MIREN EDURNE AGUIRIANO LABANDIBAR

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
Uso de marcadores moleculares para la racionalización y evaluación de
la calidad en las colecciones de Recursos Fitogenéticos de trigo
TESIS DOCTORAL
Autora:
Miren Edurne Aguiriano Labandibar
Ingeniera Agrónoma
Directores:
Magdalena Ruiz Valcárcel
Doctora Ingeniero Agrónomo
José María Carrillo Becerril
Doctor en Ciencias Biológicas
Madrid, 2012
(D-15)
Tribunal nombrado por el Magfco. Y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de
Madrid, el día
de
de 2012
Presidente:_______________________________________________________________
Secretario: _______________________________________________________________
Vocal: __________________________________________________________________
Vocal: __________________________________________________________________
Vocal: __________________________________________________________________
Suplente: ________________________________________________________________
Suplente: ________________________________________________________________
Realizado el acto de defensa y lectura de Tesis el día
En la E.T.S. I / Facultad
de
de 2012
EL PRESIDENTELOS VOCALES
EL SECRETARIO
III
Madrid, 2012
DÑA. MAGDALENA RUIZ VALCÁRCEL, Investigadora Titular del Centro Nacional
de Recursos Fitogeneticos del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria
y Alimentaria.
D. JOSÉ MARÍA CARRILLO BECERRIL, Catedrático del Departamento de
Biotecnología de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la
Universidad Politécnica de Madrid.
CERTIFICAN que la Tesis Doctoral “Uso de marcadores moleculares para la
racionalización y evaluación de la calidad en las colecciones de Recursos
Fitogenéticos de trigo“, ha sido realizada bajo su dirección por la Ingeniera Agrónoma
Miren Edurne Aguiriano Labandibar.
Y para que conste a todos los efectos de la interesada expedimos el presente certificado
en Madrid, a …… de junio de 2012.
Fdo. José María Carrillo Becerril
Fdo. Magdalena Ruiz Valcárcel
V
A mi familia
A Teddy, a mis hijas Enara y Marta
VII
AGRADECIMIENTOS
Muchas gracias a todos los que de alguna manera me han ayudado en el
desarrollo de esta tesis doctoral:
Quisiera expresar mi agradecimiento de manera especial a mis directores de
tesis, Magdalena Ruiz Valcárcel y José María Carrillo Becerril. Sin su trabajo,
orientación y apoyo no hubiera sido posible.
A todo el personal de la Unidad de Genética de Agrónomos, tanto profesores
como técnicos, y compañeros, que me han enseñado, ayudado, aconsejado…; Marta
Rodríguez-Quijano, Francisco Vázquez, Elena Benavente, Juan Orellana, Luis Larraya,
Patricia Giraldo, Carmen Jalvo, José Rodríguez, Cristina Lladó, Regina de Lucas, Jorge
Rubianes, Javier Martín, Marta Cifuentes, Laura Montero.
A todo el personal del Centro de Recursos Fitogenéticos, que me han ayudado
con los trabajos de caracterización, de campo, de laboratorio, me han facilitado las
semillas, me han apoyado y animado; Charo Fité, Angelina Ruano, Paco Berrio, José
Ramón Larreina, Vicente Mogarra, Agustín Meana, Elena Marañón, Dolores Gómez,
Carlos Laína, Marta Guerrero, Sonia Sánchez, Alberto Peluzzo, Almudena Alonso,
Susana Berlinches, Lucía De la Rosa, Isaura Martín, Luis Ayerbe, Federico Varela,
Celia De la Cuadra. Y a los que llegaron después……………a todos.
También quería agradecer al Instituto Nacional de Investigación y Teconología
Agraria y Alimentaria la beca predoctoral y el proyecto de investigación RF-01-021
concedidos, con los que se ha financiado esta tesis.
IX
RESUMEN
Esta tesis tiene dos objetivos generales: el primero, analizar el uso de proteínas
del endospermo y SSRs para la racionalización de las colecciones de trigo, y el
segundo, estudiar la influencia de las proteínas del endospermo, del año de cultivo y del
abonado nitrogenado en la calidad en un grupo de variedades locales españolas. Dentro
del primer objetivo, se estudió la diversidad genética de la colección de Triticum
monococcum L. (escaña menor), y de una muestra de la colección de Triticum turgidum
L. (trigo duro) del CRF-INIA, con 2 y 6 loci de gliadinas, y 6 y 24 SSRs, para la escaña
menor y el trigo duro, respectivamente. Ambas colecciones presentaron una gran
diversidad genética, con una gran diferenciación entre las variedades y pequeña dentro
de ellas. Los loci de gliadinas mostraron una gran variabilidad, siendo los loci Gli-2 los
más útiles para distinguir variedades. En la escaña menor, las gliadinas presentaron
mayor poder de discriminación que los SSRs; aunque en trigo duro los SSRs
identificaron más genotipos. El número de alelos encontrado fue alto; 24 y 38 en
gliadinas, y 29 y 203 en SSRs, en escaña menor y trigo duro, respectivamente. En trigo
duro, se identificaron 17 alelos nuevos de gliadinas lo que demuestra que el
germoplasma español es muy singular. En ambas especies, se detectaron asociaciones
entre la variación alélica en prolaminas y el origen geográfico y filogenético de las
variedades.
La utilidad de las proteínas (6 loci de gliadinas, 2 loci de gluteninas y proteína
total) y de los SSRs (24 loci) para verificar duplicados, y analizar la variabilidad intraaccesión, se estudió en 23 casos de duplicados potenciales de trigo duro. Los resultados
indicaron que tanto los biotipos como las accesiones duplicadas mostraban el mismo
genotipo en gliadinas, pocas diferencias o ninguna en las subunidades de gluteninas
HMW y proteína total, y diferencias en menos de tres loci de SSRs. El mismo resultado
se obtuvo para los biotipos de la colección de T. monococcum. Sin embargo, las
discrepancias observadas en algunos casos entre proteínas y SSRs demostraron la
utilidad del uso conjunto de ambos tipos de marcadores. Tanto las proteínas como los
SSRs mostraron gran concordancia con los caracteres agro-morfológicos, especialmente
cuando las diferencias entre los genotipos eran grandes. Sin embargo, los caracteres
agro-morfológicos fueron menos discriminantes que los marcadores moleculares.
Para el segundo objetivo de la tesis, se analizó la variación alélica en siete loci
de prolaminas relacionados con la calidad en trigo duro: Glu-A1 y Glu-B1 de gluteninas
XI
HMW, Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 de gluteninas B-LMW, y Gli-A1 y Gli-B1 de
gliadinas. La submuestra analizada incluía variedades locales de todas las provincias
españolas donde se ha cultivado tradicionalmente el trigo duro. Todos los loci, excepto
el Glu-B2, mostraron gran variabilidad genética, siendo los Glu-3 los más polimórficos.
En total, se identificaron 65 alelos, de los que 29 eran nuevos, que representan una
fuente importante de variabilidad genética para la mejora de la calidad. Se detectaron
diferencias en la composición en prolaminas entre la convar. turgidum y la zona norte, y
la convar. durum y la zona sur; el genotipo Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 fue muy común
en la convar. turgidum, mientras que el Glu-B3a - Gli-B1c, asociado con mejor calidad,
fue más frecuente en la convar. durum. En la convar. turgidum, se observó mayor
variabilidad que en la convar. durum, principalmente en los loci Glu-B1 y Glu-B3, lo
que indica que esta convariedad puede ser una fuente valiosa de nuevos alelos de
gluteninas.
Esta submuestra fue evaluada para calidad (contenido en proteína, P, y test de
sedimentación, SDSS) con dos dosis de abonado nitrogenado (N), y en dos años
diferentes. No se detectaron interacciones Variedad × Año, ni Variedad × N en la
calidad. Para la P, los efectos ambientales (año y N) fueron mayores que el efecto de la
variedad, siendo, en general, mayor la P con dosis altas de N. La variedad influyó más
en el test SDSS, que no se vio afectado por el año ni el N. El aumento del contenido en
proteína no influyó significativamente sobre la fuerza del gluten estimada con el SDSS.
Respecto a la influencia de las prolaminas en la fuerza del gluten, se confirmó la
superioridad del Glu-B3a; aunque también se detectó una influencia alta y positiva de
los alelos nuevos Glu-A3new-1, y Glu-B3new-6 y new-9. La no correlación entre el
rendimiento (evaluado en un trabajo anterior) y la P, en las variedades adaptadas a bajo
N, permitió seleccionar cuatro variedades locales con alto rendimiento y buena fuerza
del gluten para producción con bajo N.
XII
SUMMARY
There are two main objectives in this thesis: The first, to analyse the use of
endosperm proteins and SSRs to rationalize the wheat collections, and the second, to
study the influence on quality of endosperm proteins, year and nitrogen fertilization in a
group of Spanish landraces. For the first objective, we studied the genetic diversity of
the collection of Triticum monococcum L. (cultivated einkorn), and of a sample of the
collection of Triticum turgidum L. (durum wheat) maintained at the CRF-INIA. Two
and 6 gliadin loci, and 6 and 24 SSRs, were used for einkorn and durum wheat,
respectively. Both collections possessed a high genetic diversity, being the
differentiation large between varieties and small within them. Gliadin loci showed great
variability, being the loci Gli-2 the most useful for distinguish among varieties. In
einkorn, the gliadins showed higher discrimination power than SSRs; although SSRs
identified more genotypes in durum wheat. Large number of alleles were found; 24 and
38 in gliadins, and 29 and 203 in SSRs, for einkorn and durum wheat, respectively. In
durum wheat, 17 new alleles of gliadins were identified, which indicate that Spanish
durum wheat germplasm is rather unique. Some associations between prolamin alleles
and geographical and phylogenetic origin of varieties were found in both species.
The value of endosperm proteins (6 gliadin loci, 2 glutenin loci and total protein)
and SSRs (24 loci) for validation of duplicates, and monitoring the intra-accession
variability, was studied in 23 potential duplicates of durum wheat. The results indicated
that biotypes and duplicated accessions showed identical gliadin genotype, few or none
differences in HMW glutenin subunits and total protein, and less than three different
SSR loci. A similar result was obtained for biotypes of T. monococcum. However, the
discrepancies in some cases support the convenience to use together both marker
systems. A good concordance among endosperm proteins, agro-morphological traits and
SSRs were also found, mainly when differences between genotypes were high.
However, agro-morphological traits discriminated less between accessions than
molecular markers.
For the second objective of the thesis, we analysed the allelic variation at seven
prolamin loci, involved in durum wheat quality: Glu-A1 and Glu-B1 of HMW glutenin,
Glu-A3, Glu-B3 and Glu-B2 of B-LMW glutenin, and Gli-A1 and Gli-B1 of gliadin. The
subsample analysed included landraces from all the Spanish provinces where the crop
was traditionally cultivated. All the loci, except for Glu-B2, showed high genetic
XIII
variability, being Glu-3 the most polymorphic. A total of 65 alleles were studied, 29 of
them being new, which represent an important source of variability for quality
improvement. Differences in prolamin composition were detected between convar.
turgidum and the North zone, and the convar. durum and the South zone; the genotype
Glu-B3new-1 - Gli-B1new-1 was very common in the convar. turgidum, while the GluB3a - Gli-B1c, associated with better quality, was more frequent in the convar. durum.
