento en la producción de acetaldehído muestra un comportamiento similar al obtenido en el ensayo de la sección IV.1.1.2 (Tabla IV.3) con la misma cepa de levadura. Resultados similares a los obtenidos en trabajos previos (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002), donde la acumulación del acetaldehído estaría relacionada a la inhibición de la enzima ADH. 60 Acetaldehído (mg/l) 50 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.39. Producción de acetaldehído por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.2.3.1.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas La Tabla IV.33 muestra la producción de acetaldehído, ésteres y cetonas y la Tabla IV.34 muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de bloqueadores metabólicos, observándose variabilidad en los resultados, aunque todas las concentraciones obtenidas se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación. 168 IV. Resultados y discusión Tabla IV.33. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 35,62 ± 2,65 8,57 ± 1,21 9,95 ± 0,44 Acetato de etilo 94,61 ± 5,22 Furfural 50 38,61 ± 3,20 7,67 ± 2,18 9,55 ± 0,98 97,84 ± 8,75 6,81 ± 0,55 5,80 ± 1,24 8,78 ± 1,26 100 42,64 ± 2,61 8,28 ± 1,60 10,31 ± 1,48 93,20 ± 6,27 8,39 ± 1,54 5,17 ± 0,38 8,72 ± 0,38 50 42,96 ± 5,66 10,07 ± 2,05 9,58 ± 1,36 99,31 ± 10,83 4,86 ± 4,24 6,03 ± 1,40 8,67 ± 1,19 100 50,74 ± 5,52 11,18 ± 0,70 10,36 ± 0,90 113,75 ± 21,01 7,59 ± 0,23 6,44 ± 1,36 10,21 ± 0,47 100 38,85 ± 0,34 10,07 ± 0,94 8,78 ± 1,77 85,12 ± 4,31 4,73 ± 4,10 5,52 ± 1,02 9,14 ± 0,87 200 36,26 ± 2,61 9,13 ± 0,76 8,65 ± 0,15 93,54 ± 3,29 5,57 ± 3,71 4,91 ± 0,20 9,56 ± 0,40 20 36,51 ± 3,32 8,81 ± 0,94 9,00 ± 0,45 92,98 ± 3,11 7,06 ± 0,14 5,13 ± 0,41 9,13 ± 0,36 50 33,59 ± 1,46 8,68 ± 1,14 8,47 ± 0,49 88,81 ± 10,26 7,24 ± 0,22 5,18 ± 0,60 9,58 ± 0,11 5 32,69 ± 1,64 8,30 ± 1,67 9,35 ± 2,07 91,63 ± 8,05 12,62 ± 5,00 6,40 ± 1,56 8,65 ± 0,79 10 40,89 ± 4,92 9,05 ± 2,37 6,65 ± 1,88 107,39 ± 10,39 5,24 ± 3,54 7,43 ± 1,17 9,02 ± 0,22 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Acetaldehído Acetoina Diacetilo 169 Lactato de etilo 4,82 ± 4,18 Acetato de isoamilo 6,89 ± 1,03 Acetato de 2-feniletilo 8,29 ± 0,56 IV. Resultados y discusión Tabla IV.34. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 30,61 ± 4,31 35,79 ± 1,49 17,70 ± 1,01 4,43 ± 0,10 2-Metil-1butanol 148,23 ± 9,19 Furfural 50 27,84 ± 0,82 38,80 ± 1,08 17,26 ± 0,88 4,40 ± 0,21 151,54 ± 5,24 34,41 ± 5,21 100 27,67 ± 0,87 41,50 ± 1,28 16,31 ± 1,41 4,51 ± 0,05 149,28 ± 11,36 33,86 ± 6,01 1313,43 ± 45,61 5,31 ± 0,58 37,65 ± 3,63 50 28,27 ± 2,10 39,49 ± 3,81 17,65 ± 1,72 4,84 ± 0,25 144,95 ± 15,06 33,61 ± 3,71 1375,63 ± 164,11 5,13 ± 0,92 45,31 ± 4,49 100 29,86 ± 2,01 48,95 ± 3,20 20,47 ± 1,69 5,06 ± 0,13 151,41 ± 16,62 33,83 ± 4,10 1652,01 ± 89,05 5,56 ± 0,30 44,13 ± 4,28 100 28,53 ± 1,01 38,11 ± 2,11 17,99 ± 0,96 4,28 ± 0,15 149,91 ± 10,35 35,14 ± 4,92 1218,14 ± 135,14 5,12 ± 0,15 39,38 ± 2,77 200 28,85 ± 0,89 38,75 ± 1,62 18,18 ± 1,00 4,26 ± 0,04 151,69 ± 10,49 35,72 ± 3,81 1304,12 ± 60,64 5,51 ± 0,30 41,23 ± 1,50 20 27,68 ± 3,08 38,91 ± 1,93 18,23 ± 1,36 4,24 ± 0,05 154,93 ± 11,22 35,45 ± 5,84 1220,39 ± 68,42 5,34 ± 0,58 42,21 ± 0,38 50 28,96 ± 0,39 40,70 ± 0,46 19,10 ± 0,69 4,31 ± 0,08 162,76 ± 7,91 37,87 ± 4,34 1314,13 ± 35,06 4,72 ± 0,84 46,51 ± 3,53 5 28,56 ± 1,72 45,12 ± 2,53 16,94 ± 0,67 4,29 ± 0,13 150,20 ± 5,39 32,87 ± 4,55 1292,56 ± 112,36 5,31 ± 0,37 40,60 ± 4,96 10 27,70 ± 1,32 57,22 ± 4,81 18,46 ± 0,97 4,31 ± 0,08 156,15 ± 9,86 31,50 ± 4,50 1712,52 ± 131,46 4,94 ± 0,27 40,32 ± 4,34 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Metanol 1-Propanol Isobutanol 1-Butanol 170 3-Metil-1butanol 35,74 ± 2,97 2,3-Butanodiol Hexanol 2-Feniletanol 1060,34 ± 60,55 6,63 ± 0,98 40,45 ± 3,13 1154,94 ± 45,39 5,85 ± 0,16 37,51 ± 1,98 IV. Resultados y discusión Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han representado gráficamente los compuestos en cuya producción existen diferencias significativas con respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado mediante el Test de Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.1). Dichas variaciones han sido más notables en el diacetilo, lactato de etilo, 1-propanol y 2,3-butanodiol. La Figura IV.40 muestra la producción de diacetilo, la cual es menor en presencia de 10 mg/l de cobre, mostrando una diferencia significativa con respecto al control (Apéndice I.1), mientras que los demás bloqueadores al parecer no afectan su producción. 12 Diacetilo (mg/l) 10 8 6 4 2 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.40. Producción de diacetilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Con respecto al lactato de etilo (Figura IV.41) la única diferencia significativa se observa en presencia de 5 mg/l de cobre, el cual incrementa su producción. Los demás bloqueadores al parecer no afectan su producción (Apéndice I.1). 171 IV. Resultados y discusión 18 Lactato de etilo (mg/l) 15 12 9 6 3 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.41. Producción de lactato de etilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.42 muestra la producción de 1-propanol, que incrementa a medida que la dosis de los bloqueadores aumenta, siendo mayor el incremento en presencia de ambas dosis de cobre y de furfural y o-vainillina, estos últimos a 100 mg/l, con producciones significativamente diferentes al control (Apéndice I.1). 1-Propanol (mg/l) 80 60 40 20 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.42. Producción de 1-propanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.43 muestra la producción de 2,3-butanodiol, compuesto que puede contribuir al equilibrio aromático del vino, con un umbral de percepción en torno a los 172 IV. Resultados y discusión 120 mg/l (Gomez et al, 2007). En base a los resultados obtenidos, en presencia de todos los bloqueadores metabólicos la concentración de este polialcohol es superior a su umbral de percepción, mostrando un incremento en su producción en presencia de ovainillina y cobre, así como a las dosis más altas de furfural, glicolaldehído y pbenzoquinona, resultados que muestran diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (Apéndice I.1). El 2,3-butanodiol es sintetizado a partir de la reducción de la acetoína, la cual tiene como una de sus fuentes la reducción del diacetilo (Chuang y Collins, 1968), de modo que una disminución en la producción del diacetilo, podría traducirse en un incremento del 2,3-butanodiol, lo cual se observa en presencia de 10 mg/l de cobre (Figura IV.40), al mismo tiempo que el 2,3-butanodiol incrementa considerablemente su producción (Figura IV.43). Con los demás bloqueadores no se observa dicho comportamiento. 2,3-Butanodiol (mg/l) 2000 1600 1200 800 400 0 Control F50 F100 V50 V100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.43. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). En base a los resultados obtenidos, se observa que el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos es variable en 173 IV. Resultados y discusión función de su naturaleza química, lo cual se refleja en el análisis discriminante mostrado en la Figura IV.44, donde el cobre y la o-vainillina afectan considerablemente el perfil volátil del vino, diferenciándose del control y de los demás bloqueadores. Figura IV.44. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP a diferentes dosis de furfural (F), o-vainillina (V), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q) y cobre (C). Media ± desviación estándar (n = 4). 174 IV. Resultados y discusión IV.2.3.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos en un vino tinto producido con la levadura 7VA a partir de mosto de uva variedad Tempranillo con 10 % de GAP. IV.2.3.2.1. Producción de acetaldehído La Figura IV.45 muestra la producción de acetaldehído, la cual es variable en función de la naturaleza química de cada bloqueador. En presencia de o-vainillina y glicolaldehído, la producción de acetaldehído disminuye a medida que se incrementan las dosis, al igual que con la p-benzoquinona a 50 mg/l, mientras que con el furfural, el ácido transcinámico y el cobre, no se puede establecer una correlación lineal entre la producción de acetaldehído y las dosis de bloqueador. Resultados que difieren de los obtenidos en el ensayo con mosto a 14,3 % de GAP (Figura IV.39), lo que indica que el efecto de los bloqueadores estaría influenciado por la concentración de azúcares en el mosto, además de otros factores como la composición propia del mosto, pues son de diferentes variedades de uva. Con respecto al cobre, Pons y Chanel (1991) evaluaron su efecto sobre la fermentación alcohólica en un mosto tinto con similar GAP (10 % v/v), observando que en presencia de dosis altas (95 mg/l de cobre), se incrementa la producción de acetaldehído, alcanzando su máxima acumulación al finalizar la fermentación. Mientras que a 175 IV. Resultados y discusión menores dosis, la máxima producción ocurre en las primeras etapas, y a medida que transcurre el proceso fermentativo es reducido a etanol. Ello indicaría que altas concentraciones de cobre afectan entre otras enzimas a la ADH, como se ha demostrado en estudios previos (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004), principalmente mediante su oxidación. 140 Acetaldehído (mg/l) 120 100 80 60 40 20 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.45. Producción de acetaldehído (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). IV.2.3.2.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas La Tabla IV.35 muestra la producción de acetaldehído, cetonas y ésteres, y la Tabla IV.36 muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de los bloqueadores metabólicos, observándose variabilidad en los resultados, aunque todas las concentraciones obtenidas se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación. 176 IV. Resultados y discusión Tabla IV.35. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 92,83 ± 11,95 12,19 ± 1,05 2,42 ± 0,41 Acetato de etilo 52,03 ± 10,33 Furfural 50 70,12 ± 8,81 11,64 ± 0,52 2,23 ± 0,27 52,38 ± 5,81 6,47 ± 0,42 2,64 ± 0,24 7,35 ± 0,21 100 89,84 ± 14,73 12,26 ± 1,72 2,66 ± 0,17 52,97 ± 11,31 6,38 ± 0,46 2,66 ± 0,25 7,63 ± 0,08 50 75,74 ± 16,24 11,01 ± 0,21 2,07 ± 0,03 64,35 ± 4,57 6,07 ± 0,13 2,72 ± 0,12 7,00 ± 0,09 100 62,17 ± 13,74 10,67 ± 1,13 1,99 ± 0,21 49,65 ± 8,16 5,96 ± 0,07 2,47 ± 0,26 7,12 ± 0,15 50 76,90 ± 13,88 10,67 ± 0,25 1,94 ± 0,10 51,21 ± 7,43 6,15 ± 0,29 2,48 ± 0,27 6,80 ± 0,11 100 94,14 ± 11,19 10,36 ± 1,04 2,11 ± 0,21 37,48 ± 4,93 6,02 ± 0,06 2,35 ± 0,16 6,87 ± 0,14 100 88,26 ± 11,48 10,11 ± 1,56 2,46 ± 0,38 47,27 ± 8,21 7,53 ± 0,81 2,76 ± 0,31 7,65 ± 0,25 200 57,78 ± 9,27 11,35 ± 0,19 2,15 ± 0,23 39,11 ± 2,32 6,01 ± 0,04 2,38 ± 0,05 7,12 ± 0,18 20 99,89 ± 8,81 12,18 ± 0,54 2,10 ± 0,05 31,78 ± 3,81 5,99 ± 0,12 2,25 ± 0,13 7,04 ± 0,10 50 71,04 ± 17,16 11,02 ± 1,10 2,13 ± 0,08 40,48 ± 4,71 6,04 ± 0,15 2,42 ± 0,14 7,03 ± 0,14 5 101,88 ± 29,58 12,87 ± 1,67 2,35 ± 0,33 46,57 ± 5,75 6,11 ± 0,11 2,54 ± 0,28 7,21 ± 0,01 10 88,10 ± 30,13 13,17 ± 2,45 2,20 ± 0,21 44,93 ± 3,30 6,08 ± 0,04 2,45 ± 0,13 7,42 ± 0,05 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Ácido trans-cinámico Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Acetaldehído Acetoína Diacetilo 177 Lactato de etilo 6,03 ± 0,07 Acetato de isoamilo 2,59 ± 0,39 Acetato de 2-feniletilo 7,10 ± 0,21 IV. Resultados y discusión Tabla IV.36. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 4,26 ± 0,18 28,70 ± 0,24 30,67 ± 1,71 4,18 ± 0,05 2-Metil-1butanol 109,98 ± 2,84 Furfural 50 4,12 ± 0,11 27,42 ± 2,58 26,25 ± 2,41 4,21 ± 0,05 101,98 ± 8,03 26,75 ± 2,21 100 4,53 ± 0,20 32,37 ± 1,15 34,28 ± 4,04 4,31 ± 0,19 127,58 ± 5,66 33,19 ± 1,56 512,58 ± 8,83 3,89 ± 0,10 25,77 ± 1,02 50 4,75 ± 0,35 35,42 ± 2,56 14,71 ± 2,06 4,27 ± 0,12 81,82 ± 8,49 19,87 ± 2,06 564,41 ± 45,36 3,98 ± 0,05 21,81 ± 1,77 100 4,61 ± 0,19 31,27 ± 0,96 18,43 ± 3,18 4,09 ± 0,10 82,32 ± 7,57 20,86 ± 2,34 497,60 ± 22,98 4,00 ± 0,16 23,73 ± 1,11 50 4,69 ± 0,16 38,29 ± 0,49 17,59 ± 1,61 3,98 ± 0,04 79,05 ± 0,96 17,94 ± 1,11 447,87 ± 29,86 4,04 ± 0,03 17,82 ± 0,44 100 4,83 ± 0,17 35,68 ± 4,48 16,63 ± 3,94 3,96 ± 0,08 73,30 ± 4,99 18,65 ± 3,06 645,75 ± 41,59 3,78 ± 0,11 18,54 ± 0,64 100 4,62 ± 0,41 28,70 ± 4,47 36,75 ± 8,21 4,09 ± 0,13 122,98 ± 20,75 31,66 ± 4,34 470,08 ± 56,79 4,02 ± 0,10 27,80 ± 5,02 200 4,16 ± 0,04 23,12 ± 0,43 25,66 ± 1,16 3,98 ± 0,06 88,86 ± 4,66 24,11 ± 1,28 422,32 ± 10,27 3,94 ± 0,13 20,43 ± 0,69 20 4,32 ± 0,20 21,84 ± 0,56 29,65 ± 3,47 4,20 ± 0,05 102,93 ± 4,59 26,05 ± 1,79 393,55 ± 11,93 3,92 ± 0,09 24,58 ± 1,22 50 4,70 ± 0,20 24,22 ± 2,47 28,06 ± 6,35 4,19 ± 0,08 100,49 ± 15,63 26,03 ± 3,46 444,40 ± 40,52 3,97 ± 0,09 27,91 ± 5,05 5 4,69 ± 0,21 29,75 ± 0,77 29,85 ± 2,89 4,30 ± 0,10 116,48 ± 3,51 28,27 ± 0,36 475,95 ± 19,12 3,96 ± 0,14 28,22 ± 1,32 10 5,05 ± 0,19 32,65 ± 1,54 25,64 ± 2,82 4,12 ± 0,07 102,90 ± 9,88 25,68 ± 1,65 518,43 ± 17,24 3,89 ± 0,16 25,54 ± 4,32 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Ácido trans-cinámico Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Metanol 1-Propanol Isobutanol 1-Butanol 178 3-Metil-1butanol 29,52 ± 0,75 2,3Butanodiol 454,88 ± 19,01 Hexanol 2-Feniletanol 4,25 ± 0,17 23,72 ± 1,18 457,91 ± 30,93 3,97 ± 0,16 21,55 ± 1,63 IV. Resultados y discusión Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han representado gráficamente los compuestos en cuya producción existen diferencias significativas con respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado mediante el Test de Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.2). Dichas variaciones han sido más notables en el acetato de etilo, 1-propanol, isobutanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol y 2,3-butanodiol. La Figura IV.46 muestra la producción de acetato de etilo, la cual no se ve afectada en presencia de furfural, resultados similares a los obtenidos con la levadura 7VA en el ensayo de la sección IV.1.1.2. (Tabla IV.4), al igual que con el cobre, que a pesar de presentar concentraciones más bajas de acetato de etilo, no muestran una diferencia estadística significativa con respecto al control (Apéndice I.2). Con respecto a la presencia de cobre en el medio fermentativo, en el estudio de Pons y Chanel (1991) lograron reducir la producción de acetato de etilo hasta en un 94% a concentraciones de 95 mg/l de cobre, a 25 mg/l la producción fue reducida en un 30%, mientras que a 14 mg/l de cobre no se inhibió la síntesis del acetato de etilo. En presencia de glicolaldehído y ácido trans-cinámico la producción de acetato de etilo disminuye a medida que se incrementan la dosis de estos bloqueadores, aunque dichas diferencias no son estadísticamente significativas con respecto al control. Con el ácido trans-cinámico, se obtuvieron resultados similares al ensayo de la sección IV.1.3.2 a bajas concentraciones de azúcar en el mosto (Tabla IV.20), logrando la mayor reducción en la producción de acetato de etilo a la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico, al igual que en el tratamiento con 20 mg/l de p-benzoquinona. Por el contrario, en 179 IV. Resultados y discusión presencia de 50 mg/l de o-vainillina la producción de acetato de etilo incrementa con respecto al control. Acetato de etilo (mg/l) 80 60 40 20 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.46. Producción de acetato de etilo por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.47 muestra la producción de 1-propanol e isobutanol (2-metil-1-propanol). El 1-propanol incrementa su producción en presencia de ácido trans-cinámico, resultados similares a los obtenidos con la misma cepa de levadura en el ensayo de la sección IV.1.3.2 en el medio con bajo contenido de azúcares (Tabla IV.20). Del mismo modo que se obtuvo un incremento en presencia de o-vainillina, sobre todo a la dosis de 50 mg/l, y en menor medida con el furfural a 100 mg/l y el cobre a 10 mg/l. Por el contrario, el glicolaldehído a 200 mg/l y la p-benzoquinona a 20 mg/l disminuyen la producción de éste alcohol superior. Los demás bloqueadores parecen no alterar considerablemente la producción del 1-propanol, tal como lo muestra el análisis estadístico (Apéndice I.2). Resultados que en el caso del furfural, o-vainillina y cobre concuerdan con el ensayo anterior (Figura IV.42), en el cual a una mayor concentración de azúcares en el mosto se observó un incremento en la producción de 1-propanol. 