Higher variability was detected in the convar. turgidum than in the convar. durum,
mainly at the Glu-B1 and Glu-B3, showing that this convariety could be a valuable
source of new glutenin alleles.
The subsample was evaluated for quality (protein content, P, and sedimentation
test, SDSS) with two doses of nitrogen fertiliser (N), and in two different years. No
significant Variety x Year or Variety x Nitrogen interactions were detected. For P,
environmental (year and N) effects were higher than variety effect, being P values , in
general, larger with high dose of N. The variety exhibited a strong influence on SDSS
test, which was not affected by year and N. Increasing values of P did not significantly
influence on gluten strength, estimated with the SDSS. Respect to the prolamin effects
on gluten strength, the superiority of Glu-B3a was confirmed; although a high positive
effect of the new alleles Glu-A3new-1, and Glu-B3new-6 and new-9 was also detected.
The no correlation between yield (evaluated in a previous research) and P, in the
landraces adapted to low N, allowed to select four landraces with high yield and high
gluten strength for low N production.
XIV
ÍNDICE
RESUMEN ..................................................................................................................... XI
SUMMARY .................................................................................................................XIII
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 3
1. Importancia de los Recursos Fitogenéticos ............................................................. 3
2. La colección de trigo duro del CRF-INIA ............................................................... 5
3. Racionalización de las colecciones de germoplasma: Detección de duplicados ... 10
4. Constitución genética del trigo duro ...................................................................... 13
5. Análisis de la variabilidad genética en trigo con marcadores moleculares:
gliadinas, gluteninas y microsatélites (SSRs) ........................................................ 14
5.1. Gliadinas....................................................................................................... 15
5.2. Gluteninas..................................................................................................... 21
5.3. SSRs ............................................................................................................. 25
6. Evaluación de la calidad de las colecciones de trigo duro .................................... 26
7. Objetivos................................................................................................................ 31
CAPÍTULO 1. ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY IN A SAMPLE OF THE
DURUM WHEAT (Triticum durum Desf.) SPANISH COLLECTION BASED ON
GLIADIN MARKERS ................................................................................................... 35
1. Abstract .................................................................................................................. 35
2. Introduction ........................................................................................................... 35
3. Material and methods ............................................................................................ 37
3.1. Materials ....................................................................................................... 37
3.2. Gliadin analysis ............................................................................................ 37
3.3. Statistical analysis ........................................................................................ 38
4. Results ................................................................................................................... 38
5. Discussion.............................................................................................................. 44
6. References ............................................................................................................. 48
CAPÍTULO 2. COMBINED USE OF GLIADINS AND SSRs TO ANALYSE THE
GENETIC VARIABILITY OF THE SPANISH COLLECTION OF CULTIVATED
DIPLOID WHEAT (Triticum monococcum L. ssp. monococcum)................................ 53
1. Abstract .................................................................................................................. 53
2. Introduction ........................................................................................................... 53
3. Material and methods ............................................................................................ 55
3.1. Materials ....................................................................................................... 55
3.2. Gliadin analysis ............................................................................................ 55
3.3. Microsatellite (SSR) analyses ...................................................................... 56
3.4. Agro-morphological traits ............................................................................ 56
3.5. Statistical analysis ........................................................................................ 57
XV
4. Results ................................................................................................................... 58
4.1. Gliadin polymorphism.................................................................................. 58
4.2. Microsatellites polymorphism ...................................................................... 63
4.3. Agro-morphological polymorphism ............................................................. 65
4.4. Analysis of the heterogeneous accessions .................................................... 66
4.5. Genetic relationships among different geographical regions ....................... 67
4.6. Relationships between characterisation data ................................................ 68
5. Discussion.............................................................................................................. 69
6. References ............................................................................................................. 73
CAPÍTULO 3. GENETIC REDUNDANCY AMONG DURUM WHEAT
ACCESSIONS AS ASSESSED BY SSRs AND ENDOSPERM PROTEINS .............. 77
1. Abstract .................................................................................................................. 77
2. Resumen ................................................................................................................ 78
3. Introduction ........................................................................................................... 79
4. Material and methods ............................................................................................ 80
4.1. Materials ....................................................................................................... 80
4.2. Agro-morphological traits ............................................................................ 80
4.3. Endosperm protein analysis ......................................................................... 82
4.4. SSR analyses ................................................................................................ 82
4.5. Statistical analysis ........................................................................................ 83
5. Results ................................................................................................................... 83
5.1. Protein analysis ............................................................................................ 83
5.2. SSRs analysis ............................................................................................... 86
5.3. Intra-accession variability ............................................................................ 90
6. Discussion.............................................................................................................. 93
7. References ............................................................................................................. 97
CAPÍTULO 4. GENETIC VARIATION FOR GLUTENIN AND GLIADINS
ASSOCIATED WITH QUALITY IN DURUM WHEAT (Triticum turgidum L. ssp.
turgidum) LANDRACES FROM SPAIN .................................................................... 101
1. Abstract ................................................................................................................ 101
2. Resumen .............................................................................................................. 102
3. Introduction ......................................................................................................... 103
4. Material and methods .......................................................................................... 104
4.1. Materials ..................................................................................................... 104
4.2. Prolamin analysis ....................................................................................... 106
5. Results ................................................................................................................. 106
5.1. Prolamin analysis ....................................................................................... 106
5.2. Analysis of convar. durum and convar. turgidum ...................................... 114
5.3. Analysis of the North and South geographical areas ................................. 115
6. Discussion............................................................................................................ 116
7. References ........................................................................................................... 119
XVI
CAPÍTULO 5. EFFECTS OF N FERTILISATION, YEAR AND PROLAMIN
ALLELES ON GLUTEN QUALITY IN DURUM WHEAT (Triticum turgidum L. ssp.
turgidum) LANDRACES FROM SPAIN .................................................................... 125
1. Abstract ................................................................................................................ 125
2. Resumen .............................................................................................................. 126
3. Introduction ......................................................................................................... 127
4. Material and methods .......................................................................................... 128
4.1. Material ...................................................................................................... 128
4.2. Quality evaluation ...................................................................................... 128
5. Results ................................................................................................................. 129
5.1. Quality parameters ..................................................................................... 129
5.2. Parameter correlations ................................................................................ 131
5.3. Effects of prolamin alleles on quality parameters ...................................... 131
6. Discusión ............................................................................................................. 135
6.1. Quality parameters ..................................................................................... 135
6.2. Effects of prolamin alleles on quality parameters ...................................... 136
7. References ........................................................................................................... 139
DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................................. 143
1. Selección de los SSRs para identificación de variedades locales españolas de T.
monococcum y T. turgidum ................................................................................. 143
2. Identificación genética con alelos de gliadinas y SSRs de variedades locales
españolas de trigo duro (Cap. 1 y Cap. 3) y de T. monococcum L. (Cap. 2). ...... 144
3. Análisis de la variabilidad genética intra- e inter-varietal con proteínas del
endospermo y SSRs en la colección de T. monococcum L. (Cap. 2) y en la de trigo
duro (Cap. 1 y 3) .................................................................................................. 148
4. Uso de las proteínas del endospermo y de los SSRs para detectar y confirmar
duplicados potenciales en trigo duro (Cap. 3) ..................................................... 152
5. Caracterización genética con proteínas del endospermo con influencia en la
calidad (gliadinas y gluteninas) de una submuestra de variedades locales de la
colección de trigo duro del CRF-INIA (Cap. 4) .................................................. 158
6. Influencia de las variantes alélicas de prolaminas, del año y del abonado
nitrogenado en la calidad de una submuestra de variedades locales de la colección
de trigo duro del CRF-INIA (Cap. 5) .................................................................. 161
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 169
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 175
XVII
ÍNDICE DE TABLAS
INTRODUCCIÓN
Tabla 1. Número de entradas, entre paréntesis, por subespecie, convariedad y
variedad de la colección de Triticum turgidum L. del CRF………………...… 7
Tabla 2. Variación alélica de los loci Glu-A1 y Glu-B1 de gluteninas HMW y las
subunidades que sintetizan…………………………………………... …..… 22
Tabla 3. Equivalencia entre modelos de gluteninas B-LMW y la composición
alélica encontrada por Nieto-Taldriz et al. (1997)…….…………………..…. 24
Tabla 4. Clasificación de los alelos del locus Glu-A3 según el valor obtenido en
varios test de calidad……………………………………………………..… 29
Tabla 5. Clasificación de los alelos del locus Glu-B3 según el valor obtenido en
varios test de calidad…………………………………………………..…… 29
CAPÍTULO 1
Table 1. Gliadin alleles composition of 17 Spanish landraces and six old cultivars
from the durum wheat Spanish collection……………..................…………. 39
Table 2. Alleles and frequencies at each of the six gliadin loci in the 17 Spanish
landraces and six old cultivars from the durum wheat Spanish
collection………………………………………………………………........ 40
Table 3. Gene diversity within and between durum wheat varieties for each gliadin
locus and for the overall sample of 23 varieties …………………………... 42
CAPÍTULO 2
Table 1. List of the agro-morphological traits used as descriptors….……………….
Table 2. Alleles and frequencies at the gliadin and SSR loci in a sample of Spanish
einkorn accessions…………………….…………………………………...
Table 3. Gene diversity within and between einkorn varieties for each gliadin locus
and for the overall sample of 17 accessions………………………….……..
Table 4. SSR markers used, their map position, SSR motif, number and effective
number of alleles and PIC values generated in the 15 einkorn accessions
analysed………………………………..……………………………………
Table 5. Gliadin alleles and SSR allele size of 17 Spanish einkorn accessions
analysed………………………………...……………………..……………
XVIII
57
60
62
64
64
CAPÍTULO 3
Table 1. Gliadin (Gli- alleles), high molecular weight glutenin (HMWG) subunits
encoded at Glu- loci and total protein of the potential duplicate groups of
durum wheat accessions ……………………………………………………
Table 2. Comparison of the genotypes 1 for agro-morphological characters and
SSRs between accessions of the potencial duplicate groups……………….
Table 3. Comparison of genotypes (gt.) of heterogeneous accessions with the main
genotype (gt. 1) for gliadin, highmolecular weight glutenin (HMWG)
subunits and total protein………………..…………………………..……...
Table 4. SSR markers used, their map position, number and effective number of
alleles and PIC values generated in the durum wheat varieties
analysed………………………………………………..……………….…...
Table 5. SSR allele size of the genotypes different in protein composition together
with the main genotype of accessions studied.…………………..……...…
Table 6. List of the agro-morphological traits used as descriptors to characterise
the durum wheat accessions…………………………………..…………….
CAPÍTULO 4
Table 1. Genebank number, local name and geographical region of the landraces
analysed………………………………….………………………..………
Table 2. Allelic fequencies at each loci and gene diversity (H) for the whole
sample, convars. durum and turgidum and the North and South
geographical groups………………………………………………………
Table 3. B low-molecular-weight (B-LMW) glutenin subunits and gliadins
encoded by the new alleles found in the durum wheat varieties
analysed……………………………………………..…………………….
Table 4. Glutenin genotype of the low-molecular-weight (LMW) models found
and the gliadin alleles linked to them………………………….............…
Table 5. Allele composition at prolamin loci related to durum wheat quality of
the landraces analysed………………………………....................…….…
CAPÍTULO 5
Table 1. Statistical significance and range of variation of grain protein (P) and
sodium dodecyl sulphate sedimentation (SDSS) test over years and
nitrogen (N) fertilisation rates……………………………………......…..
Table 2. Statistical significance of grain protein (P) and sodium dodecyl sulphate
sedimentation (SDSS) test means between the North and South
geographical groups…………………………………...………….………
Table 3. Means and standard deviation of the sodium dodecyl sulphate
sedimentation (SDSS) test values for the prolamin alleles at both
Nitrogen (N) fertilizer levels and the two-year average………………….
Table 4. SDSS and P values obtained for each treatment in the fifty Spanish
landraces and four test varieties of dururm wheat…………..……………
DICUSIÓN GENERAL
Tabla 1. Valores límite de los parámetros de diversidad de gliadinas y SSRs
establecidos para los biotipos y para las mezclas……………......………
XIX
84
90
92
87
88
81
105
110
111
112
113
130
131
133
134
150
ÍNDICE DE FIGURAS
INTRODUCCIÓN
Figura 1. País de origen de las entradas de la colección de Triticum turgidum L. del
CRF…….……………………………….………………………………..… 8
Figura 2. Distribución por provincias de las entradas españolas de la colección de
Triticum turgidum L. del CRF…………………………………………....… 8
Figura 3. Tipo de material de las entradas de la colección de Triticum turgidum L.
del CRF………………………………………………………………..…… 9
Figura 4. Separación de los grupos , , y -gliadinas de trigo duro por medio de
electroforesis A-PAGE………………………………………………..…... 16
Figura 5. Localización cromosómica de los loci que codifican gliadinas y
gluteninas en trigo duro………………………………………………………18
Figura 6. Variantes alélicas de gliadinas de trigo duro identificadas como bloques
de bandas…………………………………………………………….……. 20
Figura 7. Separación de gluteninas de trigo duro en gel de SDS-PAGE…..…..……. 21
Figura 8. Variación alélica de los loci Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 de las gluteninas
B-LMW…………………………………………………………….……... 24
CAPÍTULO 1
Figure 1. Gliadin electrophoretic patterns of the variety genotypes (gt.) and test
varieties……………………………………………………………………. 41
Figure 2. Dendrogram of the 17 Spanish landraces and six old cultivars from the
durum wheat Spanish collection based on their dissimilarity in gliadin
genotype……………………………………………………………….….. 43
CAPÍTULO 2
Figure 1. Main gliadin genotypes of some Spanish accessions of T. monococcum L.
ssp. monococcum ……………………..….…………………………….…
Figure 2. A-PAGE of gliadins from different wheats....….…………………………
Figure 3. Dendrogram of 17 Spanish einkorn accessions calculated from gliadin
data ………………………………………………………………….....….
Figure 4. Dendrogram of 15 Spanish einkorn accessions calculated from SSR data..
Figure 5. Dendrogram of 16 Spanish einkorn accessions calculated from agromorphological data…………………………………………………….…..
59
61
63
65
66
CAPÍTULO 4
Figure 1. High-molecular-weight (HMW) and low-molecular-weight (LMW)
glutenin subunits of some entries with new alleles………………….……. 108
Figure 2. Gliadin electrophoretic spectra of some entries with new gliadin alleles.... 109
DICUSIÓN GENERAL
Figura 1. Perfil electroforético de proteína total de un genotipo heterocigoto de la
variedad Semental…………………………………………………….…... 151
Figura 2. Siembra de los duplicados potenciales en el CRF-INIA……………..…… 153
Figura 3. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Blanquillón de
Boñar………………………………………………………………..….…. 154
Figura 4. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Alaga, idénticas en
proteínas y diferentes en el color del grano y en días a espigado…….…... 155
XX
Figura 5. Perfil electroforético de 10 granos de las dos accesiones de Mindum…..... 156
Figura 6. Ensayo de bajo abonado en el CRF-INIA………………………………... 162
Figura 7. Toma de muestra para los análisis de suelo……………………….……… 163
XXI
INTRODUCCIÓN
1
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1.Importancia de los Recursos Fitogenéticos
Los
recursos
fitogenéticos
se
definen
como
la
diversidad
genética
correspondiente al mundo vegetal que se considera poseedora de un valor
intrínseco para el presente o el futuro. Tradicionalmente, se clasifican en las siguientes
categorías: variedades de especies cultivadas, tanto locales como comerciales; especies
silvestres o asilvestradas afines a las cultivadas, o con un valor actual o potencial; y
materiales obtenidos en trabajos de mejora genética (Esquinas-Alcázar, 1993). Hoy en
día las posibilidades técnicas permiten realizar un aprovechamiento cada vez mayor de
los recursos naturales, por lo que esta clasificación englobaría toda la diversidad
vegetal.
Con el inicio de la agricultura en el neolítico, la diversidad de las especies
cultivadas se fue incrementando. Se desencadenó un proceso evolutivo en el que
interactuaban presiones selectivas humanas y naturales. Con la domesticación de
especies silvestres, se generaron multitud de variedades con características genéticas
específicas y con una heterogeneidad intrínseca que les conferían una gran adaptación a
las condiciones locales de origen, a la vez que, la capacidad de hacer frente a cambios
medioambientales imprevisibles. Esta diversidad genética vegetal supone una fuente
insustituible de genes de resistencia a plagas, enfermedades, estreses abióticos, y otros
caracteres de interés, que proporcionan la materia prima para obtener nuevas variedades
mejoradas que se adapten a las necesidades humanas de cada momento.
Con la aparición y difusión de la agricultura moderna en el s. XX, y el deterioro
del medioambiente, esta diversidad ha decrecido alarmantemente. Durante la
“revolución verde” de los años 60 se sustituyó el cultivo de una gran cantidad de
variedades tradicionales heterogéneas por otras más modernas, homogéneas y
uniformes. El primer informe de la FAO sobre el estado de los recursos fitogenéticos en
el mundo considera que de las 7.000 especies de plantas que se estima se llegaron a
domesticar, se han pasado a cultivar tan solo unas 150. De ellas, 30 especies
proporcionan el 90% de la alimentación humana, y tan solo cuatro (trigo, maíz, arroz y
patata) aportan el 60% de las calorías, por lo que se han convertido en el gran sustento
del ser humano (FAO, 1998).
3
INTRODUCCIÓN
Existen varios casos documentados en los que la aparición de nuevas plagas o
enfermedades provocó la pérdida de las cosechas de países enteros por el empleo
mayoritario de las mismas variedades modernas. Para recuperar estos cultivos, se tuvo
que buscar genes de resistencia en el germoplasma de los centros de origen donde
todavía se mantenía una gran biodiversidad. Estos sucesos pusieron de manifiesto la
grave erosión genética que se estaba produciendo y los problemas que esto conllevaba.
Se reconoció la extrema necesidad de conservar la diversidad existente, por lo que se
iniciaron expediciones de recolección y se desarrollaron programas de conservación a
nivel mundial. Debido al carácter urgente de la situación, se recurrió, en un primer
momento, a la estrategia de conservación ex-situ, creándose bancos de germoplasma por
todo el mundo.
España es uno de los países de Europa con mayor diversidad genética, debido a
que es un centro de diversidad de algunos cultivos (Vavilov, 1951), ha sido zona de
paso de diversas civilizaciones y punto de difusión de los cultivos llegados del Nuevo
Continente desde 1492 (Hernández Bermejo y León, 1992). En España, la erosión
genética ha provocado no solo la pérdida del cultivo de innumerables variedades
locales, como ocurrió con los cereales de invierno que prácticamente el 100% fueron
sustituidas por unas pocas variedades comerciales, sino que dejaron de cultivarse
especies enteras como es el caso de muchas leguminosas. Paralelamente, debido a la
sobreexplotación de los recursos naturales, se ha producido la desaparición de especies
silvestres emparentadas con las cultivadas. Aunque las primeras acciones encaminadas a
la conservación se iniciaron a finales del siglo XIX, esta actividad no se realizó de
manera reglada hasta 1981, cuando se publicó la primera Orden Ministerial sobre
Conservación y Utilización del Patrimonio Genético Vegetal. En 1993, con la O.M. del
23 de abril, se creó el Programa de Conservación y Utilización de Recursos
Fitogenéticos (PCURF), cuyos objetivos son evitar la pérdida de diversidad autóctona, y
evaluar y documentar los recursos fitogenéticos. Para ayudar a lograr estos objetivos, se
creó el Centro de Recursos Fitogenéticos del Instituto Nacional de Investigación y
Tecnología Agraria y Alimentaria (CRF-INIA), que actúa como Centro nacional de
conservación de colecciones base de semillas, y desarrolla y publica el Inventario
Nacional que contiene la información de pasaporte de las colecciones de la red del
programa (http://wwwx.inia.es/webcrf/). El CRF también gestiona sus propias
colecciones activas, fundamentalmente de cereales y leguminosas.
4
INTRODUCCIÓN
2.La colección de trigo duro del CRF-INIA
La colección de cereales es la más importante en tamaño del CRF-INIA, ya que
contiene algo más de la mitad de las entradas de las colecciones activas conservadas en
el centro. Además, es también la más antigua. Las primeras recolecciones de cereales
de invierno se iniciaron en 1920, por parte del ya desparecido Instituto de
Cerealicultura, que recogió variedades locales por todo el territorio español. Aunque el
CRF también ha recolectado algunas muestras, la gran mayoría de las entradas
proceden de donaciones de mejoradores de cereales que las mantenían en sus
colecciones de trabajo. El género Triticum es el más numeroso, y cuenta actualmente
con 3.172 entradas (abril 2012), lo que supone más del 35% de las accesiones de
cereales de invierno. Las especies incluidas dentro de este género y el número de
entradas de cada una son: T. aestivum (1.957), T. turgidum (1.154), T. monococcum
(54) y T. timopheevi (6).
El trigo es uno de los cultivos más antiguos que se conocen. Durante siglos ha
supuesto para el hombre un alimento básico, especialmente en el continente europeo.
En España, tiene una gran tradición e importancia económica y social, cultivándose dos
especies: el trigo blando o harinero (T. aestivum) para panificación y el trigo duro (T.
turgidum) para fabricación de pasta y sémola. El trigo duro se cultiva principalmente en
Andalucía, Badajoz, Burgos, Navarra, Toledo y Zaragoza, siendo nuestro país uno de
los principales productores del mundo. Aunque el cultivo del trigo blando siempre ha
sido más importante, a partir de los años 90, debido a las ayudas procedentes de la
PAC, se produjo un incremento de la superficie dedicada al trigo duro en detrimento de
la dedicada al harinero, hasta el punto de que en Andalucía, región de España dónde
este cultivo tiene mayor tradición, el número de hectáreas sembradas con trigo duro
superó a las dedicadas al blando. Actualmente la importancia del trigo duro continua
siendo creciente, ya que las estimaciones oficiales para el 2012 prevén un incremento,
respecto al año pasado (400 mil ha.), del 7,6% en la superficie del trigo duro, frente al
aumento de solo un 1,5 % del número de hectáreas sembradas el año pasado (1.500 mil
ha.) con trigo blando. Además, las subvenciones de la PAC incluyeron en 2003 una
prima específica a la calidad, lo que incentivó la obtención de nuevas variedades de alta
calidad.