180 IV. Resultados y discusión En lo que respecta a la producción de isobutanol, en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico disminuyó considerablemente su producción con respecto al control, mientras que con los demás bloqueadores no se obtuvo una variación significativa (Apéndice I.2). Con respecto al cobre, se ha reportado que altas dosis (95 mg/l) pueden inhibir totalmente la síntesis de isobutanol (Pons y Chanel, 1991). 50 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 Propanol G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Isobutanol Figura IV.47. Producción de 1-propanol e isobutanol (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.48 muestra la producción de 2-metil-1-butanol (alcohol amílico), el cual disminuye considerablemente en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico, mientras que con los demás bloqueadores no se aprecia una diferencia significativa en su producción con respecto al control (Apéndice I.2). 181 IV. Resultados y discusión 2-Metil-1-butanol (mg/l) 160 120 80 40 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.48. Producción de 2-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.49 muestra la producción de 3-metil-1-butanol (alcohol isoamílico), el cual disminuye considerablemente en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico. Con los demás bloqueadores la producción no es significativamente diferente al control (Apéndice I.2). Con respecto al cobre, se ha reportado que en su presencia Saccharomyces cerevisiae disminuye la producción del 3-metil-1-butanol (Pons y Chanel, 1991), llegando a ser nula a 95 mg/l de cobre, mientras que a 14 mg/l puede disminuirla hasta en 23%, lo cual podría estar relacionado con la inhibición del cobre sobre la síntesis del acetil-CoA (Bramlett et al, 2003), involucrado directamente en la síntesis del alcohol isoamílico (Web y Ingraham, 1963; Panda, 2011). Lo cual no se observa en los resultados del presente ensayo, pues la dosis más próxima, 10 mg/l de Cu, no presenta ningún efecto. Otro aspecto a destacar es que las concentraciones en las que se encuentra este alcohol en presencia de casi todos los bloqueadores, están en torno a su umbral de percepción, 182 IV. Resultados y discusión 30 mg/l (Ehsani et al, 2009), con lo cual su presencia no alteraría el perfil aromático, ya que a mayores concentraciones puede aportar aroma a queso. 3-Metil-1-butanol (mg/l) 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.49. Producción de 3-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.50 muestra la producción de 2,3-butanodiol, el cual incrementa en presencia de furfural, o-vainillina, cobre y ácido trans-cinámico. Siendo más notable el incremento con la o-vainillina a 50 mg/l y con el ácido trans-cinámico a 100 mg/l, con producciones que son significativamente mayores al control (Apéndice I.2). En el caso del ácido trans-cinámico, se observa un comportamiento similar en su efecto al obtenido en el ensayo de la sección IV.1.3.2 (Tablas IV.20 y IV.21), lo cual puede ser explicado en base a las funciones que cumpliría la síntesis de este polialcohol en la regulación de la acidez y del equilibrio NADH/NAD+ en el interior celular (Nakashimada et al, 2000; Celińska y Grajek, 2009), como se ha descrito anteriormente. Por el contrario, la producción de 2,3-butanodiol disminuye con 20 mg/l de pbenzoquinona y con 200 mg/l de glicolaldehído, aunque el análisis estadístico no muestra diferencias significativas con respecto al control (Apéndice I.2). 183 IV. Resultados y discusión 2,3-Butanodiol (mg/l) 700 600 500 400 300 200 100 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.50. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Tal como se ha descrito en los apartados anteriores el efecto de los bloqueadores metabólicos en la fermentación alcohólica es variable en función de la naturaleza química de cada bloqueador, lo cual puede comprobarse con el análisis discriminante mostrado en la Figura IV.51 para todos los compuestos volátiles producidos, donde se observa claramente como algunos bloqueadores pueden afectar considerablemente la producción de los compuestos volátiles por la levadura, diferenciándose del control y de otros bloqueadores, como es el caso del ácido trans-cinámico a ambas dosis utilizadas, al igual que la o-vainillina y el cobre. En el caso de la o-vainillina y el cobre, los resultados concuerdan con los obtenidos en el ensayo anterior con el mosto con mayor contenido de azúcares (Figura IV.44). Los demás bloqueadores al parecer no muestran un efecto considerable sobre el perfil de compuestos volátiles a esta concentración de azúcares en el medio. 184 IV. Resultados y discusión Figura IV.51. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP a diferentes dosis de furfural (F), o-vainillina (V), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q), cobre (C) y ácido trans-cinámico (Cn). Media ± desviación estándar (n = 4). 185 IV. Resultados y discusión 186 IV. Resultados y discusión IV.2.3.3 Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos en vinos tintos producidos a partir de mosto de uva variedad Tempranillo con 14,1 % v/v de GAP utilizando la levadura 7VA. IV.2.3.3.1. Producción de acetaldehído La Figura IV.52 muestra la producción de acetaldehído, la cual disminuye en presencia de todos los bloqueadores metabólicos, aunque la diferencia solamente es significativa en presencia de 100 mg/l de o-vainillina y con ambas dosis de ácido trans-cinámico, tal como lo muestra el análisis estadístico (Apéndice I.3). 160 Acetaldehído (mg/l) 140 120 100 80 60 40 20 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.52. Producción de acetaldehído por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 187 IV. Resultados y discusión En el caso de la o-vainillina estos resultados concuerdan con los obtenidos en el ensayo con el mosto de la misma variedad de uva a menor concentración de azúcares (Figura IV.45), aunque difieren de los resultados con el mosto de variedad Syrah a similar concentración de azúcares, pues en dicho ensayo (Figura IV.39) la producción de acetaldehído incrementó en presencia de 100 mg/l de o-vainillina. IV.2.3.3.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas La Tabla IV.37 muestra la producción de acetaldehído, ésteres y cetonas y la Tabla IV.38 muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de los bloqueadores, observándose variabilidad en las concentraciones obtenidas, aunque todas se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación. 188 IV. Resultados y discusión Tabla IV.37. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 136,35 ± 2,62 13,92 ± 0,51 2,31 ± 0,17 Acetato de etilo 33,79 ± 2,29 Furfural 50 125,75 ± 16,28 13,27 ± 0,51 2,55 ± 0,36 33,14 ± 0,74 5,95 ± 0,02 2,91 ± 0,40 7,04 ± 0,05 100 120,54 ± 4,16 13,12 ± 0,29 2,63 ± 0,14 32,68 ± 0,32 5,91 ± 0,01 2,54 ± 0,26 7,17 ± 0,10 50 112,68 ± 14,36 12,16 ± 0,23 2,47 ± 0,13 51,45 ± 0,84 6,09 ± 0,04 2,87 ± 0,31 6,94 ± 0,13 100 77,36 ± 2,91 12,68 ± 1,87 2,53 ± 0,24 65,31 ± 1,80 5,99 ± 0,08 3,66 ± 0,34 6,72 ± 0,37 50 68,28 ± 7,31 11,44 ± 0,57 2,41 ± 0,34 64,96 ± 1,57 5,95 ± 0,02 3,12 ± 0,10 6,29 ± 0,18 100 39,47 ± 9,39 11,88 ± 0,46 2,40 ± 0,15 58,06 ± 2,06 6,06 ± 0,14 3,66 ± 0,08 6,28 ± 0,12 100 115,12 ± 9,31 12,37 ± 0,19 2,54 ± 0,36 33,27 ± 2,87 5,99 ± 0,07 2,67 ± 0,11 6,66 ± 0,17 200 119,63 ± 5,71 12,58 ± 0,17 2,33 ± 0,23 33,98 ± 1,28 6,06 ± 0,05 2,66 ± 0,16 6,98 ± 0,14 20 116,15 ± 16,19 11,88 ± 0,27 2,15 ± 0,16 33,92 ± 3,05 5,96 ± 0,06 2,75 ± 0,40 7,14 ± 0,15 50 113,17 ± 5,75 12,48 ± 0,35 2,23 ± 0,18 33,07 ± 0,73 5,97 ± 0,07 2,67 ± 0,29 7,04 ± 0,05 5 115,79 ± 24,66 12,29 ± 0,11 2,32 ± 0,22 34,47 ± 1,63 6,05 ± 0,03 2,76 ± 0,28 7,09 ± 0,11 10 127,45 ± 12,34 12,72 ± 0,40 2,22 ± 0,15 33,85 ± 2,16 5,92 ± 0,02 2,50 ± 0,15 6,83 ± 0,15 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Ácido trans-cinámico Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Acetaldehído Acetoina Diacetilo 189 Lactato de etilo 5,95 ± 0,04 Acetato de isoamilo 2,73 ± 0,34 Acetato de 2feniletilo 6,82 ± 0,69 IV. Resultados y discusión Tabla IV.38. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Control 0 7,61 ± 0,31 24,87 ± 0,86 27,92 ± 1,99 4,17 ± 0,05 2-Metil-1butanol 138,79 ± 1,80 5,19 ± 0,40 52,48 ± 3,46 Furfural 50 7,64 ± 0,49 26,61 ± 0,57 29,13 ± 0,56 4,25 ± 0,10 139,21 ± 3,04 43,29 ± 1,53 839,20 ± 28,71 4,90 ± 0,25 47,89 ± 1,63 100 7,93 ± 0,30 27,56 ± 0,40 29,25 ± 0,52 4,20 ± 0,09 140,55 ± 2,50 44,29 ± 0,93 878,77 ± 10,25 5,17 ± 0,18 49,14 ± 1,63 50 7,52 ± 0,27 27,86 ± 0,94 14,55 ± 0,41 4,83 ± 0,11 118,52 ± 2,72 28,20 ± 0,49 1034,05 ± 31,48 5,33 ± 0,32 40,45 ± 0,68 100 7,40 ± 0,46 34,96 ± 0,51 16,83 ± 0,31 4,45 ± 0,13 132,24 ± 3,49 29,21 ± 1,20 1226,43 ± 30,34 5,18 ± 0,10 33,20 ± 1,72 50 7,76 ± 0,33 41,42 ± 2,29 13,17 ± 0,51 4,38 ± 0,10 121,10 ± 3,41 23,73 ± 2,41 1165,03 ± 90,77 4,96 ± 0,21 24,26 ± 1,56 100 7,74 ± 0,45 47,26 ± 0,92 11,94 ± 0,15 4,78 ± 0,17 129,53 ± 3,22 21,66 ± 0,99 1291,14 ± 48,01 4,97 ± 0,24 22,11 ± 0,89 100 7,18 ± 1,10 25,97 ± 0,22 29,85 ± 2,31 4,22 ± 0,06 142,77 ± 2,05 45,51 ± 0,84 853,23 ± 35,07 5,44 ± 0,12 51,28 ± 2,94 200 7,04 ± 0,85 25,67 ± 0,89 30,03 ± 2,00 4,19 ± 0,03 144,10 ± 4,89 45,07 ± 1,97 852,17 ± 24,74 5,39 ± 0,07 51,27 ± 2,82 20 6,29 ± 0,27 23,90 ± 1,56 27,67 ± 3,83 4,27 ± 0,07 148,31 ± 2,69 45,11 ± 3,29 800,00 ± 31,95 5,06 ± 0,19 58,66 ± 5,43 50 6,92 ± 0,30 25,36 ± 0,70 27,77 ± 0,67 4,22 ± 0,04 140,76 ± 3,82 44,17 ± 1,73 889,70 ± 14,15 5,04 ± 0,22 58,92 ± 1,83 5 7,24 ± 0,27 26,52 ± 0,55 25,84 ± 1,05 4,19 ± 0,08 137,29 ± 5,17 41,48 ± 2,22 906,50 ± 35,10 4,92 ± 0,14 50,82 ± 4,64 10 6,83 ± 0,33 27,80 ± 0,37 26,15 ± 0,68 4,24 ± 0,08 140,01 ± 5,50 41,53 ± 2,20 908,61 ± 45,56 5,03 ± 0,29 48,62 ± 2,29 Bloqueador (mg/l) o-Vainillina Ácido trans-cinámico Glicolaldehído p-Benzoquinona Cobre Metanol 1-Propanol Isobutanol 1-Butanol 190 3-Metil-1butanol 43,05 ± 1,60 2,3Butanodiol 819,37 ± 37,91 Hexanol 2-Feniletanol IV. Resultados y discusión Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han representado los compuestos en cuya producción existen diferencias significativas con respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado mediante el Test de Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.3). Dichas variaciones han sido más notables en la acetoína, acetato de etilo, acetato de isoamilo, 1-propanol, 1-butanol, isobutanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol, 2-feniletanol y 2,3-butanodiol. La Figura IV.53 muestra la producción de acetoína, la cual disminuye con respecto al control en presencia de ambas dosis de ácido trans-cinámico, así como con 50 mg/l de o-vainillina, 20 mg/l de p-benzoquinona y 5 mg/l de cobre. Los demás bloqueadores al parecer no afectan la producción de esta cetona (Apéndice I.3). Acetoína (mg/l) 15 12 9 6 3 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.53. Producción de acetoína (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.54 muestra la producción de acetato de etilo, la cual incrementa en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico. Con los demás bloqueadores no se observa ningún efecto significativo en su producción (Apéndice I.3). 191 IV. Resultados y discusión En el caso de la o-vainillina a la dosis de 50 mg/l, los resultados concuerdan con los obtenidos en el ensayo con el mosto de la misma variedad de uva con menor contenido de azúcares (Figura IV.46), en el cual se observó un incremento en la producción de acetato de etilo, mientras que con el ácido trans-cinámico se obtuvieron resultados opuestos a dicho ensayo, lo que indicaría que su efecto sobre la producción de este éster es afectado por la concentración de azúcares en el mosto. Acetato de etilo (mg/l) 80 60 40 20 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.54. Producción de acetato de etilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.55 muestra la producción de acetato de isoamilo, la cual incrementa con las dosis más altas de o-vainillina y ácido trans-cinámico (100 mg/l), mientras que los demás bloqueadores no afectan su producción (Apéndice I.3). El acetato de isoamilo es un éster importante en el vino dada su contribución a la fracción volátil, aportando aroma a plátano, con un umbral de percepción de 30 μg/l (Ferreira et al, 2002), de modo que un incremento en su producción, dentro de los rangos habituales en vinificación, podría contribuir a mejorar el perfil aromático del vino. 192 IV. Resultados y discusión Acetato de isoamilo (mg/l) 4 3 2 1 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.55. Producción de acetato de isoamilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.56 muestra la producción de 1-propanol e isobutanol (2-metil-1-propanol). El 1-propanol incrementa su producción en presencia de ácido trans-cinámico, resultados que corroboran los resultados obtenidos con el mosto de la misma variedad de uva y con menor contenido de azúcares (Figura IV.47). Del mismo modo la producción de 1-propanol incrementó en presencia de 100 mg/l de furfural, 10 mg/l de cobre y con ambas dosis de o-vainillina, siendo mayor el incremento a la dosis de 100 mg/l, al igual que en el mosto de Syrah con similar contenido de azúcares (Figura IV.42). Los demás bloqueadores no afectan la producción del 1-propanol (Apéndice I.3). Con respecto al isobutanol, en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico disminuyó considerablemente su producción con respecto al control, al igual que en el caso del mosto con menor contenido de azúcares (Figura IV.47), mientras que con los demás bloqueadores metabólicos no se obtuvo una variación significativa en su producción (Apéndice I.2). 