La colección de trigo duro (T. turgidum L.) del CRF incluye las subespecies
dicoccon, dicoccoides, carthlicum y turgidum (Tabla 1). Las ssp. dicoccon y carthlicum
5
INTRODUCCIÓN
son cultivadas, pero mientras que la primera ha tenido una cierta importancia en
España, la escaña doble o melliza, la segunda apenas ha tenido repercusión. La ssp.
dicoccoides es un pariente silvestre del trigo duro. Dentro de la ssp. turgidum se
incluyen las convariedades polonicum, turgidum y durum (Mac Key, 1966). Aunque
posteriormente Mac Key (2005) las separa como subespecies distintas, en el CRF se
mantienen como convariedades de acuerdo con Croston y Williams (1981), y en espera
de una unificación taxonómica para las bases de datos internacionales. Los trigos que
más se difundieron en España fueron el T. turgidum convar. durum y T. turgidum
convar. turgidum, por eso son los mas representados en la colección con 805 y 185
entradas, respectivamente. La convar. durum se cultivaba más en el sur de la península,
principalmente en Andalucía, mientras que la convar. turgidum estaba más extendida
en la zona norte. Como puede verse en la Tabla 1, la información taxonómica de la
colección del CRF es muy completa. De casi todas las entradas se conoce la subespecie
y la convariedad a la que pertenecen, y en algunos casos se ha determinado la variedad
botánica.
6
INTRODUCCIÓN
Tabla 1. Número de entradas, entre paréntesis, por subespecie, convariedad y variedad
de la colección de Triticum turgidum L. del CRF.
Subespecie
Convariedad
carthlicum (7)
dicoccoides (3)
Variedad
jordanicum(1)
spontaneum(1)
spontaneum vilosum(1)
dicoccon (86)
atratum(3)
farrum(16)
pseudo-macratherum(1)
rufum(12)
turgidum (1.045) durum (805)
coerulescens(1)
affine(3)
africanum(4)
albo-provinciale(1)
alexandrinum(1)
apulicum(7)
coerulescens(2)
erythromelan(2)
fulvo-provinciale(4)
alexandrinum(1)
apulicum(7)
coerulescens(2)
erythromelan(2)
fulvo-provinciale(4)
hordeiforme(14)
leucomelan(16)
leucurum(7)
lusitanicum(1)
melanopus(8)
murciense(1)
reichembachii(3)
valenciae (1)
polonicum (30) levissimum(1)
pseudo-martiniari(1)
pseudo-villosum(1)
turgidum (185) candiens(1)
dinurum(6)
dreischianum(1)
gentile(2)
herrerae(2)
iodurum(1)
nigrobarbatum(1)
plinianum(1)
rubroatrum(2)
speciosum(1)
7
INTRODUCCIÓN
Como consecuencia de que con el PCURF se estableció el objetivo de preservar
los recursos fitogenéticos autóctonos, la mayoría de las entradas de las que se dispone
información sobre su origen, son españolas (659) (Figura 1).
Italia; 20
Estados Unidos; 23
Turquía; 20
Otros; 32
Portugal; 45
España; 659
Desconocido; 356
Figura 1. País de origen de las entradas de la colección de Triticum turgidum L. del
CRF.
En la Figura 2, se muestra la distribución geográfica de las entradas españolas.
No existe información de la región de origen de 187 variedades. Aunque casi todas las
regiones españolas están representadas, el número de entradas andaluzas es
significativamente mayor. Destaca el número tan alto de entradas (58) de Asturias; la
mayoría de ellas (36) son de la subespecie dicoccon, cuyo cultivo se concentra en esta
zona.
Figura 2. Distribución por provincias de las entradas españolas de la colección de
Triticum turgidum L. del CRF.
8
INTRODUCCIÓN
Atendiendo al tipo de material de las entradas, el 82% son variedades locales
(Figura 3), de las cuales 588 son españolas. La colección cuenta también con 91
cultivares antiguos que son materiales muy interesantes para la obtención de nuevas
variedades.
Cultivares antiguos; 91
Desconocido; 11
Silvestres; 2
Material de mejora; 100
Variedades locales; 951
Figura 3. Tipo de material de las entradas de la colección de Triticum turgidum L. del
CRF.
Las variedades locales españolas de trigo son recursos genéticos de gran valor
para la mejora del cultivo. Poseen mayor variabilidad genética que las variedades
comerciales (Carrillo et al., 1990; Ruiz et al., 2002b) y, al tratarse de materiales de la
misma especie, la incorporación de los genes de interés en un programa de mejora es
más accesible que si se parte de material silvestre o de una especie distinta. Al contrario
que las variedades comerciales modernas, caracterizadas por tener una base genética
estrecha, las variedades locales poseen una gran diversidad que se encuentra tanto entre
las variedades como dentro de ellas. La heterogeneidad intravarietal les otorga la
rusticidad suficiente para conseguir producciones aceptables, en muchos casos mayores
que las obtenidas por las comerciales, cuando las condiciones “agromedioambientales”
no son las idóneas; es decir, cuando se aportan niveles bajos de insumos (fitosanitarios,
abonado, riego, etc.) y cuando se producen fuertes oscilaciones climáticas (Boggini et
al., 1997). Es por esto que las variedades locales no son solo una reserva de genes para
la mejora, sino que son las más adaptadas para su uso directo en agricultura sostenible.
Las peticiones de variedades de trigo duro de la colección española del CRF han
aumentado en los últimos años, tanto por parte de los mejoradores para realizar
evaluaciones y estudios de variabilidad como, por
grupos de agricultores para
recuperar el cultivo en agricultura ecológica, o elaborar productos con variedades
9
INTRODUCCIÓN
tradicionales. Por otro lado, en Europa, la conservación y utilización de los recursos
fitogenéticos se gestiona por medio del Programa Cooperativo Europeo (ECPGR). A
través de este programa se ha establecido la Base de Datos Europea de Trigo (EWDB)
que recoge de forma centralizada la información de pasaporte, caracterización y
evaluación de las colecciones europeas mantenidas en las diferentes instituciones. Uno
de los objetivos establecidos del ECPGR es la identificación de muestras repetidas en
las colecciones de trigo en Europa.
3.Racionalización de las colecciones de germoplasma: Detección de duplicados
Un problema muy común en todos los bancos de germoplasma es la gestión de
colecciones grandes. La dificultad es mayor cuando éstas son antiguas, ya que con el
paso del tiempo, al ir incorporando muestras muy semejantes a las ya conservadas, se
van acumulando duplicados. Las duplicaciones dentro de las colecciones son
indeseables ya que no contribuyen a la diversidad genética presente dentro de la
colección, pero si consumen recursos para su almacenamiento y mantenimiento. Con el
aumento del tamaño de las colecciones, los bancos de germoplasma se ven obligados a
identificar y eliminar el germoplasma redundante para mejorar su eficacia (Hintum y
Visser, 1995; Greene y Pederson, 1996; Hintum et al., 1996). Por otro lado, a lo largo
del tiempo, la integridad genética se puede alterar por errores en las multiplicaciones y
en la conservación, dando lugar a entradas mal clasificadas, identificaciones erróneas o
mezclas accidentales. Todo ello dificulta la conservación de los recursos fitogenéticos y
la selección del mejor material para los usuarios.
La racionalización de una colección intenta resolver estos problemas mediante
la eliminación de los duplicados, la detección de errores y mezclas, y la creación de la
colección nuclear que represente, con el menor número de entradas, la variabilidad
genética de la colección completa. Tanto la detección de duplicados, como de errores
en las accesiones conservadas, deben realizarse antes que la creación de la colección
nuclear, ya que ésta no debe incluir redundancias ni entradas con problemas de
integridad genética. La racionalización de la colección de trigo duro, especialmente la
detección de duplicados, es un objetivo prioritario del CRF para mejorar el suministro
de material a los usurarios y cumplir con los compromisos internacionales. Con este
fin, se solicitó y aprobó el proyecto de recursos fitogenéticos RF-01-021 “Aplicación
10
INTRODUCCIÓN
de marcadores moleculares a la gestión de la conservación de la colección de trigo duro
conservada en el CRF-INIA”.
En el caso de la colección de trigo duro del CRF, gran parte de la redundancia
existente se debe a que en el pasado se incluyeron gran cantidad de variedades locales y
cultivares antiguos procedentes de diferentes donaciones, pero con el mismo origen
histórico (procedían de la misma muestra original), asignando con frecuencia a la
misma variedad distintos números y códigos de identificación. Sin embargo, la absoluta
certeza de que dos variedades son genéticamente idénticas solo puede obtenerse
mediante la comparación completa de sus genomas. Por otro lado, es muy difícil que
dos entradas de un duplicado sean completamente iguales, ya que pueden diferenciarse
de la muestra original en su composición genética durante la conservación ex situ. Se
ha demostrado que las frecuencias alélicas en los duplicados pueden variar debido a
factores, tales como, la deriva genética aleatoria, la selección natural y la no
intencionada, la contaminación durante la regeneración o la separación de muestras
(Hintum y Knüpffer, 1995; Hintum y Visser, 1995). Puede llegar a suceder que
entradas duplicadas sean tan diferentes entre ellas como de la muestra original, y que
formen un grupo genéticamente homogéneo (Lund et al., 2003). Por lo tanto, el criterio
no puede ser que las entradas sean idénticas, sino que tengan el mismo origen histórico
y las mismas variantes alélicas aunque las frecuencias sean distintas. Estos duplicados,
denominados duplicados comunes, son el tipo más frecuente en los bancos de
germoplasma (Hintum y Knupffer, 1995). No obstante, todavía no se ha determinado
con precisión la cantidad de similitud o diferenciación genética aceptable que debe
existir entre entradas duplicadas. Por lo tanto, la reducción de la duplicación en bancos
de germoplasma es más complicada de lo que pueda parecer “a priori”.
Los datos de pasaporte pueden emplearse para identificar duplicados
potenciales (Hintum y Knüpffer, 1995), mostrando aquellas entradas que tienen
nombres idénticos o similares, o que han sido recolectadas en zonas cercanas. Sin
embargo, en algunos casos los datos de pasaporte ofrecen poca información o pueden
mostrar como duplicados potenciales entradas genéticamente diferentes. Además, la
identidad genética de las accesiones puede alterarse durante la conservación en los
bancos de germoplasma por lo que los datos de pasaporte solo se pueden utilizar como
una indicación de la duplicación probable. Se necesita, por tanto, información adicional
para verificar estos duplicados potenciales. La redundancia debe analizarse mediante la
cuantificación de la similitud genética entre las entradas, analizando su genoma con
11
INTRODUCCIÓN
marcadores genéticos polimórficos. En los estudios dirigidos a la identificación del
germoplasma redundante, a menudo se combinan los análisis morfológicos con la
caracterización molecular (Maass et al., 1993; Waycott y Fort 1994; Hintum y Visser,
1995; Hintum et al., 1996; Zeven et al., 1998; Huamán et al., 1999). Posteriormente
deben emplearse herramientas estadísticas para estimar si la diferenciación genética
entre las entradas duplicadas es suficiente para considerarlas distintas.