193 IV. Resultados y discusión 50 Propanol Isobutanol 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.56. Producción de 1-propanol e isobutanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.57 muestra la producción de 1-butanol, el cual incrementó con respecto al control en presencia de ambas dosis de o-vainillina y con 100 mg/l de ácido transcinámico. Los demás bloqueadores al parecer no afectan la producción de este alcohol superior, cuyas concentraciones se encuentran por debajo de su umbral de percepción, de aproximadamente 150 mg/l (Cullere et al, 2004). 1-Butanol (mg/l) 5 4 3 2 1 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.57. Producción de 1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). 194 IV. Resultados y discusión La Figura IV.58 muestra la producción de 2-metil-1-butanol, el cual disminuye en presencia de 50 mg/l de o-vainillina y 50 mg/l de ácido trans-cinámico, mientras que con los demás bloqueadores no se aprecia una diferencia significativa en su producción con respecto al control (Apéndice I.3). Resultados que concuerdan con los obtenidos en el mosto de la misma variedad de uva con menor contenido de azúcares ( Figura IV.48), así como con el ensayo de la sección IV.1.3.2 en un medio a base de mosto concentrado de uva blanca con 15 % de GAP (Tabla IV.20), en el cual con la misma cepa de levadura, a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico, la producción del 2-metil-1butanol fue menor con respecto al control. 2-Metil-1-butanol (mg/l) 160 120 80 40 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.58. Producción de 2-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Al igual que en el caso del 2-metil-1-butanol, la producción de 3-metil-1-butanol disminuye en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico (Figura IV.59). Resultados que concuerdan con los obtenidos en el mosto con menor contenido de azúcares (Figura IV.49). Con los demás bloqueadores no se observa ningún efecto en su producción con respecto al control (Apéndice I.3). 195 IV. Resultados y discusión El 3-metil-1-butanol o alcohol isoamílico, es un alcohol superior cuyo umbral de percepción está en torno a 30 mg/l (Ehsani et al, 2009). En la Figura IV.59, las concentraciones de este alcohol superior están por debajo de ese valor en el caso de la ovainillina y el ácido trans-cinámico, lo cual podría ser interesante de considerar dado que este alcohol podría no ser agradable a partir de determinadas concentraciones en el vino ya que aporta aroma a queso. 3-Metil-1-butanol (mg/l) 50 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.59. Producción de 3-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.60 muestra la producción de 2-feniletanol. Este alcohol superior es un compuesto deseable con un importante efecto sobre el perfil aromático del vino, en el cual aporta aromas florales y cuyo umbral de percepción está en torno a 14 mg/l (Campo et al, 2006). De acuerdo a los resultados mostrados en la Figura IV.60, la producción de 2-feniletanol disminuye a medida que se incrementa la dosis de o-vainillina y ácido trans-cinámico, siendo mayor la reducción en presencia del último, efecto que no se observó en los ensayos anteriores utilizando este bloqueador. Con los demás bloqueadores no se 196 IV. Resultados y discusión obtuvieron variaciones importantes en la producción del 2-feniletanol (Apéndice I.3), siendo en todos los casos su concentración superior a su umbral de percepción. 70 2-feniletanol (mg/l) 60 50 40 30 20 10 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.60. Producción de 2-feniletanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). La Figura IV.61 muestra la producción de 2,3-butanodiol. Dicho alcohol al igual que en ensayos anteriores, incrementa su producción en presencia de o-vainillina y ácido transcinámico, incremento que es mayor a medida que aumenta la concentración de ambos bloqueadores. Con los demás bloqueadores no se obtienen diferencias significativas con respecto al control (Apéndice I.3). Resultados similares se obtuvieron con ambas dosis de o-vainillina en el mosto de Syrah con similar contenido de azúcares (14,3 % de GAP) (Figura IV.43), así como con el mosto de Tempranillo con 10 % de GAP (Figura IV.50) aunque en este último caso el incremento fue significativo sólo con la dosis de 50 mg/l de o-vainillina. Mientras que en el caso del ácido trans-cinámico los resultados obtenidos en este ensayo corroboran lo obtenido en los ensayos anteriores, tanto en medios a base de mosto concentrado de uva blanca Airen (Tablas IV.20 y IV.21) así como con el mosto de Tempranillo con 197 IV. Resultados y discusión menor contenido de azúcares (Figura IV.50), lo cual indicaría que la producción del 2,3butanodiol cumple una importante función en la regulación de la acidez y del equilibrio NADH/NAD+ en el interior celular (Nakashimada et al, 2000; Celińska y Grajek, 2009) como respuesta de la levadura ante altas concentraciones de ácidos en el medio fermentativo, en este caso el ácido trans-cinámico. 2,3-Butanodiol (mg/l) 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Control F50 F100 V50 V100 Cn50 Cn100 G100 G200 Q20 Q50 C5 C10 Figura IV.61. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4). Por otro lado, la producción de 2,3-butanodiol podría incrementarse con algunas cepas de S. cerevisiae que tienen como principal característica la síntesis de altas cantidades de glicerina, en detrimento de la producción de etanol, además de reducir considerablemente los niveles de acetoína (Michnick et al, 1997; Remize et al, 1999; Ehsani et al, 2009), lo cual en nuestro caso concuerda con la producción de acetoína mostrada en la Figura IV.53, la cual disminuye en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico a medida que se incrementa la producción de 2,3-butanodiol. Con los demás bloqueadores no se observa dicho comportamiento. 198 IV. Resultados y discusión Con respecto a lo mencionado en el párrafo anterior sobre el incremento del 2,3butanodiol a medida que la producción de glicerina aumenta, los resultados obtenidos no concuerdan con dichos estudios, pues en los mostos de Tempranillo con 10 y 14,1 % de GAP (Figuras IV.50 y IV.61 respectivamente) la producción de 2,3-butanodiol aumenta en presencia de ácido trans-cinámico, mientras que la producción de glicerina disminuye significativamente (Figuras IV.37 y IV.38 respectivamente) con respecto al control. Además en el mosto con 14,1 % de GAP se observa un efecto similar en presencia de la o-vainillina. Este comportamiento pondría en evidencia una competencia por el poder reductor en forma de NADH entre las enzimas GPDH y la acetoína reductasa (Remize et al, 1999), claves en la formación de glicerina y 2,3-butanodiol respectivamente. Finalmente, en base a los resultados obtenidos, se comprueba nuevamente que el efecto de los bloqueadores metabólicos utilizados es variable en función de su naturaleza química, lo cual se refleja en el análisis discriminante mostrado en la Figura IV.62 para todos los compuestos volátiles fermentativos, donde se observa claramente como algunos bloqueadores pueden afectar considerablemente la producción de estos compuestos por la levadura, diferenciándose del control y de otros bloqueadores, como es el caso del ácido trans-cinámico y la o-vainillina, resultados que concuerdan con los obtenidos en el ensayo anterior en el mosto de Tempranillo con menor contenido de azúcares (Figura IV.51), y en el caso de la o-vainillina concuerdan con el ensayo en el mosto de Syrah con similar contenido de azúcares (Figura IV.44). Los demás bloqueadores al parecer no muestran un efecto considerable sobre el perfil de compuestos volátiles. 199 IV. Resultados y discusión Figura IV.62. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP a diferentes dosis de furfural (F), o-vainillina (V), ácido trans-cinámico (Cn), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q) y cobre (C). Media ± desviación estándar (n = 4). 200 IV. Resultados y discusión 201 IV. Resultados y discusión 202 V. Conclusiones CAPÍTULO V: CONCLUSIONES 203 V. Conclusiones 204 V. Conclusiones V.1. Reducción del grado alcohólico - El efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos como estrategia para reducir el grado alcohólico, muestra una amplia variabilidad en función de la naturaleza química de cada bloqueador, de la composición del medio fermentativo y de la cepa de levadura utilizada. - El furfural es el bloqueador metabólico que mejores resultados en cuanto a la reducción del grado alcohólico ha permitido obtener, sin afectar el consumo de azúcares por la levadura. - La o-vainillina, el glicolaldehído, el ácido trans-cinámico, la p-benzoquinona y el cobre muestran comportamientos variables en su efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica en función de la composición del medio fermentativo. V.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros colorimétricos y producción de metabolitos secundarios - Los bloqueadores metabólicos estudiados no afectan considerablemente los parámetros colorimétricos en vinos tintos. - En función de la composición del medio fermentativo, la producción de glicerina puede disminuir en presencia de ácido trans-cinámico y o-vainillina, mientras que puede incrementar en presencia de p-benzoquinona y cobre. Los demás bloqueadores no afectan su producción. 205 V. Conclusiones - El efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la síntesis de compuestos volátiles fermentativos es variable, afectando considerablemente su producción el ácido trans-cinámico, la o-vainillina y el cobre. - En la mayoría de los casos, la utilización de bloqueadores metabólicos ha mejorado la producción de acetaldehído, 2,3-butanodiol y 1-propanol. Con otros metabolitos como el acetato de etilo, en casos puntuales, ha disminuido su producción. - En presencia de ácido trans-cinámico y o-vainillina, la síntesis de alcoholes superiores puede verse considerablemente afectada. Finalmente, para dosificar estos bloqueadores metabólicos en los mostos a fermentar, deben tenerse en cuenta dos consideraciones importantes: La primera, referida a las concentraciones a partir de las cuales estos compuestos y/o sus derivados pueden presentar algún efecto no deseable, sin obviar que algunos de ellos forman parte del grupo de aditivos alimentarios y están sometidos a una legislación que los regula. La otra consideración, es que su utilización debe hacerse dentro de las concentraciones usuales presentes en alimentos, y si fuera el caso a concentraciones menores, para no alterar parámetros importantes como la composición y el equilibrio fisicoquímico y sensorial del vino. 206 V. Conclusiones 207 V. Conclusiones 208 Bibliografía BIBLIOGRAFÍA Ábalos, D.; Vejarano, R.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J. A. (2011). The use of furfural as a metabolic inhibitor for reducing the alcohol content of model wines. European Food Research and Technology, 232: 663-669. ACGIH. (1990). Threshold limit values (TLVs) and biological exposure indices for 1990–1991 adopted by American Conference of Governmental Industrial Hygienists. Adams, T.B.; Doull, J.; Goodman, J.I.; Munro, I.C.; Newberne, P.; Portoghese, P.S.; Smith, R.L.; Wagner, B.M.; Weil, C.S.; Woods, L.A.; Ford R.A. (1997). The FEMA GRAS assessment of furfural used as a flavour ingredient. Food and Chemical Toxicology, 35: 739-751. Adams, T.B.; Cohen, S.M.; Doull, J.; Feron, V.J.; Goodman, J.I.; Marnett, L.J.; Munro, I.C.; Portoghese, P.S.; Smith, R.L.; Waddell, W.J.; Wagner, B.M. (2004). The FEMA GRAS assessment of cinnamyl derivatives used as flavor ingredients. Food and Chemical Toxicology, 42(2):157-85. Alexandre, H.; Ansanay-Galeote, V.; Dequin, S.; Blondin, B. (2001). Global gene expression during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters, 498: 98–103. Alves, R.F.; Nascimento, A.M.D.; Nogueira, J.M.F. (2005). Characterization of the aroma profile of Madeira wine by sorptive extraction techniques. Analytica Chimica Acta, 546: 11-21. Avery, A.M.; Avery, S.V. (2001). Saccharomyces cerevisiae expresses three phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases. Journal of Biological Chemistry, 276: 33730-33735. Avery, S.V. (2001). Metal toxicity in yeasts and the role of oxidative stress. Advances in Applied Microbiology, 49: 111-142. Avery, S.V.; Howlett, N.G.; Radice, S. (1996). Copper toxicity towards Saccharomyces cerevisiae: Dependence on plasma membrane fatty acid composition. Applied and Environmental Microbiology, 62(11): 3960–3966. Azhar A.F.; Bery, M.K.; Colcord, A.R.; Roberts, R.S.; Corbitt, G. V. (1981). Factors affecting alcohol fermentation of wood acid hydrolyzate. Biotechnology and Bioengineering Symposium, 11: 293-300. Azenha, M.; Vasconcelos, M.T.; Moradas-Ferreira, P. (2000). The influence of Cu concentration on ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bioscience and Bioengineerin, 90(2): 163-167. Aznar, M.; López, R.; Cacho, J.; Ferreira, V. (2003). Prediction of aged red wine aroma properties from aroma chemical composition. Partial least squares regression models. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(9): 2700-2707. Balairón, L. (2006). Incidencia del cambio climático en los sistemas ecológicos del cultivo de la vid. V Foro Mundial del Vino. Logroño, España. Banerjee, N.; L. Viswanathan. (1974). Effect of furfural and 5-hydroxy-methyl-furfural on the growth and alcohol production by yeast. Proceedings of the 40th Annual Convention of Sugar Technologists’ Association of India, Section G l-4. Banerjee, N.; Bhatnagar, R.; Viswanathan, L. (1981). Inhibition of glycolysis by furfural in Saccharomyces cerevisiae. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 11: 226-228. Bauer, F.F.; Pretorius, I.S. (2000). Yeast stress response and fermentation efficiency: how to survive the making of wine. South African Journal of Enology and Viticulture, 21: 27–51. Belisario-Sánchez, Y.; Taboada-Rodríguez, A.; Marín-Iniesta, F.; Iguaz-Gainza, A.; López-Gómez, A. (2012). Aroma recovery in wine dealcoholization by SCC distillation. Food Bioprocess and Technology, 5: 2529-2539. 209 Bibliografía Bely, M.; Stoeckle, P.; Masneuf-Pomarede, I., Dubourdieu, D. (2008). Impact of mixed Torulaspora delbrueckiie Saccharomyces cerevisiae culture on high-sugar fermentation. International Journal of Food Microbiology, 122: 312320. Bisson, L.F. (1999). Stuck and sluggish fermentations. American Journal of Enology and Viticulture, 50: 107-119. Blackwell, K.; Singleton, I.; Tobin, J. (1995). Metal cation uptake by yeast: a review. Applied Microbiology and Biotechnology, 43: 579-584. Blanchard, L.; Tominaga, T.; Dubourdieu, D. (2001). Formation of furfuriltiol exhibiting a strong coffee aroma during oak barrel fermentation from furfural released by toasted staves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49: 4833-4835. Boidron, J.; Chatonnet, P.; Pons, M. (1988). Effects of wood on aroma compounds of wine. Connaissance de la Vigne et de Vin, 22: 275-294. Bowen, R.W.; Pugh, S.Y.R.; Schomburgk, N.J.D. (1986). Inhibition of horse liver and yeast alcohol dehydrogenase by aromatic and aliphatic aldehydes. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 36: 191-196. Boyer, L.J.; Vega, J.L.; Klasson, K.T.; Clausen, E.C.; Gaddy, J.L. (1992). The effects of furfural on ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biomass and Bioenergy, 3: 41-48. Brady, D.; Glaum, D.; Duncan, J.R. (1994). Copper tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Letters in Applied Microbiology, 18: 245–250. Bramlett, M.R.; Tan, X.; Lindahl, P.A. (2003). Inactivation of acetyl-CoA synthase/carbon monoxide dehydrogenase by copper. Journal of the American Chemical Society, 125(31): 9316-7. Brandolini, V.; Tedeschi, P.; Capece, A.; Maietti, A.; Mazzotta, D.; Salzano, G.; Paparella, A.; Romano, P. (2002). Saccharomyces cerevisiae wine strains differing in copper resistance exhibit different capability to reduce copper content in wine. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 18: 499–503. Bryn, K.; Ulstrup, J.C.; Stormer, F.C. (1973). Effect of acetate upon the formation of acetoin in Klebsiella and Enterobacter and its possible practical application in a rapid Voges-Proskauer test. Applied Microbiology, 25: 511–512. Butzke, C. (2006). Enología aplicada a la elaboración de vinos tintos en zonas cálidas o afectadas por el cambio climático. V Foro Mundial del Vino. Logroño, España. Cabiscol, E.; Piulats, E.; Echave, P.; Herrero, E.; Ros, J. (2000). Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry, 275: 27393-27398. Cacho, J. (2006). Evolution of the red wine volatile profile during its aging in oak barrels. ACE Revista de Enología ISSN-e1697-4123. No 72. Available: http://www.acenologia.com/ciencia76_1.htm. Accessed 10 Jan 2013. Cadenas, E. (1989). Biochemistry of oxygen toxicity. Annual Review of Biochemistry, 58: 79-110. California Administrative Code. (2012). Title 17: Public Health. Section 17010: Provisions applicable to wine produced in California. California State, USA. Available: http://weblinks.westlaw.com/result/default.aspx?cite=17CAADCS17010&db=1000937&findtype=L&fn=_top&p bc=DA010192&rlt=CLID_FQRLT11608851122711&rp=%2FSearch%2Fdefault%2Ewl&rs=WEBL12%2E10&servi ce=Find&spa=CCR-1000&sr=TC&vr=2%2E0. Accessed 12 Dec 2012. Câmara, J.; Alves, M.; Marques, J. (2006). Changes in volatile composition of Madeira wines during their oxidative ageing. Analytica Chimica Acta, 563: 188–197. Campo, E.; Ferreira, V.; Escudero, A.; Marqués, J.C.; Cacho, J. (2006). Quantitative gas chromatography olfactometry and chemical quantitative study of the aroma of four Madeira wines. Analytica Chimica Acta, 563: 180– 187. 210 Bibliografía Celińska, E.; Grajek, W. (2009). Biotechnological production of 2,3-butanediol. Current state and prospects. Biotechnology Advances, 27(6): 715–725. Cervantes, C.; Gutierrez-Corona, F. (1994). Copper resistance mechanisms in bacteria and fungi. FEMS Microbiology Reviews, 14: 121–137. Chandrasena, G.; Walker, G.; Staines, H. (1997). Use of response surfaces to investigate metal ion interactions in yeast fermentations. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 55(l): 24-29. Chatonnet, P.; Boidron, J.; Pons, M. (1989). Incidence du traitement thermique du bois de chêne sur sa composition chimique. 2e Partie: Évolution de certains composés en fonction de l‟intensite de brûlage. Connaissance de la Vigne et de Vin, 23: 223–250. Chatonnet, P. (1992). Les composés aromatiques du bois de chêne cédés aux vins. Influence des opérations de chauffe en tonnellerie. En “Le bois et la qualité des vins et des eaux-de-vie”. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, núm Hors de série. 81-91. Chuang, L.F.; Collins, E.B. (1968). Biosynthesis of diacetyl in bacteria and yeast. J Bacteriol, 95: 2083-2089. Chung, I.S.; Lee, Y.Y. (1985). Ethanol fermentation of crude acid hydrolyzate of cellulose using high-level yeast inocula. Biotechnology and Bioengineering, 27: 308-315. Clausen, M.; Lamb, C.J.; Megnet, R.; Doerner, P.W. (1994). PAD1 encodes phenylacrylic acid decarboxylase which confers resistance to cinnamic acid in Saccharomyces cerevisiae. Gene, 142: 107-112. Code of Federal Regulations. (2012). Title 27: Alcohol, Tobacco Products and Firearms. Part 24.10. Pag. 600. Available: http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2012-title27-vol1/pdf/CFR-2012-title27-vol1.pdf. Accessed 12 Dec 2012. Collins, P.M. (2006). Dictionary of carbohydrates. 2º ed. Chapman & Hall/CRC, Taylor & Francis Group. Boca Raton, New York, London. Pag. 624. Costa, V.M.V.; Amorim, M.A.; Quintanilha, A.; Ferreira, P.M. (2002). Hydrogen peroxide-induced carbonylation of key metabolic enzymes in Saccharomyces cerevisiae: The involvement of the oxidative stress response regulators Yap1 and Skn7. Free Radical Biology and Medicine, 33: 1507-1515. Coton, E.; Torlois, S.; Bertrand, A.; Lonvaud-Funel, A. (1999). Amines biogènes et bactéries lactiques du vin. Bulletin de l’OIV, 815-816. Coulter, A.D.; Godden, P.W.; Pretorius, I.S. (2004). Succinic acid. How it is formed, what is its effect on titratable acidity, and what factors influence its concentration in wine? Australian and New Zealand Wine Journal, 19(6): 16-25. Cubero, N.; Monferrer, A.; Villalta, J. (2002). Aditivos alimentarios. Ediciones A. Madrid Vicente y Ediciones MundiPrensa S.A. Madrid, España. Cullere, L; Escudero, A., Cacho, J.; Ferreira, V. (2004). Gas chromatograpgy–olfactory and chemical qualitative study of the aroma of six premium quality Spanish aged red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 1653– 1660. Curvelo-Garcia, A. (1988). Controlo de qualidade dos vinhos: Química Enológica e Métodos Analíticos. Instituto da Vinha e do Vinho. Lisboa, Portugal. Cutzach, I.; Chatonnet, P.; Henry, R.; Dubourdieu, D. (1999). Identifying new volatile compounds in toasted oak. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 1663–1667. Dancis, A.; Yuan, D.; Haile, D.; Askwith, C.; Elde, D.; Moehle, C.; Kaplan, J.; Klausner, R. (1994). Molecular characterization of a copper transport protein in S. cerevisiae: an unexpected role for copper in iron transport. Cell, 76: 393-402. 211 Bibliografía Davidson, P.M.; Naidu, A.S. (2000). Phyto-phenols. In: Naidu, A.S. (Ed.), Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press LLC, Boca Raton, London, New York, Washington DC. Pag. 265 – 294. Davies, K.J. (1995). Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochemical Society Symposium, 61: 1-31. Delgado-Andrade, C.; Seiquer, I.; Haro, A.; Castellano, R.; Navarro, M. (2010). Development of the Maillard reaction in foods cooked by different techniques. Intake of Maillard-derived compounds. Food Chemistry, 122: 145–153. Delgenes, J.P.; Moletta, R.; Navarro, J.M. (1996). Effects of lignocelluloses degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis and Candida shehatae. Enzyme and Microbial Technology, 19: 220-225. Delnieri, D.; Gardner, D.C.J.; Bruschi, C.V.; Oliver, S.G. (1999). Disruption of seven hypothetical aryl-alcohol dehydrogenase genes from Saccharomyces cerevisiae and construction of a multiple knock-out strain. Yeast, 15: 1681-1689. Mira de Orduña, R. (2010). Climate change associated effects on grape and wine quality and production. Food Research International, 43: 1844–1855. De Wulf, O.; Thonart, P.; Gaignage, P.; Marlier, M.; Paris, A.; Paquot, M. (1986). Bioconversion of vanillin to vanillyl alcohol by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering Symposium, 17: 605-616. Díaz de Villegas, M.E.; Villa, P.; Guerra, M.; Rodríguez, E.; Redondo, D.; Martínez, A. (1992). Conversion of furfural into furfuryl alcohol by Saccharomyces cerevisiae. Acta Biotechnologica, 12: 351-354. Dokoozlian, N. (2006) Consecuencias del cambio climático en las prácticas vitícolas en USA. V Foro Mundial del Vino. Logroño, España. Ehsani, M.; Fernández, M.R.; Biosca, J.A. Julien, A.; Dequin, S. (2009). Engineering of 2,3-butanediol dehydrogenase to reduce acetoin formation by glycerol-overproducing, low-alcohol Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 75(10): 3196–3205. Eide, D.J. (1998). The molecular biology of metal ion transport in Saccharomyces cerevisiae. Annual Review of Nutrition, 18: 441-469. Ergun, M.; Mutlu, S.; Gurel, O. (1997). Improved ethanol production by Saccharomyces cerevisiae with EDTA, ferrocyanide and zeolite X addition to sugar beet molasses. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 68: 147-150. Escudero, A.; Campo, E.; Fariña, L.; Cacho, J.; Ferreira, V. (2007). Analytical characterization of the aroma of five premium red wines. Insights into the role of odor families and the concept of fruitiness of wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: 4501-4510. España. Ley 24/2003, de 10 de julio, de la Viña y del Vino. Boletín Oficial del Estado, 11 de julio de 2003. Es-Safi, N.E.; Cheynier, V.; Moutounet, M. (2003). Implication of phenolic reactions in food organoleptic properties. Journal of Food Composition and Analysis, 16: 535-553. Evans, T.E. (1996). The effects of changes in the world hydrological cycle on the availability of water resources. In: Global climate change and agricultural production. F. Bazzaz and W. Sombroek (Eds.). John Wiley and Sons. Chichester, pag. 15-48. European Union. (2000). Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products (SCCNFP). The European Parliament and The Council of The European Union 7th Amendment to Council Directive 76/768/EEC, December 1999 and May 2000. European Union. (2011). Commission Regulation (EU) No 1130/2011. The European Commission. 212 Bibliografía FDA. (2011). Code of Federal Regulations, 21 CFR 172.515. Title 21: Food and Drugs, vol. 3, Chapter I: Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. Part 172: Food Additives Permitted for Direct Addition to Food for Human Consumption. Subpart F: Flavoring Agents and Related Substances, 515: Synthetic Flavoring Substances and Adjuvants. FDA. (2013). Food additive status list. U.S. Food and Drug Administration. Department of Health and Human Services. http://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/FoodAdditivesIngredients/ucm091048.htm#ftnB. Accessed 19 Aug 2013. Fernandes, A.; Sá-Correia, I. (1999). Comparative effects of Saccharomyces cerevisiae cultivation under copper stress on the activity and kinetic parameters of plasma-membrane-bound H(+)ATPases PMAl and PMA2. Archives of Microbiology, 171: 273-278. Fernandez, A.I.; Fernandez, A.F.; Perez, M.J.; Nieto, T.P.; Ellis, A.E. (1998). Siderophore production by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Lack of strain specificity. Diseases of Aquatic Organisms, 33: 87-92. Ferreira, V. (2007). La base química del aroma del vino: Un viaje analítico desde las moléculas hasta las sensaciones olfato-gustativas. Revista de la Real Academia Ciencias de Zaragoza, 62: 7–36. Ferreira, V.; Ortín, N.; Escudero, A.; López, R.; Cacho, J. (2002). Chemical characterization of the aroma of Grenache rosé wines: aroma extract dilution analysis, quantitative determination, and sensory reconstitution studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (14): 4048–4054. Fiddler, W.; Doerr, R.; Waserman, A.E.; Salay, J.M. (1966). Composition of hickory sawdust smoke: Furans and phenols. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 24: 659-666. Fireoved, R. L.; Mutharasan, R. (1986). Effect of furfural and ethanol on the growth and energetics of yest under microaerobic conditions. Annals of the New York Academy of Sciences, 469: 433-446. Fitzgerald, D.; Stratford, M.; Narbad, A. (2003). Analysis of the inhibition of food spoilage yeasts by vanillin. International Journal on Food Microbiology, 86: 113-122. Fitzgerald, D.; Stratford, M.; Gasson, M.; Narbad, A. (2004). The potential application of vanillin in preventing yeast spoilage of soft drinks and fruit juices. Journal of Food Protection, 67(2): 391-5. Flamini, R.; Dalla Vedova, A. (2003). Glyoxal/glycolaldehyde: A redox system involved in malolactic fermentation of wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8): 2300–2303. Flamini, R.; Traldi, P. (2010). Mass spectrometry in grape and wine chemistry. John Wiley and Sons Inc. U.S.A. Gadd, G.M. (1993). Interactions of fungi with toxic metals. New Phytologist, 124: 25–60. García Araez, H. (1953). Esencias naturales. Ediciones Aguilar S.A. Madrid, España. Garde, T.; Arias Gil, M.; Ancín Azpilicueta, C. (2005). Efecto del uso de las barricas de roble en la composición volátil del vino. Optimización del tiempo de envejecimiento. Enólogos, 38: 38-41. Geissman, T.A. (1974). Principios de química orgánica. 