En el CRF, se realizó un estudio previo para la detección de la redundancia en la
colección de trigo duro (Ruiz y Aguiriano, 2004). En este trabajo se aplicó una
metodología para la detección de duplicados en colecciones grandes. En primer lugar,
se identificaron como duplicados potenciales aquellos que tenían el mismo origen
histórico (provenían de la misma muestra original), el mismo nombre y, si eran
variedades locales, el mismo lugar de origen. La verificación se realizó con caracteres
agro-morfológicos
polimórficos
y
con
alta
heredabilidad,
empleados
en la
identificación de variedades. En segundo lugar, las entradas que resultaron ser muy
similares se analizaron con marcadores moleculares con el fin de verificar
la duplicación fenotípica. En este trabajo se emplearon las gliadinas, proteínas del
endospermo del trigo altamente polimórficas, considerándose entradas duplicadas las
que eran agro-morfológicamente similares y poseían el mismo patrón electroforético de
gliadinas. Siguiendo esta metodología, con los datos de pasaporte se identificaron 106
casos de duplicados potenciales, tanto de variedades locales como de cultivares
antiguos, que afectaban a 277 entradas, y de los que se verificaron 54 casos de
duplicados. Estos análisis permitieron también detectar 35 errores en la colección que
implicaban una falta de correspondencia entre los datos de pasaporte y la semilla
conservada. Sin embargo, en algunos casos se observaron discrepancias entre los
caracteres agro-morfológicos y las gliadinas, que impedían tomar una decisión en
cuanto a la duplicidad de las entradas. Para resolver estos casos sería necesario el uso
de más marcadores genéticos.
12
INTRODUCCIÓN
4.Constitución genética del trigo duro
El trigo duro es un híbrido natural alotetraploide (2n=4x=28), con dos
genomios, A y B, que proceden de dos especies diploides diferentes, pero a partir de un
genomio ancestral común. Su naturaleza tetraploide le permite a esta especie un
apareamiento de cromosomas en meiosis tipo diploide, donde son identificados 14
bivalentes. Los análisis genéticos y citogenéticos han demostrado que los 14 pares de
cromosomas se pueden dividir en 7 grupos que constan de dos pares, uno de cada
genomio (cromosomas homeólogos). Los cromosomas correspondientes han sido
identificados y las llamadas series homeólogas establecidas de la siguiente manera: 1A
y 1B; 2A y 2B; 3A y 3B;…y 7A y 7B.
El genomio A procede de Triticum urartu Tumanian ex Gandilyan (Dvorak et
al, 1993), especie silvestre genéticamente muy relacionada con la cultivada Triticum
monococcum L. Al no haberse encontrado ninguna especie con la dotación genética
actual del genomio B del trigo duro, se pensó que debía provenir de una especie
actualmente extinta o desconocida. Actualmente se considera que Aegilops speltoides
Tausch es la especie donante más probable del genomio B (Dvorak, 1998; Maestra y
Naranjo 1998).
Los estudios genéticos de especies poliploides pueden facilitarse, en gran
medida, si previamente se realizan en especies diploides portadoras de uno de sus
genomios. De tal manera que la escaña menor (Triticum monococcum L) (2n=2x=14)
puede servir como especie modelo para el estudio del trigo duro. Aunque no es la
especie donante del genomio A, sí que existe gran semejanza entre ambos genomios, ya
que todas las especies de la tribu Triticeae proceden de un antecesor común y sus
cromosomas, por derivar del mismo cromosoma ancestral, son homeólogos. La
similitud genética entre cromosomas del mismo grupo de homeología ha sido
ampliamente demostrada (Chao et al., 1989; Devos et al., 1992; Hartl et al., 1993). El
estudio de la escaña menor, entre otros aspectos, permitiría facilitar la selección y
puesta a punto de los marcadores genéticos más apropiados que luego pueden
emplearse para el análisis de la diversidad genética y racionalización de la colección de
trigo duro. En el CRF existe una colección de Triticum monococcum L. que incluye 17
variedades locales recogidas antes de 1998 en distintos puntos de la geografía española.
13
INTRODUCCIÓN
5.Análisis de la variabilidad genética en trigo con marcadores moleculares:
gliadinas, gluteninas y microsatélites (SSRs)
La diversidad genética almacenada en los bancos de germoplasma debe ser
cuidadosa y exhaustivamente analizada, no solo para facilitar la utilización de los
materiales conservados, sino también para realizar un seguimiento de la diversidad
dentro y entre las variedades, con el fin de evitar la erosión genética en el banco.
También contribuye a mejorar el manejo de las accesiones para mantener sin cambios
su composición genética, incluyendo su heterogeneidad. Además, el estudio de la
cantidad, naturaleza y distribución de la diversidad genética de las colecciones, unido al
conocimiento histórico de las entradas, es importante en la racionalización de
colecciones amplias; es decir para la eliminación de duplicados, identificación de
mezclas y la creación de colecciones nucleares que reúnan la diversidad de la colección
completa (Frankel, 1984).
La variabilidad intra e intervarietal tan deseable de las variedades locales puede
suponer un problema doble. En primer lugar, debe tenerse especial cuidado durante la
multiplicación y regeneración de las muestras para mantener intacta su diversidad
genética (Sackville y Chorlton, 1997). En segundo lugar, los estudios de la variabilidad
de las colecciones son más complicados en comparación con los de las variedades
modernas, ya que el número de variantes alélicas es mayor, y muchas de ellas no han
sido previamente descritas o catalogadas (Rodriguez de Quijano et al., 1990; Carrillo et
al., 1990; Ruiz et al., 2002a).
Tradicionalmente, en los bancos de germoplasma la variabilidad genética de las
variedades de trigo se ha estudiado con caracteres agro-morfológicos, ya que aportan
información muy valiosa para los conservadores y mejoradores, y su análisis era más
accesible (Gadea, 1954; Sánchez-Monge, 1957; Greene y Pederson, 1996; Huaman et
al., 1999). Sin embargo, estos caracteres tienen algunas limitaciones relacionadas con
su bajo polimorfismo y la variación de su expresión en diferentes condiciones
ambientales.
Los marcadores moleculares, incluidas las proteínas e isoenzimas, presentan
claras ventajas sobre los morfológicos. Son abundantes, con un mínimo o nulo efecto
epistático y pueden ser extraídos de semilla o partes vegetativas en los primeros
estadíos del desarrollo de la planta. Además, permiten estudiar un cierto número de loci
sobre los que a priori no se sabe el nivel de variabilidad. Al ser la información recogida
14
INTRODUCCIÓN
de diferente tipo, se puede obtener un muestreo extensivo de los genomas a nivel de
ADN, que represente la variabilidad total. El que un marcador genético sea de utilidad
para un banco de germoplasma y aplicable a colecciones amplias depende, además de
su polimorfismo y distribución por todo el genoma, de la rapidez, facilidad, coste y
reproducibilidad de su análisis (Gilbert et al., 1999). Su aplicación a los recursos
fitogenéticos permite obtener gran cantidad de información sobre la diversidad genética y
las relaciones filogenéticas en el germoplasma analizado (Tanksley y McCouch, 1997).
Además, puede proporcionar a los mejoradores información útil para seleccionar
progenitores para programas de mejora o predicción de la heterosis de los híbridos
obtenidos.
5.1.Gliadinas
Las proteínas del endospermo del trigo (gliadinas, gluteninas, albúminas y
globulinas), son los productos directos de la expresión génica y pueden revelar
pequeños cambios, como mutaciones, inaccesibles a simple vista con caracteres agromorfológicos. A las gliadinas y gluteninas se las conoce también como prolaminas. En
el trigo, las gliadinas han demostrado ser uno de los marcadores genéticos más
polimórficos, aplicables a la identificación y discriminación de variedades de diferentes
orígenes y grados de parentesco (Kudryavtsev et a.l, 1996; Metakovsky y Branlard,
1998; Metakovsky et al., 2000; Melnikova et al., 2012). Además, tienen la ventaja de
que su análisis es relativamente fácil, rápido y accesible tanto en recursos humanos
como económicos para un banco de germoplasma. Para la extracción de las proteínas
solo hace falta una pequeña cantidad de endospermo, pudiéndose utilizar el resto del
grano con el embrión para multiplicar el material analizado.
Las gliadinas son proteínas monoméricas que al fraccionarlas mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida ácida (A-PAGE) se separan en cuatro grupos
en función de su carga positiva y se denominan, de mayor a menor movilidad
electroforética, α, β,
y ω-gliadinas (Bietz y Wall, 1973) (Figura 4). Los alelos de
gliadinas se heredan de forma codominante, permitiendo detectar los individuos
heterocigotos. Cada locus de gliadinas codifica para varios polipéptidos que se heredan
conjuntamente, en bloques, tratándose realmente de varios genes estrechamente
ligados. En cada gen individual existe múltiple alelismo. Por tanto, cada variante de
cada locus es una variante polialélica. Por ello, el análisis alélico en los patrones de
15
INTRODUCCIÓN
gliadinas es complejo, ya que debido al gran número de bandas obtenido, entre 25 y 30
por perfil completo con electroforesis unidimensional, pueden existir problemas en la
separación de las mismas y en la distinción de los alelos que las codifican.
Figura 4. Separación de los grupos , , y -gliadinas de trigo duro por medio de
electroforesis A-PAGE. Se indican las bandas de gliadinas numeradas por su movilidad
relativa (Ruiz et al., 2005).
16
INTRODUCCIÓN
En el trigo duro, los cromosomas 1A y 1B son los responsables de la síntesis de
las
y de la mayoría de -gliadinas aunque el cromosoma 1A también codifica algunas
-gliadinas. La mayor parte de las ß-gliadinas y algunas de las -gliadinas más rápidas
son controladas por el cromosoma 6B. El cromosoma 6A regula la síntesis de las
-
gliadinas (Joppa et al., 1983; du Cros et al., 1983). En la Figura 5 se muestra la
localización de los loci de gliadinas. Los loci Gli-A1 y Gli-B1 (Gli-1) están localizados
en el extremo distal del brazo corto de los cromosomas del primer grupo de homeología
(Rybalka y Sozinov, 1979; Singh y Shepherd, 1988). Los loci Gli-A2 y Gli-B2 (Gli-2)
se localizan en el brazo corto de los cromosomas 6A y 6B, respectivamente. Además de
estos loci principales, existen otros denominados menores, porque codifican para pocas
proteínas producidas en pequeñas cantidades, localizados en los cromosomas del grupo
1 de homeología, y que presentan una variación alélica muy limitada. El locus Gli-A3
se encuentra en el cromosoma 1A (Ruiz y Carrillo, 1993) y es responsable de la síntesis
de -gliadinas y algunas -gliadinas menores (Nieto-Taladriz y Carrillo, 1996). El GliB3, localizado en el cromosoma 1B, controla la síntesis de algunas -gliadinas (Ruiz y
Carrillo, 1993). En el cromosoma 1B también se sitúa el locus Gli-B5 con genes que
codifican para
-gliadinas menores (Mazza et al., 1996). En trigo blando, se han
encontrado otros loci menores en el brazo corto del cromosoma 1A (Gli-A4, Gli-A5 y
Gli-A6) no descritos en trigo duro. Algunos loci de gliadinas están estrechamente
ligados a loci de gluteninas (Glu-) como se explica más adelante.