2º edición. Editorial Reverté S.A. Barcelona, España. Geoghegan, K.; Ybarra, D.; Feeney, R. (1979). Reversible reductive alkylation of amino groups in proteins. Biochemistry American Chemical Society, 18(24): 5392-5399. Gil Hernández, A. (2010). Tratado de Nutrición. 2a edición. Tomo II: Composición y Calidad Nutritiva de los alimentos. Ed. Médica Panamericana. Madrid, España. Glomb, M.A.; Monnier, V.M. (1995). Mechanism of protein modification by glyoxal and glycolaldehyde, reactive intermediates of the Maillard reaction. Journal of Biological Chemistry, 270: 10017–10026. 213 Bibliografía Glories, Y. (1984a). La couleur des vins rouges I. Connaisance de la Vigne et du Vin, 18: 195–217. Glories, Y. (1984b). La couleur des vins rouges II. Connaisance de la Vigne et du Vin, 18: 253–271. Godon, C.; Lagniel, G.; Lee, J.; Buhler, J.M.; Kieffer, S.; Perrot, M.; Boucherie, H.; Toledano, M.B.; Labarre, J. (1998). The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry, 273: 22480-22489. Goldner, M.C.; Zamora, M.; Di Leo Lira, P.; Gianninoto, H.; Bandoni, A. (2009). Effect of ethanol level in the perception of aroma attributes and the detection of volatile compounds in red wine. Journal of Sensory Studies, 24: 243–257. Gomez, M.J.; Cacho, J.F.; Ferreira, V. (2007) Volatile components of Zalema white wines. Food Chemistry, 100: 1464–1473. Gonzalez, R.; Quirós, M.; Morales, P. (2013). Yeast respiration of sugars by non-Saccharomyces yeast species: A promising and barely explored approach to lowering alcohol content of wines. Trends in Food Science and Technology, 29: 55-61. Gramatica, P.; Ranzi, B.; Manitto, P. (1981). Decarboxylation of cinnamic acids by Saccharomyces cerevisiae. Bioorganic Chemistry, 10(1): 14–21. Grant, C.M.; Perrone, G.; Dawes, I.W. (1998). Glutathione and catalase provide overlapping defenses for protection against hydrogen peroxide in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemical and Biophysical Research Communications, 253: 893-898. Halliwell, B.; Gutteridge, J. (1999). Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd Edn. Oxford University Press. London, UK. Hallsworth, J.E. (1998). Ethanol-induced water stress in yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering, 85: 125– 137. Hannah, L.; Roehrdanz, P.R.; Ikegami, M.; Shepard, A.V.; Shaw, M.R.; Tabor, G.; Zhi, L.; Marquet, P.A.; Hijmans, R.J. (2013). Climate change, wine and conservation. Proceeding of the National Academy of Sciences, 110(17): 6907–6912. Harada, T.; Mino, Y. (1973). Formation of 4-hydroxystyrene from p-coumaric acid by the timothy leaf spot fungus Cladosporium phlei. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 39: 438-440. Harbertson, J.; Mireles, M.; Harwood, E.; Weller, K.; Ross, C. (2009). Chemical and sensory effects of saignée, water addition, and extended maceration on high brix must. American Journal of Enology and Viticulture, 4: 450-460. Hawkins, G.M.; Doran-Peterson, J. (2011). A strain of Saccharomyces cerevisiae evolved for fermentation of lignocellulosic biomass displays improved growth and fermentative ability in high solids concentrations and in the presence of inhibitory compounds. Biotechnology for Biofuels, 4: 49. Hayashi, T.; Namiki, M. (1986). Role of sugar fragmentation in an early stage browning of amino-carbonyl reaction of sugar with amino acid. Agricultural Biology and Chemistry, 50: 1965–1970. Hazan, R.; Levine, A.; Abeliovich, H. (2004). Benzoic acid, a weak organic acid food preservative, exerts specific effects on intracellular membrane trafficking pathways in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 70(8): 4449–4457. Heer, D.; Heine, D.; Sauer, U. (2009). Resistance of Saccharomyces cerevisiae to high concentrations of furfural is based on NADPH-dependent reduction by at least two oxidoreductases. Applied and Environmental Microbiology, 75(24): 7631–7638. Heipieper, H.J.; Weber, F.J.; Sikkema, J.; Keweloh, H.; de Bont, J.A.M. (1994). Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents. Trends in Biotechnology, 12: 409-415. 214 Bibliografía Herraiz, T.; Reglero, G.; Martin-Alvarez, P.J.; Herraiz, M.; Cabezudo, M.D. (1991). Identification of aroma components of Spanish „Verdejo‟ wine. Journal of the Science of Food and Agriculture, 55: 103–116. Heux, S.; Sablayrolles, J.M.; Cachon, R.; Dequin, S. (2006). Engineering a Saccharomyces cerevisiae wine yeast that exhibits reduced ethanol production during fermentation under controlled microoxygenation conditions. Applied and Environmental Microbiology, 72: 5822-5828. Hidalgo, J. (2010). Tratado de Enología. Enología I. 2º ed. Mundi-Prensa. Madrid, España. Ho, P.; Hogg, T.; Silva, M. (1999). Application of a liquid chromatographic method for the determination of phenolic compounds and furans in fortified wines. Food Chemistry, 64: 115-122. Holmgren, A. (1989). Thioredoxin and glutaredoxin systems. Journal of Biological Chemistry, 264: 13963-13966. Horváth, I.S.; Franzen, C.J.; Taherzadeh, M.J.; Niklasson, C.; Lidén, G. (2003). Effects of furfural on the respiratory metabolism of Saccharomyces cerevisiae in glucose-limited chemostats. Applied and Environmental Microbiology, 69: 4076-4086. Howlett, N.G.; Avery, S.V. (1997). Induction of lipid peroxidation during heavy metal stress in Saccharomyces cerevisiae and influence of plasma membrane fatty acid unsaturation. Applied and Environmental Microbiology, 63: 2971-2976. Huang, H.; Guo, X.; Li, D.; Liu, M.; Wu, J.; Ren, H. (2011). Identification of crucial yeast inhibitors in bio-ethanol and improvement of fermentation at high pH and high total solids. Bioresource Technology, 102(16): 7486-93. Imai, T.; Ohono, T. (1995). The relationship between viability and intracellular pH in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 61: 3604-3608. IPCC. (2007). Climate Change 2007. The Physical Basis. Sumary for Policymarkers. 21 pag. Jackson, D.I.; Lombard, P.B. (1993). Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality. A review. American Journal of Enology and Viticulture, 44(4): 409-430. Jamieson, D.J. (1998). Oxidative Stress responses of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14: 1511-1527. Jayakody, L.N.; Hayashi, N.; Kitagaki, H. (2011). Identification of glycolaldehyde as the key inhibitor of bioethanol fermentation by yeast and genome-wide analysis of its toxicity. Biotechnology Letters, 33: 285–292. Jayakody, L.N.; Horie, K.; Hayashi, N.; Kitagaki, H. (2012). Improvement of tolerance of Saccharomyces cerevisiae to hot-compressed water-treated cellulose by expression of ADH1. Applied Microbiology and Biotechnology, 94(1): 273-283. Joint FAO/WHO. Expert committee on food additives. (2000). Evaluation of certain food additives. Fifty-fifth meeting. Ginebra, Suiza. Nº 891. Jones, P.R.; Gawel, R.; Francis, I.; Waters, E.J. (2008). The influence of interactions between major white wine components on the aroma, flavour and texture of model white wine. Food Quality and Preference, 19: 596–607. Jonker, D. (2000). Sub-chronic (13 week) oral toxicity study in rats with micro-encapsulated furfural. TNO Report V 99.520, vols. 1-3. Jönsson, L.J.; Palmqvist, E.; Nilvebrant, N.O.; Hahn-Hägerdal, B. (1998). Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from white-rot fungus Trametes versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology, 49: 691697. Kape, R.; Parniske, M.; Werner, D. (1991). Chemotaxis and nod gene activity of Bradyrhizobium japonicum in response to hydroxycinnamic acids and isoflavonoids. Applied and Environmental Microbiology, 57: 316-319. 215 Bibliografía Katsunobu, E.; Shiro, S. (2002). A comparative study on chemical conversion of cellulose between the batch-type and flow-type systems in supercritical water. Cellulose, 9: 301–311. Kenny, G.H.; Harrison, P.A. (1993). The effects of climatic variability and change on grape suitability in Europe. Journal of Wine Research, 4: 163-183. Knight, S.A.; Labbe, S.; Kwon, L.; Kosman, D.J.; Thiele, D.J. (1996). A widespread transposable element masks expression of a yeast copper transport gene. Genes and Development, 10: 1917-1929. Kontoudakis, N.; Esteruelas, M.; Fort, F.; Canals, J.M.; Zamora, F. (2011) Use of unripe grapes harvested during cluster thinning as a method for reducing alcohol content and pH of wine. Australian Journal of Grape and Wine Research, 17: 230–238. Kuhn, A.; Van Zyl, C.; Van Tonder, A.; Prior, B.A. (1995). Purification and partial characterization of an aldo-keto reductase from Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 61: 1580-1585. Kumagai, Y.; Koide, S.; Taguchi, K.; Endo, A.; Nakai, Y.; Yoshikawa, T.; Shimojo, N. (2002). Oxidation of proximal protein sulfhydryls by phenanthraquinone, a component of diesel exhaust particles. Chemical Research in Toxicology, 15: 483–489. Kutyna, D.R.; Varela, C.; Henschke, P.A.; Chambers, P.A.; Stanley, G.A. (2010). Microbiological approaches to lowering ethanol concentration in wine. Trends Food Science and Technology, 21: 293-302. Lamikanra, O.; Grimm, C.C.; Inyang, I.D. (1996). Formation and occurrance of flavor components of Noble muscadine wines. Food Chemistry, 56: 373-376. Larsson S. (2000). Ethanol from lignocellulose-fermentation inhibitors, detoxification and genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for enhanced resistance. Doctoral thesis. Lund, Sweden. Larsson, S.; Nilvebrant, N.O.; Jönsson, L.J. (2001). Effect of overexpression of Saccharomyces cerevisiae Pad1p on the resistance to phenylacrylic acids and lignocellulose hydrolysates under aerobic and oxygen-limited conditions. Applied Microbiology and Biotechnology, 57(1-2): 167-74. Larsson, S.; Palmqvist, E.; Hahn-Hâgerdal, B.; Tengborg, C.; Stenberg, K.; Zacchi, G.N.N.O. (1999). The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood. Enzyme and Microbial Technology, 24: 151-159. Larsson, S.; Quintana-Sáinz, A.; Reimann, A.; Nilvebrant, N.O.; Jönsson, L. (2000). Influence of lignocellulosederived aromatic compounds on oxygen-limited growth and ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Applied Biochemistry and Biotechnology, 84–86: 617 – 632. Larsson, S.; Reimann, A.; Nilvebrant, N.; Jönsson, L.J. (1999). Comparison of different methods for the detoxification of lignocelluloses hydrolyzates of spruce. Applied Biochemistry and Biotechnology, 77-79: 91-103. Laser, M.S.; Schulman, D.; Allen, S.G.; Lichwa, J.; Antal, M.J.; Lynd, L.R. (2002) A comparison of liquid hot water and steam pretreatments of sugar cane bagasse for bioconversion to ethanol. Bioresource Technology, 81: 33–44. Lee, W.G.; Lee, J.S.; Shin, C.S.; Park, S.C.; Chang, H.N.; Chang,, Y.K. (1999). Ethanol production using concentrated oak wood hydrolysates and methods to detoxify. Applied Biochemistry and Biotechnology, 77-79: 54759. Le Berre, E.; Atanasova, B.; Langlois, D.; Etievant, P.; Thomas-Danguin, T. (2007). Impact of ethanol on the perception of wine odorant mixtures. Food Quality and Preference, 18: 901–908. Linder, M.C.; Schaffer, K.J.; Hazegh-Azam, M.; Zhou, C.Y.; Tran, T.N.; Nagel, G.M. (1996). Serum ferritin: Does it differ from tissue ferritin?. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 11: 1033-1036. Liu, Z.; Moon, J.; Andersh, B.J.; Slininger, P.J.; Weber, S. (2008). Multiple gene-mediated NAD(P)H-dependent aldehyde reduction is a mechanism of in situ detoxification of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology, 81: 743-753. 216 Bibliografía Liu, Z.; Slininger, P.J.; Dien, B.S.; Berhow, M.A.; Kurtzman, C.P.; Gorsich, S.W. (2004). Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bishydroxymethylfuran. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 31(8): 345-352. Liu, Z.; Slininger, P.J.; Gorsich, S.W. (2005). Enhanced biotransformation of furfural and 5-hydroxymethylfurfural by newly developed ethanologenic yeast strains. Applied Biochemistry and Biotechnology, 121-124: 451-460. Liu, Z.; Blaschek, H. (2009). Lignocellulosic biomass conversion to ethanol by Saccharomyces. In: Vertes, A.; Qureshi, N.; Yukawa, H.; Blaschek, H. (eds). Biomass to biofuels. Wiley, West Sussex, pag. 17–36. Loira, I.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2012). Selection of glycolytically inefficient yeasts for reducing the alcohol content of wines from hot regions. Food and Bioprocess Technology, 5: 2787-2796. Lonvaud-Funel, A. (2001). MiniReview. Biogenic amines in wines: role of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 199: 9-13. Lu, P.; Chen, L.; Li, G.; Shen, S.; Wang, L.; Jiang, Q.; Zhang, J. (2007). Influence of furfural concentration on growth and ethanol yield of Saccharomyces kluyveri. Journal of Environmental Sciences, 19: 1528–1532. Lück, E.; Pager, M. (2000). Conservación química de los alimentos. Características, usos y efectos. 2º edición. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, España. Maarse, H.; Visscher, C.A.; Willimsens, L.C.; Boelens, M.H. (1994). Volatile compounds in foods. In: Qualitative and quantitative data, 7th edn, vol III. Centraal Instituut Voor Voedingsonderzoek, TNO, Zeist, The Netherlands. Macedo, S.; Fernandes, S.; Lopes, J.A.; de Sousa, H.; Pereira, P.; Carmelo, P.; Menduiña, C.; Simões, P.; Nunes da Ponte, M. (2008). Recovery of wine-must aroma compounds by supercritical CO2. Food Bioprocess and Technology, 1: 74–81. Majerski, P.; Piskorz, J.; Radlein, D. (2006). Production of glycolaldehyde by hydrous thermolysis of sugars. Unite States Patent Nº US 7094932 B2. Aug. 22. Major, F.W.; André, F.M. (1977). Vanillin recovery process. Unite States Patent Nº US 4021493. May 03. Masatsune, M.; Totsuka, H.; Ono, H. (2007). Browning of furfural and amino acids, and a novel yellow compound, furpipate, formed from lysine and furfural. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 71: 1717-1723. Maurivin. (2013). Fichas técnicas de las levaduras comerciales. Acceso: 31 de Octubre del 2013. Atributos de las levaduras: http://www.maurivin.com/upload/ATTRIBUTES_2012.pdf AWRI796: http://www.maurivin.com/media/84.pdf Distinction: http://www.maurivin.com/upload/Distinction_2012.pdf Mehlhorn, R.J. (1986). The interaction of inorganic species with biomembranes, pag. 85–97. In Bernhard, M.; Brinckman, F.E.; Sadler P.J. (ed.). The importance of chemical “speciation” in environmental processes. SpringerVerlag. Berlin, Germany. Merck Toxicological Data. (2013). Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Germany. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/chemicals. Acceso: 27 Agosto del 2013. Michnick, S; Roustan, J.L.; Remize, F.; Barre, P.; Dequin, S. (1997). Modulation of glycerol and ethanol yields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae strains overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol 3-phosphate dehydrogenase. Yeast, 13: 783-793. Middelhoven, W.J.; Gelpke, M.D. (1995). Partial conversion of cinnamic acid into styrene by growing cultures and cell-free extracts of the yeast Cryptococcus elinovii. Antonie van Leeuwenhoek, 67(2): 217-219. Mikulásová, M.; Vodný, S.; Pekarovicová, A. (1990). Influence of phenolics on biomass production by Candida utilis and Candida albicans. Biomass, 23: 149-154. 217 Bibliografía Modig T.; Liden, G.; Taherzadeh, M.J. (2002). Inhibition effects of furfural on alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase and piruvate dehydrogenase. Biochemical Journal, 363: 769-776. Monks, T.J.; Hanzlik, R.P.; Cohen, G.M.; Ross, D; Graham, D.G. (1992). Quinone chemistry and toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology, 112: 2–16. Morata, A.; Calderón, F.; González, M.C.; Gómez-Cordovés, M.C.; Suárez-Lepe, J.A. (2007). Formation of the highly stable pyranoanthocyanins (vitisins A and B) in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde. Food Chemistry, 100: 1144–1152. Moreira, N.; Mendes, F.; Guedes de Pinho, P.; Hogg, T.; Vasconcelos, I. (2008). Heavy sulphur compounds, higher alcohols and esters production profile of Hanseniaspora uvarum and Hanseniaspora guilliermondii grown as a pure and mixed cultures in grape must. International Journal of Food Microbiology, 124: 231-238. Morimoto, S.; Hirahima, T.; Matutani, W. (1969). Studies on fermentation products by yeast: Identification of furoin and furil. Journal of Fermentation Technology, 47: 486-491. Moutounet, M. (2006). Evolución de las técnicas de vinificación en respuesta a los cambios climáticos. V Foro Mundial del Vino. Logroño, España. Mukai, N.; Masaki, K.; Fujii, T.; Kawamukai, M.; Lefuji, H. (2010). PAD1 and FDC1 are essential for the decarboxylation of phenylacrylic acids in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109(6): 564–569. Nakashimada, Y.; Marwoto, B.; Kashiwamura, T.; Kakizono, T.; Nishio, N. (2000). Enhanced 2,3-butanediol production by addition of acetic acid in Paenibacillus polymyxa. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90: 661– 664. Navarro, A.R. (1994). Effects of Furfural on ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae: Mathematicals models. Current Microbiology, 29: 87-90. Nilsson, A.; Gorwa-Grauslund, M.F.; Hahn-Hägerdal, B.; Lidén, G. (2005). Cofactor Dependence in Furan Reduction by Saccharomyces cerevisiae in Fermentation of Acid-Hydrolyzed Lignocellulose. Applied and Environmental Microbiology, 71: 7866-7871. Nishikawa, N.K.; Sutcliffe, R.; Saddler, J.N. (1988). The influence of lignin degradation products on xylose fermentation by Klebsiella pneumoniae. Applied Microbiology and Biotechnology, 27: 549-552. O‟Brien, P.J. (1991). Molecular mechanisms of quinone cytotoxicity. Chemico-Biological Interactions, 80: 1–41. O‟Brien, P.J.; Siraki, A.G.; Shangari, N. (2005). Aldehyde sources, metabolism, molecular toxicity mechanisms, and possible effects on human health. Critical Reviews in Toxicology, 35 (7): 609-662. O‟Halloran, T.V.; Culotta, V.C. (2000). Metallochaperones, an intracellular shuttle service for metal ions. Journal of Biological Chemistry, 275: 25057-25060. Obreque-Slìer, E.; Peña-Neira, A.; Lopez-Solis, R. (2010). Enhancement of both salivary protein-enological tannin interactions and astringency perception by ethanol. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: 3729–3735. OIV. (2008). International Code of Oenological Practices. Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV). Code Sheet – Edition 2008/01. París, Francia. Oliva, J.M. (2003). Efecto de los productos de degradación originados en la explosión por vapor de biomasa de chopo sobre Kluyveromyces marxianus. Tesis doctoral. Madrid, España. Ohsumi, Y.; Kitamoto, K.; Anraku, Y. (1988). Changes induced in the permeability barrier of the yeast plasma membrane by cupric ion. Journal of Bacteriology, 170: 2676–2682. 218 Bibliografía Palmqvist, E. (1998). Fermentation of lignocellulosic hydrolysates: Inhibition and detoxification. Doctoral thesis. Lund, Sweden. Palmqvist, E.; Almeida, J.S.; Hahn-Hägerdal, B. (1999). Influence of furfural on anaerobic glycolytic kinetics of Saccharomyces cerevisiae in batch culture. Biotechnology and Bioengineering, 62: 447-454. Palmqvist, E.; Hahn-Hägerdal, B.; Galbe, M.; Zacchi, G. (1996). The effect of watersoluble inhibitors from steampretreated willow on enzymatic hydrolysis and ethanol fermentation. Enzyme and Microbial Technology, 19: 470-476. Palmqvist, E.; Hahn-Hägerdal, B. (2000). Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology, 74: 25-33. Palomero, F.; Morata, A.; Benito, S.; Calderón, F.; Suárez-Lepe, J.A. (2009). New genera of yeasts for over-lees aging of red wine. Food Chemistry, 112: 432–441. Pampulha, M.E.; Lourero-Dias, M.C. (1989). Combined effect of acetic acid, pH, and ethanol on intracellular pH of fermenting yeast. Applied Microbiology and Biotechnology, 31: 547-550. Panda, H. (2011). The complete book on wine production. Niir Project Consultancy Services. Delhi, India. Pag. 556. Paraggio, M.; Marchese, R.; Laurita, C.; Romano, P. (1997). Resistenza al rame in lieviti da vino di diversa origine geografica. In: Proc. 3º Conv. „Biodiversita‟ -Tecnologie-Qualita` ‟, Reggio Calabria (Italy). eds. Laruffa, pag. 581– 586. Pearce, D.; Sherman, F. (1999). Toxicity of copper, cobalt and nickel salts is dependent on histidine metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology, 181: 4774-4779. Peleg, H.; Noble, A.C. (1999). Effect of viscosity, temperature and pH on astringency in cranberry juice. Food Quality Preference, 10(4-5): 343-347. Perego, P.; Howell, S. (1997). Molecular mechanisms controlling sensitivity to toxic metal ions in yeast. Toxicology and Applied Pharmacology, 147: 312-318. Pereira, R.E.; Perdoná, G.D.; Zini, L.C.; Cury, M.B.; Ruzzene, M.A.; Martin, C.C.; Martinis, B.S. (2011). Relation between alcohol consumption and traffic violations and accidents in the region of Ribeirão Preto, São Paulo State. Forensic Science International, 207(1-3): 164-169. Pérez-Prieto, L.; López-Roca, J.; Gómez-Plaza, E. (2003). Differences in major volatile compounds of red wines according to storage length and storage conditions. Journal of Food Composition and Analysis, 16: 697–705. Petersson, A; Almeida, J.R.; Modig, T.; Karhumaa, K.; Hahn-Hägerdal, B.; Gorwa-Grauslund, M.F.; Lidén, G. (2006). A 5-hydroxymethyl furfural reducing enzyme encoded by the Saccharomyces cerevisiae ADH6 gene conveys HMF tolerance. Yeast, 23(6): 455-464. Petka, J.; Cacho, J.; Ferreira, V. (2003). Comparison of flavour perception routes in a synthetic wine model and with GC-Olfactometric data. In Oenologie2003, 7th International Symposium of Oenology (A. Lonvaud-Funel, ed.). Pag. 563-565, Lavoisier (Paris): Bourdeaux. Petrotos, K.B.; Lazarides, N.H. (2001). Osmotic concentration of liquid foods. Journal of Food Engineering, 49: 201– 205. Pickering, G.J. (2000). Low and reduced alcohol wine (a review). Journal of Wine Research, 2: 129-144. Piskorz, J.; Radlein, D.; Scott, D. (1986). On the mechanism of the rapid pyrolysis of cellulose. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 9: 121-137. Poni, S. (2006). Relación entre producción y calidad. Consecuencias del cambio climático en las prácticas vitícolas. V Foro Mundial del Vino. Logroño, España. 219 Bibliografía Pons, M.-N.; Chanel, S. (1991). Effect of heavy metals on volatiles production in alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 72(1): 61–63. Pretorius, I.S. (2000).Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking. Yeast, 16: 675-729. Prodanov, M.; Gonzalo, L.; Alonso Díaz, M.; Güell, C.; López, F.; Salinas, M. R. (2004). La técnica de separación por membranas semipermeables y su empleo en la industria vinícola. Tecnología del Vino, 16: 35-48. Quesada, J.; Villalón, M.; López-García, H.; López-Martínez, M. (1996). Influence of aging factors on the furanic aldehyde contents of matured brandies: aging markers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44: 1378-1381. Rapp, A.; Versini, G.; Ullemeyer, H. (1993). 2-aminoacetophenone: Causal component of „untypical aging flavour‟, „naphthalene note‟, „hybrid note‟ of wine. Vitis, 32: 61-62. Reazin, G. (1991). Chemical mechanisms of whiskey maturation. American Journal of Enology and Viticulture, 32: 283-289. Remize, F.; Roustan, J.L.; Sablayrolles, J.M.; Barre, P.; Dequin, S. (1999). Glycerol overproduction by engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains leads to substantial changes in by-product formation and to a stimulation of fermentation rate in stationary phase. Applied and Environmental Microbiology, 65: 143-149. Ribereau-Gayon J.; Ribereau-Gayon P.; Peynaud, E.; Sudraud, P. (1976). Science et technique du vin, Tomo I, Analyses et contrôles. Dunod (ed). París. Ribéreau-Gayon, P.; Dubourdieu, D.; Donèche, B.; Lonvaud, A. (2003a). Tratado de enología. Volumen I: Microbiología del vino, vinificaciones. Ed. Hemisferio Sur-Mundi-Prensa. Buenos Aires, Argentina. Ribéreau-Gayon, P.; Glories, Y.; Maujean, A.; Dubourdieu, D. (2003b). Tratado de enología. Volumen II: Química del vino, estabilización y tratamientos. Ed. Hemisferio Sur-Mundi-Prensa. Buenos Aires, Argentina. Richter, C.; Schweizer, M. (1997). Oxidative stress in mitochondria. In: Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses (Scandalios, J.G., Ed.), pag. 169-200, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. Rodriguez, C.; Shinyashiki, M.; Froines, J.; Yu, R.; Fukuto, J.; Cho, A. (2004). An examination of quinone toxicity using the yeast Saccharomyces cerevisiae model system. Toxicology, 201: 185–196. Rodriguez, C.; Fukuto, J.; Taguchi, K.; Froines, J.; Cho, A. (2005). The interactions of 9,10-phenanthrenequinone with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a potential site for toxic actions. Chemico-Biological Interactions, 155: 97–110. Rojas, V.; Gil, J.V.; Piñaga, F.; Manzanares, P. (2003). Acetate ester formation in wine by mixed cultures in laboratory fermentations. International Journal of Food Microbiology, 86: 181-188. Russel, J.B. (1992). Another explanation for the toxicity of fermentation acids at low pH: anion accumulation versus uncoupling. Journal of Applied Bacteriology, 73: 363-370. Samala, A.; Srinivasan, R.; Yadav, M.P.; Kim, T.J.; Prewitt, L. (2012). Xylo-oligosaccharides production by autohydrolysis of corn fiber separated from DDGS. BioResources, 7(3): 3038–3050. Santamaría, P.; Tenorio, C.; Sota, C.; Garijo, P.; Gutiérrez, A.R.; López, R. (2005). Influencia del pH de la uva en la calidad del vino y en la formación de aminas biógenas. Zubía Monográfico, 16-17: 69-82. Santoro, N.; Thiele, D. (1997). Oxidative stress responses in the yeast Saccharomyces cerevisiae, p. 171-211. In: Hohmann, S., and Mager, W. (ed.), Yeast stress responseses. Chapman & Hall. New York, USA. Sarais, I.; Manzano, M.; De Bertoldi, M.; Romandini, P.; Beltramini, M.; Salvato, B.; Rocco, G. (1994). Adaptation of a Saccharomyces cerevisiae strain to high copper concentrations. Biometals, 7(3): 221-226. 220 Bibliografía Savé, R.; Nadal, M.; Pla, E.; Lopez-Bustins, J.A.; de Herralde, F. (2010). Global change influence on vine physiolgy and wine quality in Priorat and Montsant (NE Spain). 28th International Horticultural Congress. Scanes, K.T.; Hohmann, S.; Prior, B.A. (1998). Glycerol production by the yeast Saccharomyces cerevisiae and its relevance to wine: a review. South African Journal of Enology and Viticulture, 19: 17-22. Scarpellino R.; Soukup, R.J. (1993). Key flavors from heat reactions of food ingredients. Flavor Science, 309-333. In: Acree, E.; Teranishi, R. (eds.). Flavor science, sensible principles and techniques. American Chemical Society. Washington D.C., USA. Schmidtke, L.M.; Blackman, J.W.; Agboola, S.O. (2012). Production technologies for reduced alcoholic wines. Journal of Food Science, 77(1): R25–R41. Schönwiese, C.D.; Rapp, J. (1997). Climate trend atlas of Europe – Based on observations 1891-1990. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Netherlands. Schultz, H.R. (2000). Climate change and viticulture: A European perspective on climatology, carbon dioxide and UVB effects. Australian Journal of Grape and Wine Research, 6: 2-12. Schultz, H.R. (2007) Réchauffement climatique: Conséquences probables sur les vignobles à l‟échelle mondiale. (Climate change: Probable consequences for world viticulture). Revue des Œnologues, 124: 7-9. Schwarz, K.J.; Boitz, L.I.; Methner, F.J. (2012a). Enzymatic formation of styrene during wheat beer fermentation is dependent on pitching rate and cinnamic acid content. Journal of the Institute of Brewing, 118: 280–284. Schwarz, K.J.; Stübner, R.; Methner, F.-J. (2012b). Formation of styrene dependent on fermentation management during wheat beer production. Food Chemistry, 134(4): 2121–2125. Scott, D. (1991). Production of hydrocarbons from biomass using the Waterloo fast pyrolysis process. DSS Contract 23283-8-6067, Renewable Energy Div., Energy Mines and Resources Canada. Ottawa, Canada. Seto, T.; Odagiri, M.; Imanari, M. (1991). Japan Official Patent Gazette, 91279342. Dec. 10, 1991. Shanmuganathan, A.; Avery, S.; Willetts, S.; Houghton, J. (2004). Copper-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae targets enzymes of the glycolytic pathway. FEBS Letters, 556: 253-259. Shenton, D.; Grant, C.M. (2003). Protein S-thiolation targets glycolysis and protein synthesis in response to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Journal, 374: 513-519. Shimada, K.; Kimura, E.; Yasui, Y.; Tanaka, H.; Matsushita, S.; Hagihara, H.; Nagakura, M.; Kawahisa, M. (1992). Styrene formation by the decomposition by Pichia carsonii of trans-cinnamic acid added to a ground fish product. Applied environmental microbiology, 58: 1577–1582. Sigma-Aldrich. Disponible en: http://terpconnect.umd.edu/~choi/MSDS/Sigma-Aldrich/1,4-BENZOQUINONE.pdf. Silva, J.; Williams, R. (1993). The biological chemistry of the elements. Clarendon Press. New York, USA. Singh N.P.; Khan, A. (1995). Acetaldehyde: Genotoxicity and cytotoxicity in human lymphocytes. Mutation Research, 337: 9-17. Smit, A.; du Toit, M. (2013). Evaluating the influence of malolactic fermentation inoculation practices and ageing on lees on biogenic amine production in wine. Food Bioprocess and Technology, 6: 198-206. Soufleros, E.; Barrios, M.L.; Bertrand, A. (1998). Correlation between the content of biogenic amines and the other wine compounds. American Journal of Enology and Viticulture, 49: 266-278. 