17
INTRODUCCIÓN
Figura 5. Localización cromosómica de los loci que codifican gliadinas y gluteninas en
trigo duro (Ruiz et al., 2005).
La comparación del perfil electroforético de gliadinas permite observar
directamente diferencias genéticas entre variedades al detectar la ausencia o presencia
de bandas. Bushuk y Zillman (1978) propusieron un sistema para estudiar la
composición de gliadinas en las variedades de trigo, basado en la movilidad relativa
(MR) de cada banda de gliadinas (Figura 4). Este método incluye en los geles de
electroforesis tres bandas de referencia de movilidades 24, 50 y 79 que se utilizan para
numerar las bandas de la variedad de estudio de acuerdo a su movilidad relativa
(Sapirstein y Bushuk, 1985). Una vez identificadas con números todas las bandas de
una variedad se puede comparar su perfil con el de otra variedad, comparar las bandas
comunes y no comunes, y calcular un índice de similitud denominado porcentaje de
homolgía (PH). Este método es fácil de aplicar pero no identifica loci ni bloques
18
INTRODUCCIÓN
alélicos. Sin embargo, para cuantificar la similitud o disimilitud genética entre
variedades con mayor precisión, debe conocerse cuántos genes codifican las
subunidades de gliadinas y las variantes alélicas de cada uno. La identificación de
alelos de gliadinas, aunque es compleja, es muy útil para analizar la diversidad genética
intra e intervarietal y discriminar biotipos, contaminaciones, mezclas y accesiones
heterogéneas (Metakovsky, 1991a; Kudryavtsev et al., 1996). Sozinov y Poperelya
(1980) fueron los que iniciaron la identificación de las variantes alélicas como bloques
de bandas que se heredan conjuntamente. Actualmente existen descritas más de 150
variantes en trigo, y se han elaborado varios catálogos de alelos de gliadinas, como el
de trigo duro publicado por Kudryavtsev et al. (1996) (Figura 6).
19
INTRODUCCIÓN
Figura 6. Variantes alélicas de gliadinas de trigo duro identificadas como bloques de
bandas (Kudryavtsev et al., 1996).
20
INTRODUCCIÓN
5.2.Gluteninas
Las gluteninas son grandes moléculas formadas por subunidades de polipéptidos
unidas por puentes disulfuro. Las distintas subunidades pueden separarse rompiendo los
enlaces intermoleculares por reducción u oxidación fuerte. Cuando la reducción se
realiza con sodio dodecil sulfato (SDS) y se separan en geles de poliacrilamida (SDSPAGE) se diferencian dos tipos de subunidades; las gluteninas de alto peso molecular
(HMW) y las de bajo peso molecular (LMW) (Figura 7). En trigo duro el número de
subunidades de gluteninas HMW varía de 1 a 3. Las gluteninas LMW a su vez se
separan en tres tipos de subunidades las B, C y D.
Figura 7. Separación de gluteninas de trigo duro en gel de SDS-PAGE (Ruiz et al.,
2005).
21
INTRODUCCIÓN
Los genes que controlan las subunidades de gluteninas HMW, Glu-A1 y Glu-B1,
se localizan en el brazo largo de los cromosomas del grupo 1 (Payne et al., 1980;
Lawrence y Shepherd, 1981) (Figura 5). Cada locus Glu-1 contiene dos genes
estrechamente ligados, que codifican dos subunidades de gluteninas de alto peso
molecular, denominados “x” e “y” (Payne et al., 1981). El gen “y” del locus Glu-A1 no
se expresa nunca y el “x” raramente (Pogna y Mellini, 1988). Los alelos de gluteninas
HMW se nombran con letras minúsculas, aunque suelen describirse numerando las
subunidades codificadas por los dos genes de cada locus, uniéndose los números con un
signo más (+) cuando se expresan ambos genes (Payne y Lawrence, 1983) (Tabla 2).
Tabla 2. Variación alélica de los loci Glu-A1 y Glu-B1 de gluteninas HMW y las
subunidades que sintetizan.
Locus
Glu-A1
Glu-B1
Alelo
a
b
c
f
a
b
d
e
f
i
u
z
an
as
at
Gluteninas HMW
1
2*
Null
2••
7
7+8
6+8
20x + 20y
13 + 16
17 + 18
7* + 8
7+15
6
13
13+18
Los genes que codifican las subunidades de gluteninas B y C de bajo peso
molecular se localizan en el brazo corto de los cromosomas del grupo 1 (Jackson et al.,
1983; Payne et al., 1984a). En el trigo duro, los loci principales que controlan la síntesis
de las subunidades B-LMW son Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 (Gupta y Shepherd, 1988;
Ruiz y Carrillo, 1993; Liu, 1995), y están estrechamente ligados a los loci de gliadinas
Gli-A1, Gli-B1 y Gli-B3, respectivamente (Pogna et al., 1990; Ruiz y Carrillo, 1993; Liu
y Sepherd, 1995). Liu y Shepherd (1995) encontraron el locus Glu-B4 que, como el
Glu-B2, codifica una subunidad B-LMW de gluteninas (Figura 5). Se ha podido
observar que muchas subunidades B-LMW de gluteninas se heredan conjuntamente
(Gupta y Shepherd, 1988), formando diferentes modelos que se repiten en las
22
INTRODUCCIÓN
variedades. En trigo duro, los más estudiados son el LMW-1 y el LMW-2 (Figura 7),
aunque también se han encontrado otros modelos de gluteninas como LMW-1-, LMW2*, LMW-2- (Carrillo et al., 1990; Carrillo et al, 1991; Ruiz y Carrillo, 1993; Vázquez
et al., 1996). Todos ellos se agrupan en modelos de tipo 1 y de tipo 2, dependiendo de la
ausencia o presencia, respectivamente, de la banda más ancha y de menor movilidad en
el gel de electroforesis. Aunque esta nomenclatura y metodología de estudio de los
modelos de las B-LMW ha sido ampliamente utilizada, se ha demostrado que los
modelos están formados por subunidades codificadas en loci distintos (Ruiz y Carrillo
1995a, b; Vázquez et al., 1996). Nieto-Taladriz et al. (1997) estudiaron la variación
alélica en cada uno de los loci implicados en la síntesis de las subunidades B-LMW de
gluteninas. En la Tabla 3 se puede apreciar como casi todos los modelos de gluteninas
B-LMW presentan varias combinaciones de alelos codificados en los loci Glu-A3, GluB3 y Glu-B2. Cada alelo se denomina con una letra y se describe con la numeración de
las subunidades (Figura 8).
23
INTRODUCCIÓN
Tabla 3. Equivalencia entre modelos de gluteninas B-LMW y la composición alélica
encontrada por Nieto-Taldriz et al. (1997). Se indica la -gliadina del Gli- 1 ligada a
cada modelo.
Model
LMW-1
LMW-1LMW-2
LMW-2-
Glu-A3
b
b
b
e
h
a
c
d
c
f
c
g
h
h
e
e
e
LMW-2* d
Glu-B3
b
b
i
i
b
a
a
a
c
a
f
g
Glu-B2
a
b
b
b
b
a
a
b
b
b
a
a
-gliadin (Gli- 1)
42
42
Null
Null
42
45
45
45
45
45
45
45
a
c
d
e
f
h
a
b
a
a
a
b
45
45
45
45
45
44
Figura 8. Variación alélica de los loci Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2 de las gluteninas BLMW (Nieto-Taladriz et al., 1997).
24
INTRODUCCIÓN
Se ha visto que existe una gran homología entre las secuencias de nucleótidos
de las gliadinas y las gluteninas, especialmente con las de bajo peso molecular, lo que
hace pensar que posiblemente proceden de la misma proteína ancestral (Shewry y
Tatham, 1990). También comparten la característica de ser muy variables debido a la
presencia de un gran número de alelos por cada locus complejo, por ello las gluteninas
se han empleado, a veces, para estudiar la diversidad genética de las colecciones de
trigo (Liu et al., 2007). Sin embargo, el polimorfismo de las gluteninas, en especial el
de las de alto peso molecular, es menor, posiblemente debido a que los bloques alélicos
de gluteninas presentan un número menor de subunidades que los de gliadinas. Por otro
lado, las gluteninas están estrechamente relacionadas con la calidad del gluten (Autran
et al., 1987), de tal manera que los agricultores primero, y los mejoradores después, al
buscar los trigos de mejor calidad, indirectamente han ido seleccionando algunas
variantes alélicas de gluteninas, por lo que finalmente la diversidad intra e intevarietal
es menor. Esto hace que en la práctica las gluteninas sean peores marcadores que las
gliadinas para realizar análisis de diversidad genética e identificar variedades. Sin
embargo, sí se han realizado numerosos estudios de variabilidad de gluteninas para
conocer su relación con la calidad (Rodríguez de Quijano et al., 1990; Yan et al., 2003;
Cherdouh et al., 2005; Giraldo et al., 2010).
A pesar del polimorfismo de las proteínas del endospermo, especialmente de las
gliadinas, no hay que olvidar que no están distribuidas por todo el genoma (Figura 5).
Por eso, en ocasiones es posible que en un banco de germoplasma haya que emplear
otro tipo de marcadores polimórficos para el trigo; por ejemplo, para el estudio de un
material homogéneo con poca diversidad genética.
5.3.SSRs
Para la caracterización del germoplasma vegetal con marcadores de ADN,
existen actualmente una gran variedad de técnicas moleculares (Lörz y Wenzel, 2004).
En este contexto, varios autores han demostrado que los microsatélites (SSRs) son
marcadores genéticos con una distribución uniforme en el genoma del trigo (Röder et
al., 1998; Maccaferri et al., 2003). Además, presentan las siguientes ventajas sobres
otros marcadores de ADN como AFLPs, RAPDs, RFLPs: tienen mayor grado de
polimorfismo, segregan de manera mendeliana, son codominantes y selectivamente
neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendramin et al., 1996). La presencia de, en
25
INTRODUCCIÓN
general, un solo locus genético por SSR hace que la lectura de las bandas sea clara y
fácil de interpretar. Por otro lado, los resultados son reproducibles y han mostrado ser
útiles para analizar grandes colecciones (Penner et al., 1995; Röder et al., 1998; Paull et
al., 1998). También tienen la ventaja de que detectan variaciones en loci individuales,
lo que es muy útil para la identificación de genotipos. Dependiendo del polimorfismo
de los microsatélites seleccionados, se estima que con un número medio de 20 SSRs
bien repartidos en distintos cromosomas se pueden discriminar un gran número de
variedades, incluso genotipos de trigo muy relacionados (Plaschke et al., 1995). Por
todo ello, los microsatélites son los marcadores de ADN más empleados en el trigo. Se
han realizado estudios con trigo duro para la construcción de mapas de ligamiento
(Korzun et al., 1999) y para el análisis de diversidad e identificación de variedades
locales y cultivares modernos (Dograr et al., 2000; Ben Amer et al., 2001; Maccaferri
et al., 2003; Alamerew et al., 2004; Medini et al., 2005; Li et al., 2006; Yifru et al.,
2006; Khanjari et al., 2007; Wang et al., 2007; Ganeva et al., 2010).