221 Bibliografía Spillman, P.J.; Pollnitz, A.P.; Liacopoulos, D.; Pardon, K.H.; Sefton, M.A. (1998). Formation and degradation of furfuryl alcohol, 5-methylfurfuryl alcohol, vanillyl alcohol, and their ethyl ethers in barrel-aged wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46 (2): 657-663. Stearman, R.; Yuan, D.S.; Yamaguchi-Iwai, Y.; Klausner, R.D.; Dancis, A. (1996). A permease-oxidase complex involved in high-affinity iron uptake in yeast. Science, 271: 1552-1557. Stigliani, B.; Salomons, W. (1992). Pollutants and some not impossible environmental problems caused by climatic change. IIASA, Laxenburg, Austria, pag. 1-15. Stillman, M.J.; Presta, A. (2000). Characterizing metal ion interactions with biological molecules–the spectroscopy of metallothionein. In: Molecular Biology and Toxicology of Metals. Eds. Zalup R.K.; Koropatnick J. Pag. 1–33. London & New York: Taylor & Francis. ISBN 0-7484-0798-7. Stohs, S.J.; Bagchi, D. (1995). Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Radical Biology and Medicine, 18: 321–336. Stratford, M.; Plumridge, A.; Archer, D. (2007). Decarboxylation of sorbic acid by spoilage yeasts is associated with PAD1 gene. Applied and Environmental Microbiology, 73(20): 6534–6542. Strauss, M.L.A.; Jolly, N.P.; Lambrechts, M.G.; van Rensburg, P. (2001). Screening for the production of extracellular hydrolytic enzymes by non-Saccharomyces wine yeasts. Journal of Applied Microbiology, 91: 182-190. Suarez-Lepe, J.A.; Morata, A. (2012). New trends in yeast selection for winemaking. Trends Food Science and Technology, 23: 39-50. Sun, B.; Barradas, T.; Leandro, C.; Santos, C.; Spranger, I. (2008). Formation of new stable pigments from condensation reaction between malvidin-3-glucoside and (-)-epicatechin mediated by acetaldehyde: effect of tartaric acid concentration. Food Chemistry, 110: 344–351. Taherzadeh, M.J.; Niklasson, C.; Lidén, G. (1997). Acetic acid-friend or foe in anaerobic batch conversion of glucose to ethanol by Saccharomyces cerevisiae. Chemical Engineering Science, 52: 2653-2659. Taherzadeh, M.J.; Gustaffson, L.; Niklasson, C.; Lidén, G. (1999). Conversion of furfural on aerobic and anaerobic batch fermentation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bioscience and Bioengineering, 87(2): 169174. Taherzadeh, M.J.; Gustaffson, L.; Niklasson, C.; Lidén, G. (2000). Inhibition effects of furfural on aerobic batch cultivation of Saccharomyces cerevisiae growing on ethanol and/or acetic acid. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90: 374-380. Ten Brink, B.; Damink, C. (1990). Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal on Food Microbiology, 11: 73-84. Towey, J.; Waterhouse, A. (1996). The extraction of volatile compounds from French and American oak barrels in Chardonnay during three successive vintages. American Journal of Enology and Viticulture, 47(2): 163-172. Tran, A.V.; Chambers, R.P. (1986). Ethanol fermentation of red oak acid prehydrolysate by the yeast Pichia stipitis CBS 5776. Enzyme and Microbial Technology, 8: 439-444. Tran, A.V.; Chambers, R.P. (1986). Lignin and extractives derived inhibitors in the 2,3-butanediol fermentation of mannose-rich prehydrolysates. Applied Microbiology and Biotechnology, 23: 191-197. Tsachaki, M.; Linforth, R.S.; Taylor, A.J. (2005). Dynamic headspace analysis of the release of volatile organic compounds from ethanolic systems by direct APCI-MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 8328-8333. Tsachaki, M.; Linforth, R.S.; Taylor, A.J. (2009). Aroma release from wines under dynamic conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(15): 6976-81. 222 Bibliografía Underwood, G.L.; Stradal, J.A. (1994). Browning materials derived from the pyrolysis of sugars and starches. U.S. Pat. No. 5,292,541, issued Mar. 8, 1994. Underwood, G.L.; Stradal, J.A. (1995). Flavoring and browning materials by pyrolysis of sugars and starches. U.S. Pat. No. 5,397,582, issued Mar. 14, 1995. Verduyn, C.; Postma, E.; Scheffers, W.A.; van Dijken, J.P. (1992). Effect of benzoic acid on metabolism fluxes in yeasts: continuous culture study o the regulation respiration and alcoholic fermentation. Yeast, 8: 501-517. Viana, F.; Belloch, C.; Vallés, S.; Manzanares, P. (2011). Monitoring a mixed starter of Hanseniaspora vineae Saccharomyces cerevisiae in natural must: impact on 2-phenylethyl acetate production. International Journal of Food Microbiology, 151: 235-240. Villa, G.P.; Bartoli, R.; López, R.; Guerra, M.; Enrique, M.; Penas, M.; Rodriquez, E.; Redondo, D.; Iglesias, I.; Diaz, M. (1992). Microbial transformation of furfural to furfuryl alcohol by Saccharomyces cerevisiae. Acta Biotechnologica, 12: 509-512. Villavecchia, V.; Eigenmann, G. (1982). Nuovo dizionario di merceologia e chimica applicata. Volume primo. HOEPLI Editore. Milano, Italia. Vitasari, C.R. (2010). Renewable glycolaldehyde isolation from pyrolysis oil by reactive extraction with primary amines. 10th Netherlands Process Technology Symposium–NPS-10. Veldhoven. The Netherlands. Waddell, W.J.; Cohen, S.M.; Feron, V.J.; Goodman, J.I.; Marnett, L.J.; Portoghese, P.S.; Rietjens, I.M.C.M.; Smith, R.L.; Adams, T.B.; Lucas Gavin, C.; McGowen, M.M.; Williams, M.C. (2007). GRAS Flavoring Substances 23. The 23rd publication by the FEMA Expert Panel. Walker, G.; Maynard, A. (1997). Accumulation of magnesium ions during fermentative metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 18: 1-3. Walton, N.J.; Mayer, M.J.; Narbad, A. (2003). Vanillin. Phytochemistry, 63(5): 505-15. Warczok, J. (2005). Concentration of osmotic dehydration solutions using membrane separation processes. Tesis doctoral. Universidad Rovira i Virgili. Tarragona, España. Warczok, J.; Ferrando, M.; López, F.; Güell, C.; Gieirszewska, M.; Kujawski, W. (2005). Concentración de soluciones de azúcar mediante procesos de separación por membranas: pervaporación y ósmosis directa. Alimentación. Equipos y Tecnología, 203: 74-79. Warczok, J.; Ferrando, M.; López, F.; Pihlajamäki, A.; Güell, C. (2007). Reconcentration of spent solutions from osmotic dehydration using direct osmosis in two configurations. Journal of Food Engineering, 80: 317-326. Webb, A.D.; Ingraham, J.L. (1963). Fusel oil. Advances in Applied Microbiology, 5: 317–353. Webb, A.D.; Kepner, R.E.; Galetto, W.G. (1964). Comparison of the aromas of flor sherry, baked sherry and submerged-culture sherry. American Journal of Enology and Viticulture, 15: 1-10. White, C.; Gadd, G.M. (1986). Uptake and cellular distribution of copper, cobalt and cadmium in strains of Saccharomyces cerevisiae cultured on elevated concentrations of these metals. FEMS Microbiology Ecology, 38: 277–283. Xin, L.; Kazuchika, Y.; Natthanon, P.; Shiro, S. (2009). Two-step hydrolysis of Japanese beech as treated by semiflow hot compressed water. Journal of Wood Science, 55: 367–375. Yarrow, D. (1998). Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: Kurtzman C.P.; Fell, J.W. (Eds.). The yeast. A taxonomic study (4th ed.). Elsevier, The Netherlands. Pag. 77–100. Yu, Z.H.; Gu, Z.P.; Zhang, X.D.; Wan, F. (1987). 4-Bromo-7-hydroxyindan oxime - a new potent spermicidal agent. International Journal of Andrology, 10: 741-746. 223 Bibliografía Zaldivar, J.; Martinez, A.; Ingram, L.O. (1999). Effect of selected aldehydes on the growth and fermentation of ethanologenic Escherichia coli LY01. Biotechnology and Bioengineering, 65: 24-33. Zaldivar, J.; Ingram, L.O. (1999). Effect of organic acids on the growth and fermentation of ethanologenic Escherichia coli LY01. Biotechnology and Bioengineering, 66: 203-210. Zamora, F. (2003). Elaboración y crianza del vino tinto; aspectos científicos y prácticos. Editorial Mundi-Prensa; AMV Ediciones, Madrid. Zamora, F. (2005). Los aromas que el roble aporta al vino; influencia del grado de tostado de las duelas, Enólogos, 35: 25-30. Zhang, L.; Jia, X.; Feng, Y.; Peng, X.; Zhang, Z.; Zhou, W.; Zhang, Z.; Ma, F.; Liu, X.; Zheng, Y.; Yang, P.; Yuan, Z. (2011). Plasma membrane proteome analysis of the early effect of alcohol on liver: implications for alcoholic liver disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 43(1):19-29. Zoecklein, B.W.; Fugelsang, K.C.; Gump, B.H.; Nury, F.S. (1999). Wine analysis and production. Chapman & Hall. New York, USA. 224 Apéndices APÉNDICES 225 Apéndices 226 Apéndices APÉNDICE A. Cinética fermentativa de diferentes ensayos experimentales 1,6 Pérdida de peso (g) 1,4 pH 3,2/18 ºC pH 3,2/18 ºC (PF) pH 3,2/18 ºC (X3) pH 3,8/18 ºC pH 3,8/18 ºC (PF) pH 3,8/18 ºC (X3) pH 3,8/25 ºC pH 3,8/25 ºC (PF) pH 3,8/25 ºC (X3) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Día Figura A.1. Cinética fermentativa de la levadura 7VA en el medio sintético con 14,5% de GAP. “PF”: adición de 50 mg/L a PF 8. “X3”: adición de 10 mg/L de furfural cada tres días hasta alcanzar 50 mg/L (n = 4). Furfural (mg/l) 1,2 Pérdida de peso (g) 1,0 7VA (0) 7VA (50) 7VA (200) AWRI (0) AWRI (50) AWRI (200) CM15 (0) CM15 (50) CM15 (200) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Día Figura A.2. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural (mg/l) al alcanzar PF = 8 en el medio sintético con 15% de GAP (n = 4). 227 Apéndices 2,0 Furfural (mg/l) Pérdida de peso (g) 1,6 7VA-0 7VA-50 7VA-100 AWRI-0 AWRI-50 AWRI-100 1,2 0,8 0,4 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Día Figura A.3. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar furfural al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con 15% de GAP (n = 4). o -Vainillina (mg/l) 2,0 7VA-(0) 7VA-(20) 1,6 7VA-(50) Pérdida de peso (g) 7VA-(100) 1,2 7VA-(50F+V) AWRI-(0) AWRI-(20) 0,8 AWRI-(50) AWRI-(100) 0,4 AWRI-(50F+V) 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Día Figura A.4. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y a una dosis combinada de 50 mg/l de o-vainillina y 50 mg/l de furfural (50F+V), en un medio a base de mosto concentrado con 15% de GAP (n = 4). 228 Apéndices 0,25 Ácido cinámico (mg/l) - 11,5 % GAP 7VA-(0) AWRI-(0) Pérdida de peso (g) 0,20 7VA-(100) AWRI-(100) 7VA-(200) AWRI-(200) 0,15 0,10 0,05 0,00 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Día 0,20 Ácido cinámico (mg/l) - 14,4 % GAP 7VA-(0) AWRI-(0) Pérdida de peso (g) 0,15 7VA-(100) AWRI-(100) 7VA-(200) AWRI-(200) 0,10 0,05 0,00 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Día 36 Figura A.5. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796, a diferentes dosis de ácido trans-cinámico en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % GAP (n = 4). Glicolaldehído (mg/l) Pérdida de peso (g) 0,5 0,4 7VA-0 7VA-100 7VA-200 AWRI-0 AWRI-100 AWRI-200 0,3 0,2 0,1 0,0 0 4 8 12 16 20 24 28 Día Figura A.6. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP (n = 4). 229 Apéndices Cobre (mg/l) 0,4 Pérdida de peso (g) 12%-(0) 12%-(5) 0,3 12%-(10) 12%-(50) 0,2 0,1 0,0 0 4 8 12 16 20 24 28 Día Cobre (mg/l) 0,4 14%-(0) Pérdida de peso (g) 14%-(5) 0,3 14%-(10) 14%-(50) 0,2 0,1 0,0 0 4 8 12 16 20 24 28 Día Figura A.7. Cinética fermentativa de la levadura 7VA a diferentes dosis de cobre (mg/l) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 14 % GAP (n = 4). 230 Apéndices APÉNDICE B. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con furfural B.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 12,5 % v/v de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de furfural ---------------------------------------------------------------------------------------------------Existen diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------Furf_50 Furf_20 Furf_10 Furf_5 Furf_1 Furf_0 4 4 4 4 4 4 11,8 11,8250 11,8375 12,0 12,1 12,2125 X X X X X X -------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s) 12,3 Mean 12,2 12,1 12 11,9 11,8 11,7 Furf_0 Furf_1 Furf_5 Furf_10 Furf_20 Furf_50 B.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en el medio sintético con 15 % de GAP ---------------------------------------------------------------------------------------------------No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para las levaduras 7VA, Distinction y AWRI796 con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) Means and Standard Errors (internal s) 15 15,2 14,5 Mean 15 14 13,5 13 14,9 12,5 12 14,8 VA7_0 VA7 10 DIST_0 VA7 50 Means and Standard Errors (internal s) 15 14,6 Mean Mean 15,1 14,2 13,8 13,4 13 AWRI_0 AWRI 10 231 AWRI 50 DIST 10 DIST 50 Apéndices B.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 14,5 % de GAP con diferentes cepas de S. cerevisiae. 10 mg/l se adicionó a PF = 8, y 50 mg/l se adicionó a razón de 10 mg/l cada tres días hasta alcanzar los 50 mg/l. Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de adición de furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------50 4 13.9 X 10 4 14.125 X 0 4 14.175 X -------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s) 14.2 Etanol % 14.15 14.1 14.05 14 13.95 13.9 0 10 50 Levadura Distinction Col_7 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de adición de furfural para la levadura Distinction, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------10 4 13.77 X 50 4 13.82 X 0 4 14.1 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14.2 Etanol % 14.1 14 13.9 13.8 13.7 13.6 0 10 50 Col_7 Levadura AWRI796 No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de adición de furfural con la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%. 232 Apéndices Means and Standard Errors (internal s) 14.2 Etanol % 14 13.8 13.6 13.4 13.2 0 10 50 Col_7 B.4. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 14,5 % de GAP a diferentes pHs y temperaturas con la levadura 7VA. “PF”: 50 mg/l de furfural a PF = 8. “X3”: 10 mg/l de furfural cada tres días hasta alcanzar 50 mg/l. 18 ºC y pH 3,2 No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 18 ºC y pH 3,2 con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Mean s and S tand ard Errors (i nterna l s) 14, 14 Me a n 14, 1 14, 06 14, 02 13, 98 13, 94 13, 9 _32_0 _32_PF _32_X3 18 ºC y pH 3,8 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 18 ºC y pH 3,8 con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------_38_PF 4 14,1 X _38_X3 4 14,1 X _38_0 4 14,35 X -------------------------------------------------------------------------------- Mean s and Stand ard Errors (i nterna l s) 14, 4 Me a n 14, 3 14, 2 14, 1 14 _38_0 _38_PF 233 _38_X3 Apéndices 25 ºC y pH 3,8 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 25 ºC y pH: 3,8 para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. ------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------_38X3 4 14,19 X _38PF 4 14,22 X _380 4 14,3025 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14, 34 Me a n 14, 3 14, 26 14, 22 14, 18 14, 14 14, 1 _380 _38PF _38X3 B.5. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar furfural al inicio de las fermentaciones en el medio sintético con 15 % de GAP Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------_7VA_50 4 14,5667 X _7VA_100 4 14,5875 X _7VA_200 4 14,675 X _7VA_0 4 14,825 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14,9 Mean 14,8 14,7 14,6 14,5 14,4 _7VA_0 _7VA_50 _7VA_100 _7VA_200 Levadura AWRI 796 No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%. 234 Apéndices Means and Standard Errors (internal s) 13,3 Mean 13,1 12,9 12,7 12,5 AWRI_0 AWRI_50 AWRI_100 AWRI_200 B.6. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico tras las fermentar el medio sintético con 15 % de GAP con diferentes concentraciones de furfural dosificado a PF = 8. No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para las levaduras 7VA y AWRI796, mientras que para la levadura CM15 si existen diferencias significativas, con un nivel de confianza del 95%. Levaduras 7VA y AWRI796 Means and Standard Errors (internal s) Means and Standard Errors (internal s) 13,6 14,9 13,5 Mean 14,7 14,6 13,4 13,3 13,2 13,1 13 14,5 VA7_0 VA7_50 AWRI796_0 VA7_200 AWRI796_50 Levadura CM15 ---------------------------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------CM15_200 4 12,8 X CM15_50 4 13,0375 X CM15_0 4 13,3267 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 13,5 13,3 Mean Mean 14,8 13,1 12,9 12,7 CM15_0 CM15_50 235 CM15_200 AWRI796_200 Apéndices B.7. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico tras las fermentar el medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP a diferentes dosis iniciales de furfural. Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------50 4 14.5933 X 0 4 14.72 X 100 4 15.045 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 15.3 Col_2 15.1 14.9 14.7 14.5 0 50 100 Col_1 Levadura AWRI796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de furfural para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------100 4 13.615 X 50 4 13.6833 X 0 4 14.3233 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14.4 Col_2 14.2 14 13.8 13.6 13.4 0 50 Col_1 236 100 Apéndices APÉNDICE C. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con o-vainillina C.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar o-vainillina al inicio de las fermentaciones en medio sintético con 15 % de GAP Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 14,8 Mean 14,6 14,4 14,2 14 VA7_0 VA7_20 VA7_50 Levadura AWRI796 Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------AWRI796_50 4 12,7333 X AWRI796_20 4 13,0167 XX AWRI796_0 4 13,2667 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 13,4 Mean 13,2 13 12,8 12,6 AWRI796_0 AWRI796_20 237 AWRI796_50 Apéndices C.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 12,5 % de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación de o-vainillina y furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) Etanol % 12.8 12.6 12.4 12.2 12 0 20 50 5050 o Vainillina C.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación de o-vainillina y furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------100 4 13.605 X 0 4 14.72 X 50 4 14.9625 X 5050 4 14.98 X 20 4 15.0333 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 15.4 Col_2 15 14.6 14.2 13.8 13.4 13 0 20 50 Col_1 238 100 5050 Apéndices Levadura AWRI796 Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------100 4 13.1967 X 5050 4 13.6975 XX 50 4 13.8675 XX 20 4 13.9533 XX 0 4 14.3233 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14.5 Col_2 14.2 13.9 13.6 13.3 13 0 20 50 Col_1 239 100 5050 Apéndices APÉNDICE D. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con ácido trans-cinámico D.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar ácido trans-cinámico en mosto tinto a 11,5 y 14,4 % de GAP 11,5 % GAP: Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 11.15 Alcohol 11.12 11.09 11.06 11.03 11 _7VA12-0 _7VA12-100 _12 GAP 11,5 % GAP: Levadura AWRI 796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------AWRI12-100 4 10.92 X AWRI12-0 4 11.2233 X -------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s) 11.3 Alcohol 11.2 11.1 11 10.9 10.8 AWRI12-0 AWRI12-100 14.3 14.1 14.2 13.9 Alcohol % Alcohol _12 GAP 14,4 % GAP: Levaduras 7VA y AWRI 796 No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) Means and Standard Errors (internal s) 14.1 14 13.7 13.5 13.9 13.3 13.8 _7VA15-0 AWRI15-0 _7VA15-100 AWRI15-100 _15 GAP _15 GAP 240 Apéndices D.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar ácido trans-cinámico al inicio de las fermentaciones en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP 12 % GAP: Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------_7VA12-0 4 11.052 X _7VA12-100 4 11.2227 XX _7VA12-50 4 11.2875 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) Alcohol 11.4 11.3 11.2 11.1 11 _7VA12-0 _7VA12-100 _7VA12-50 _10 Baume 12 % GAP: Levadura AWRI 796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------AWRI12-50 4 11.3238 X AWRI12-0 4 11.5 X -------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s) Alcohol 11.6 11.5 11.4 11.3 11.2 AWRI12-0 AWRI12-50 _10 Baume 15 % GAP: Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------_7VA15-0 4 14.6255 X _7VA15-50 4 14.6772 X _7VA15-100 4 14.977 X -------------------------------------------------------------------------------- 241 Apéndices Means and Standard Errors (internal s) 15.1 % Alcohol 15 14.9 14.8 14.7 14.6 14.5 _7VA15-0 _7VA15-100 _7VA15-50 _14 Baume 15 % GAP: Levadura AWRI 796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------AWRI15-50 4 14.3545 X AWRI15-0 4 14.6268 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) % Alcohol 14.7 14.6 14.5 14.4 14.3 14.2 AWRI15-0 AWRI15-50 _14 Baume 242 Apéndices APÉNDICE E. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con glicolaldehído E.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de glicolaldehído para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) %v/v etanol 14.1 13.9 13.7 13.5 13.3 13.1 12.9 7VA-0 7VA-100 7VA-200 Glicolaldehído (g/L) Levadura AWRI796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de glicolaldehído para la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------200 4 13.1167 X 100 4 13.7833 XX 0 4 13.88 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 14.2 Etanol 14 13.8 13.6 13.4 13.2 13 0 100 Col_1 243 200 Apéndices E.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 14,3 % de GAP No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de glicolaldehído para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 14.2 14 14.1 13.9 Etanol 14 13.9 13.8 13.8 13.7 13.6 13.7 13.5 13.6 0 0 100 7VA Col_1 100 Col_1 AWRI796 E.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con la levadura 7VA al dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 12 % de GAP No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de glicolaldehído para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 11.8 11.7 Etanol Etanol Means and Standard Errors (internal s) 11.6 11.5 11.4 11.3 11.2 0 100 Col_1 244 Apéndices APÉNDICE F. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con p-benzoquinona F.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar p-benzoquinona al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado 12 % GAP No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de p-benzoquinona para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 11 10.8 10.7 Etanol 11.1 10.5 10.2 10.4 10.1 9.8 9.9 9.5 9.6 0 20 0 100 7VA Col_1 20 100 AWRI796 Col_1 15 % GAP: Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de p-benzoquinona para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 13.7 13.5 Etanol Ethanol Means and Standard Errors (internal s) 13.3 13.1 12.9 0 20 100 Col_1 15 % GAP: Levadura AWRI 796 Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de p-benzoquinona para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------100 4 11.7033 X 20 4 12.2175 XX 0 4 12.9967 X -------------------------------------------------------------------------------- 245 Apéndices Means and Standard Errors (internal s) 13.4 Etanol 13 12.6 12.2 11.8 11.4 11 0 20 100 Col_1 F.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar p-benzoquinona al inicio de las fermentaciones en mosto tinto No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de p-benzoquinona para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 14.1 14 14 13.9 Etanol Etanol Means and Standard Errors (internal s) 13.9 13.8 13.8 13.7 13.6 13.7 13.5 13.6 0 20 0 50 20 Col_1 AWRI796 Col_1 7VA 246 50 Apéndices APÉNDICE G. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para los ensayos con cobre G.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA al dosificar cobre al inicio de las fermentaciones en el medio sintético 12 % v/v GAP: Levadura 7VA No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de cobre para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 11.1 Etanol 10.9 10.7 10.5 10.3 10.1 0 5 Col_1 14% v/v GAP: Levadura 7VA Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de cobre para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------5 4 11.794 X 0 4 12.7927 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 13 Etanol 12.6 12.2 11.8 11.4 11 0 5 Col_1 247 Apéndices G.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con la levadura 7VA en medios a base de mosto concentrado a diferentes dosis iniciales de cobre y combinación de cobre (5 mg/l) y furfural (50 y 100 mg/l) 12 % v/v GAP Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------7 4 9.525 X 5 4 9.9675 XX 10 4 10.47 XX 5+F50 4 10.5033 XX 5+F100 4 10.8 XX 0 4 10.995 X -------------------------------------------------------------------------------- Means and Standard Errors (internal s) 11.4 Etanol 11 10.6 10.2 9.8 9.4 9 +F100 +F50 0 10 5 7 Col_1 14% v/v GAP No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 13.4 Etanol 13 12.6 12.2 11.8 11.4 11 +F100 +F50 0 10 Col_1 248 5 7 Apéndices G.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones iniciales de cobre para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%. Means and Standard Errors (internal s) 14.1 Etanol 14 13.9 13.8 13.7 13.6 13.5 0 10 5 7 7VA Col_1 Means and Standard Errors (internal s) Etanol % 14.3 14.1 13.9 13.7 13.5 0 5 7 AWRI796 Col_1 249 10 Apéndices 250 Apéndices APÉNDICE H. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para la producción de glicerina Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de glicerina por la levadura 7VA en fermentaciones de mosto tinto de variedad Tempranillo con 10 y 14,1 % de GAP. Los bloqueadores utilizados fueron: F : Furfural V : o-Vainillina G : Glicolaldehído Q : p-Benzoquinona C : Cobre Cn : Ácido trans-cinámico H.1 Producción de glicerina en mosto tinto con 10 % GAP Existen diferencias estadísticamente significativas en la producción de glicerina con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%. 4.7 4.4 4.1 3.8 251 V50 V100 Q50 Q20 G200 G100 F50 F100 Control Cn50 Cn100 3.2 C5 3.5 C10 Glicerina 10% GAP Means and Standard Errors (internal s) Apéndices H.2. Producción de glicerina en mosto tinto con 14,1 % GAP Existen diferencias estadísticamente significativas en la producción de glicerina con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95,0 %. 7.3 6.9 6.5 6.1 252 V50 V100 Q50 Q20 G200 G100 F50 F100 Control Cn50 Cn100 5.3 C5 5.7 C10 Glicerina 14% GAP Means and Standard Errors (internal s) Apéndices APÉNDICE I. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para la producción de compuestos volátiles fermentativos Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA en fermentaciones de mosto tinto de la variedad Syrah con 14,3 % de GAP y en mosto tinto de la variedad Tempranillo con 10 y 14,1 % de GAP. Los bloqueadores utilizados fueron: F : Furfural V : o-Vainillina G : Glicolaldehído Q : p-Benzoquinona C : Cobre Cn : Ácido trans-cinámico I.1. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Syrah con 14,3 % GAP 253 Apéndices 254 Apéndices I.2. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Tempranillo con 10 % GAP 255 Apéndices 256 Apéndices I.3. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Tempranillo con 14,1 % GAP 257 Apéndices 258 Apéndices APÉNDICE J. Cromatogramas de los análisis realizados para estudiar la conversión enzimática del furfural y o-vainillina Alcohol vainíllico o-Vainillina 3,4-DMF Alcohol furfurílico Furfural Vainillina J.1. Análisis realizado a las 30 horas (furfural) y 48 horas (o-vainillina) de fermentación a partir de la dosificación al inicio de las fermentaciones Patrones externos 400000 Furfural: 50 mg/l 200000 Furfural: 100 mg/l 14 16 18 20 Vainillina 3,4-DMF Alcohol furfurílico Furfural 22 24 Alcohol vainíllico 12 o-Vainillina 10 Alcohol o-vainíllico Min. Patrones externos 300000 200000 o-Vainillina: 50 mg/l 100000 o-Vainillina: 100 mg/l Min. 10 12 14 16 259 18 20 22 24 Apéndices Alcohol vainíllico Vainillina 3,4-DMF Furfural Alcohol furfurílico o-Vainillina J.2. Análisis cromatográfico realizado a las 48 horas a partir de la dosificación de furfural y o-vainillina al finalizar la fase de crecimiento estacionario Patrones externos 400000 Furfural: 50 mg/l 200000 Furfural: 100 mg/l 14 16 18 20 18 20 Vainillina 3,4-DMF Alcohol furfurílico Furfural 22 24 Alcohol vainíllico 12 o-Vainillina 10 Alcohol o-vainíllico Min. Patrones externos 300000 o-Vainillina: 50 mg/l 200000 o-Vainillina: 100 mg/l 100000 Min. 10 12 14 16 260 22 24 Apéndices APÉNDICE K. Cromatogramas de los análisis realizados para estudiar la conversión enzimática del ácido trans-cinámico Alcohol vainíllico Ácido trans-cinámico Vainillina 3,4-DMF Estireno Alcohol furfurílico Furfural o-Vainillina Análisis cromatográfico realizado a las 48 y 72 horas a partir de la dosificación de 100 mg/l de ácido trans-cinámico en mosto tinto con 14,4 % de GAP con la levadura 7VA Patrones externos 72 horas 400000 200000 48 horas Min. 4 6 8 10 12 14 261 16 18 20 22 24 26