Los microsatélites fueron descritos por primera vez por Hamada et al. (1982)
como secuencias cortas de ADN constituidas por motivos de 1 a 6 nucleótidos
repetidos en tandem. En comparación con otros marcadores, los SSRs son más
abundantes. El gran interés de los investigadores por los SSRs ha suscitado la
búsqueda, por todo el genoma, de cada vez más microsatélites y el desarrollo de los
cebadores específicos. En la actualidad existen más de 1000 SSRs de trigo disponibles.
Somers et al. (2004) emplearon 1.235 microsatélites para crear el mapa genético más
denso publicado de trigo blando. Se ha demostrado que muchos de los SSRs utilizados
en trigo hexaploide pueden aplicarse a trigos tetraploides y diploides, y a otras especies
afines (Plaschke et al. 1995; Fahima et al., 1998; Korzun et al., 1999). Esta versatilidad
hace de los SSRs unos marcadores muy interesantes para los bancos, ya que permite su
uso no solo en el germoplasma del trigo blando y duro, sino también en otras especies
relacionadas.
6.Evaluación de la calidad de las colecciones de trigo duro
El concepto de calidad del trigo duro varía según los criterios e intereses de los
distintos agentes implicados en el proceso productivo. El agricultor precisa variedades
altamente productivas, que mantengan un rendimiento estable frente a las condiciones
medioambientales, resistentes a estreses bióticos y abióticos, y que no requieran
26
INTRODUCCIÓN
demasiados insumos para maximizar la rentabilidad del cultivo. Por otro lado, no hay
que olvidar que el producto final debe satisfacer al consumidor, que requiere una pasta
con buena calidad culinaria.
La calidad del trigo duro depende directamente de las características del gluten,
que se forma cuando las gliadinas y las gluteninas se mezclan con agua formando una
masa de proteínas cohesionada. Por tanto, las características y cantidad de estas
proteínas son aspectos muy importantes que afectan a la calidad del trigo y a las
propiedades viscoelásticas al gluten (Khan y Bushuk, 1979). Las gluteninas son las
responsables de la elasticidad mientras que las gliadinas confieren, principalmente,
viscosidad y extensibilidad a la masa. En un principio, se vio que estas propiedades
estaban estrechamente relacionadas con la presencia de algunas
y -gliadinas y
algunas subunidades de gluteninas B-LMW (Damidaux y Feillet, 1978; Carrillo et al.,
1990), codificadas por los loci Gli-B1 y Glu-B3, respectivamente. Se observó que se
obtenían trigos con diferente calidad del gluten según las diferentes combinaciones
alélicas de estos loci (Figuras 4 y 7). Las dos combinaciones más frecuentes en todas
las colecciones de trigo son:
-33-35-38 -42/ LMW-1 y
-35 -45/LMW-2 que
proporcionan baja y alta calidad del gluten, respectivamente. Sin embargo, al analizar
la calidad de otras combinaciones menos frecuentes de estos loci, se vio que las
subunidades de gluteninas presentes en el modelo LMW-2 eran las que por si solas
tenían un efecto muy positivo en la calidad (Pogna et al., 1990; Ruiz y Carrillo, 1995a)
y que la estrecha relación de la subunidad -45 de gliadinas con la calidad no era
funcional. Sin embargo, parece que las gliadinas no son solo meros marcadores de
calidad. Las
-gliadinas son las subunidades que parecen influir de una forma más
clara, apreciándose una correlación negativa entre la presencia de estas bandas y varios
parámetros de calidad, de tal manera que las variedades con gluten débil tienen mayor
cantidad de -gliadinas que las de gluten fuerte (Tatham y Shewry, 1995). Martínez et
al. (2005) encontraron que la gliadina ω-35 del locus Gli-B1 mostraba un efecto
positivo sobre la fuerza del gluten. Se ha observado también un efecto más favorable de
la variante α-2 frente a la α-1 (Gli-A2) (Pogna et al., 1990).
En trigo duro, la influencia de las gluteninas HMW es menor que en trigo
blando, y los estudios realizados muestran resultados contradictorios (Vallega, 1986; du
Cros, 1987; Boggini y Pogna, 1989; Pogna et al., 1990; Carrillo et al., 1990; Kovacs et
al., 1993; Kaan et al., 1993). Diversos trabajos han constatado la mala influencia del
27
INTRODUCCIÓN
alelo c (nulo) del locus Glu-A1 en la calidad, observándose que se produce un efecto
favorable con la presencia de alguna subunidad (du Cros, 1987; Kaan et al., 1993;
Ciaffi et al., 1991; Turcheta et al., 1995; Porceddu et al., 1998). Respecto al Glu-B1, se
ha visto que la presencia de las subunidades 20x+20y (alelo e) provoca un efecto
claramente negativo en la fuerza del gluten (Carrillo et al., 1990; Vázquez et al., 1996),
mientras que los alelos que proporcionan mayor fuerza al gluten son el b (7+8) (Pogna
et al., 1990) y el d (6+8) (Martínez et al., 2005). En este último trabajo, se observó una
interacción alélica entre los loci Gli-B1 y Glu-B1, de manera que la presencia de la
gliadina ω-35 incrementaba el efecto positivo de las subunidades 6+8 y el efecto
negativo de las subunidades 20x+20y en la calidad.
Con respecto a las gluteninas LMW, diversos trabajos han estudiado la relación
entre los diferentes modelos de gluteninas B-LMW y la calidad (Payne et al., 1984b;
Pogna et al., 1988, 1990; Carrillo et al., 1990, 1991; Kovacs et al., 1995; Ruiz y
Carrillo, 1995b). Ruiz y Carrillo (1995b) y Vázquez et al. (1996) ordenaron los
diferentes modelos de gluteninas B-LMW según su efecto positivo en la fuerza del
gluten como sigue: LMW-2 = LMW-2- > LMW-2* >LMW-1= LMW-1-. Estudios
posteriores (Ruiz y Carrillo 1995a, b; Vázquez et al., 1996) han demostrado que no es
del todo correcto estudiar la calidad del gluten en función de los modelos, ya que éstos
están formados por subunidades codificadas en los loci Glu-A3, Glu-B3 y Glu-B2
(Tabla 3). Por tanto, la relación de las gluteninas B-LMW con la calidad tiene que
estudiarse separadamente para cada locus Glu-3 y Glu-2.
En el trabajo de Carrillo et al. (2000) se ha estudiado la influencia de los alelos
de los loci Glu-A3 y Glu-B3 sobre la viscoelasticidad del gluten evaluada con
diferentes test reológicos (test de sedimentación o test SDSS, el mixógrafo y el
alveógrafo). Los alelos que proporcionaron mejores propiedades reológicas para el
locus Glu-A3 fueron h, c, d y a, en este orden, mientras que los alelos g, f, e y b dieron
bajos valores de viscoelasticidad (Tabla 4). En este trabajo se vio que, en general, las
variantes alélicas del locus Glu-B3 tuvieron un efecto mucho mayor en la calidad que
las de otros loci. Dentro del Glu-B3, los alelos se clasificaron según la viscoelasticidad
en tres grupos; los alelos a y c mostraron los mejores valores, los alelos g, d, f y h
dieron valores intermedios, mientras que los b, i y e formaron el grupo de alelos con
peores resultados (Tabla 5).
28
INTRODUCCIÓN
Tabla 4. Clasificación de los alelos del locus Glu-A3 según el valor obtenido (de mayor
a menor) en varios test de calidad: test de sedimentación (SDSS), tiempo de mezcla
(MT) y altura máxima del pico (PH) del mixógrafo, y fuerza (W) y extensibilidad (L)
del alveógrafo (Carrillo et al., 2000).
Rango de variación de mayor a menor valor
SDSS
h
c
d
a
g
f
e
MT
a
h
c
d
g
f
e
PH
h
d
f
c
a
g
e
W
h
d
c
a
e
g
b
L
g
f
d
h
c
a
b
b
b
b
f
e
Tabla 5. Clasificación de los alelos del locus Glu-B3 según el valor obtenido (de mayor
a menor) en varios test de calidad: test de sedimentación (SDSS), tiempo de mezcla
(MT) y altura máxima del pico (PH) del mixógrafo, y fuerza (W) y extensibilidad (L)
del alveógrafo (Carrillo et al., 2000).
Rango de variación de mayor a menor valor
SDSS
c
a
g
d
f
h
b
i
MT
a
c
g
d
f
h
b
i
PH
c
a
h
f
g d
b
i
W
c
a
f
d g
b
L
g
c
a
f
d
b
e
e
e
i
i
Se ha visto que las subunidades de gluteninas B-LMW proporcionan un criterio
mejor para la selección de líneas para la mejora de la calidad del trigo duro. Suponen
una excelente herramienta que permite seleccionar, en generaciones tempranas, líneas
que contengan las mejores combinaciones alélicas (Ruiz y Carrillo, 1995b). La
diversidad genética de las colecciones conservadas en los bancos puede proporcionar
combinaciones alélicas muy útiles para la mejora. Por esta razón, el análisis de la
variabilidad alélica y evaluación de las colecciones de trigo duro es importante para
identificar genotipos con mejor calidad. De hecho, varios trabajos han mostrado que las
variedades locales, que hoy día solo se encuentran en los bancos germoplasma, son
especialmente útiles para suministrar nuevos alelos de loci de proteínas relacionadas
con la fuerza del gluten (Carrillo et al., 1991; Porceddu et al., 1998; Raciti et al., 2003).
29
INTRODUCCIÓN
Diferentes estudios han demostrado que existe una correlación positiva entre la
calidad culinaria y el aumento del contenido proteico del grano (Dexter y Matsuo, 1977;
D´Egidio et al., 1990). El contenido de proteína es un carácter complejo de control
poligénico cuantitativo (Joppa y Cantrell, 1990; Cantrell y Joppa, 1991), con baja
heredabilidad y una alta influencia ambiental. Debido a estos condicionantes, el estudio
de la genética de este carácter es complicado. Actualmente no existe consenso acerca de
que los genes que lo controlan, ni siquiera cuáles son los cromosomas que intervienen
en su regulación. Por ejemplo, Levy et al. (1988) y Levy y Feldman (1989) encontraron
que el porcentaje de proteína estaba controlado por cuatro genes mayores localizados en
los cromosomas de los grupos de homeología 1, 5 y 7. Mientras que Joppa y Cantrell
(1990) vieron que los cromosomas que afectaban al contenido en proteína eran el 2A,
3A, 3B, 4B, 6A, 6B y el 7B. Sin embargo, según Carrillo et al. (2006), no se han
encontrado genes mayores que regulen este carácter, pero si varios QTLs, que en trigo
duro son seis, y se localizan uno en cada brazo corto de los cromosomas 4A, 5A, 6B y
7B y dos en el 6A (Blanco et al., 1996).
La cantidad de proteína en una variedad de trigo duro puede variar entre un 8 y
un 17 por ciento, dependiendo de la variedad y de aspectos externos asociados al cultivo
(Carrillo et al., 2006), particularmente del abonado nitrogenado (Ames et al., 2003).
Trigos con un contenido en proteína de hasta un 13% pueden proporcionar una
excelente calidad para pasta, mientras que con niveles por debajo del 11% generalmente
resulta un producto final de pobre calidad (Matveef, 1966). En la mayoría de los
entornos de producción, se da, frecuentemente, una fuerte correlación negativa entre la
cantidad de proteína del grano y el rendimiento (Johnson et al., 1985; Mariano et al.,
1994; Blanco et al., 1996). Por lo general, estos dos factores responden positivamente
cuando se aumentan los niveles de nitrógeno, incrementándose el rendimiento y el
contenido en proteína. Sin embargo, en ocasiones, debido a razones económicas o
ecológicas, es preciso reducir el abonado nitrogenado. En estos casos, puede ser
necesario emplear variedades más eficientes en el aprovechamiento de los nutrientes.
Las variedades locales se caracterizan por poseer una estabilidad razonable de la
producción bajo sistemas de agricultura sostenible. La capacidad de este germoplasma
de emplear pocos insumos en su cultivo, lo convierte en una fuente de genes para la
estabilidad de los rendimientos, la tolerancia a los estreses y para la calidad. La
evaluación de variedades locales y cultivares antiguos para calidad y rendimiento, a
bajas dosis de abonado nitrogenado, es importante para identificar genotipos adaptados
30
INTRODUCCIÓN
a la aplicación de niveles reducidos de nitrógeno, que mantengan rendimientos
aceptables con una buena calidad del gluten.
7.Objetivos
Esta tesis plantea dos objetivos generales:
Objetivo 1: determinar la utilidad de los marcadores moleculares (proteínas del
endospermo y SSRs) para la racionalización de las colecciones de trigo.
Objetivo 2: Analizar la influencia del genotipo de prolaminas y de las condiciones de
cultivo en la calidad del trigo duro.
Para realizar este estudio se ha elegido la colección de trigo duro (Triticum
turgidum L.) y la de T. monococcum L. del CRF-INIA.
Dentro de cada objetivo se analizan diferentes submuestras de material y se
incluyen una serie de objetivos específicos.
Objetivo 1
Material:
17 variedades locales españolas de T. monococcum L
Submuestra de 51 accesiones de trigo duro. La elección de las accesiones se basará
en los siguientes criterios utilizando los resultados de Ruiz y Aguiriano (2004):
-Variedades similares agro-morfológicamente y en gliadinas.
-Variedades diferentes en algún carácter agro-morfológico pero similares
en gliadinas.
-Variedades diferentes en algunos caracteres agro-morfológicos y en
gliadinas.
-Accesiones heterogéneas que incluyan distintos genotipos de gliadinas.
31
INTRODUCCIÓN
Objetivos específicos:
Selección y análisis de los SSRs más adecuados para la identificación de
variedades locales españolas de T. monococcum L. (Cap. 2) y de trigo duro
(Cap. 3).
Identificación genética con alelos de gliadinas y SSRs de variedades locales
españolas de trigo duro (Cap. 1 y Cap. 3) y de T. monococcum L. (Cap. 2).
Análisis de la variabilidad genética intra- e inter-varietal con gliadinas y SSRs en la
colección de T. monococcum L. (Cap. 2) y en la de trigo duro (Cap. 1 y 3).
Uso de las proteínas del endospermo y SSRs para detectar y confirmar duplicados
potenciales en trigo duro (Cap. 3).
Objetivo 2
Material: submuestra representativa de la colección formada por variedades locales
procedentes de todas las zonas agro-ecológicas españolas y que posea una amplia
diversidad agro-morfológica.
Objetivos específicos:
Caracterización genética de las proteínas del endospermo con influencia en la
calidad (gliadinas y gluteninas) de una submuestra de variedades locales de la
colección de trigo duro del CRF-INIA (Cap. 4).
Evaluación de la calidad de la submuestra, determinando el contenido en proteína y
la fuerza del gluten, para dos niveles de abonado nitrogenado y en dos años
(Cap. 5).
Estudio de la influencia de las variantes alélicas de gliadinas y gluteninas, del año y
del abonado nitrogenado en los parámetros de calidad analizados (Cap. 5).
La presente memoria de tesis doctoral se compone de 5 capítulos elaborados
como entidades independientes de información, que han sido publicados como artículos
científicos en revistas de impacto.
32
CAPÍTULO 1
ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY IN A SAMPLE
OF THE DURUM WHEAT (Triticum durum Desf.) SPANISH
COLLECTION BASED ON GLIADIN MARKERS *
*
Edurne Aguiriano, Magdalena Ruiz, Rosario Fite and Jose M. Carrillo. 2006. Analysis
of genetic variability in a sample of the durum wheat (Triticum durum Desf.) Spanish
collection based on gliadin markers. Genetic Resources and Crop Evolution 53:1543–
1552.
33
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
CAPÍTULO 1. ANALYSIS OF GENETIC VARIABILITY IN A SAMPLE OF
THE DURUM WHEAT (Triticum durum Desf.) SPANISH COLLECTION BASED
ON GLIADIN MARKERS
1.Abstract
In this work gliadin proteins were used to analyse the genetic variability in a
sample of the durum wheat Spanish collection conserved at the CRF-INIA. In total 38
different alleles were identified at the loci Gli-A1, Gli-A3, Gli-B5, Gli-B1, Gli-A2 and
Gli-B2. All the gliadin loci were polymorphic, possessed large genetic diversity and
small and large differentiation within and between varieties, respectively. The Gli-A2
and Gli- B2 loci were the most polymorphic, the most fixed within varieties and the
most useful to distinguish among varieties. Alternatively, Gli-B1 locus presented the
least genetic variability out of the four main loci Gli-A1, Gli-B1, Gli-A2 and Gli-B2.
The Gli-B1 alleles coding for the gliadin γ-45, associated with good quality, had an
accumulated frequency of 69.7%, showing that the Spanish germplasm could be a good
source for breeding quality. The Spanish landraces studied showed new gliadin alleles
not catalogued so far. These new alleles might be associated with specific Spanish
environment factors. The large number of new alleles identified also indicates that
durum wheat Spanish germplasm is rather unique.
Key words: A-PAGE, Genetic variability, Germplasm, Gliadin alleles, Triticum
durum
2.Introduction
Genetic diversity stored in genebanks should be carefully and comprehensively
analysed to serve as an effective basis for conservation and improved access to plant
genetic resources. Monitoring of intra and inter-cultivar polymorphism is essential for
adequate management of accessions to maintain unchanged its genetic composition,
including their heterogeneity. It will enable to preserve not only the sample as such, but
also its valuable properties as multilocus combinations suitable for specific
environments of the country concerned. In this context, an important goal of genebank
activities is the genetic identification and registration of accessions in the collections
35
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
using quick, reliable and efficient analysis of polymorphic genetic markers. In wheat
germplasm collections, traditional approaches are based on morphological characters
which have some limitations related to small polymorphism and variation under
different environmental conditions. The gliadin protein markers, as primary products of
gene expression, are not affected by the plant growth environment and can reveal small
changes (e.g. mutations) inaccessible to visual examinations. Gliadin alleles are
inherited co-dominantly, they have revealed large levels of inter-varietal polymorphism
and identification of a genotype is possible immediately by the electrophoretic protein
phenotype. The gliadin loci control the synthesis of a group of proteins named as blocks
of gliadins. The main Gli loci are located on the chromosomes of the first (Gli-1) and
sixth (Gli-2) homoeologous groups (Payne et al. 1982), although other minor loci have
been also found in these chromosomes (Sobko 1984; Pogna et al. 1993; Felix et al.
1996). The polymorphism of the gliadin alleles of common and durum wheat has been
described previously, catalogues of the blocks have been compiled and their
nomenclatures
proposed
(Metakovsky
1991b;
Kudryavtsev
1994).
Gliadin
electrophoresis offers advantages in evaluating wheat genetic resources in comparison
to DNA molecular markers, as it is cheaper and less labour intensive to detect the
polymorphism. For these reasons, several studies have analysed genetic gliadin
polymorphism of wheat collections, mainly of common wheat, from different countries
(Metakovsky et al., 1990, 1991b, 1993, 1994, 2000; Kudryavtsev et al., 1996;
Metakovsky and Branlard 1998). These studies have indicated that gliadin alleles are
very efficient molecular markers to be applied in genetic analysis and to trace out
genealogies of wheat cultivars.
The diversity of old varieties and forms preserved in Gene Banks is an important
source of genetic variability and consequently of valuable traits for wheat improvement.
In a previous work, analysis of genetic variability of common wheat landraces
maintained at the CRF-INIA showed that common wheat Spanish germplasm is largely
polymorphic and rather unique for gliadin alleles (Ruiz et al. 2002b). In this paper, the
genetic diversity of a group of landraces and old cultivars from the durum wheat
Spanish collection was characterised by gliadin polymorphism. The structure of the
genetic variation was analysed and the results discussed to facilitate the use of the
collection.
36
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
3.Material and methods
3.1. Materials
Seventeen Spanish landraces, two Spanish bred varieties (‘Ledesma’ and
‘Lebrija’), two cultivars from Italy (‘Himera’ and ‘Senatore Capelli’), one from
Portugal (‘Marques’) and one from USA (‘Mindum’) were selected from the durum
wheat collection maintained in the Plant Genetic Resources Centre (CRF-INIA) in
Spain. All these materials were released before 1960s and maintained, except
‘Andalucia-344’, in more than one accession at the CRF-INIA. The samples conserved
in more than one entry had unknown or similar geographic origin and they were
conserved by different breeders or collected in different years. A total of 51 accessions,
and at least two per variety, were examined to determine the polymorphism and the
structure of genetic diversity of the material.
3.2. Gliadin analysis
Gliadins were extracted from single seeds and fractionated in acid (pH 3.1)
polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) according to Lafiandra and Kasarda
(1985). Identification of the Gli-1, Gli-2, Gli-B5 and Gli-A3 alleles in the protein
spectra were performed following the catalogues and nomenclatures proposed by
Kudryavtsev (1994) and Kudryavtsev et al. (1996). The Russian and Italian varieties
analysed by Kudryavtsev (1994) and Kudryavtsev et al. (1996), respectively were used
as test varieties for allele identification. All the results of the comparisons with the
standards were reproduced at least in two runs. The new alleles found in the present
work were termed as ‘new-’. As a minimum of 10 grains per accession were analysed
for intra-variety characterisation. The genetic control of the alleles b, c, e and g at GliA1, a and c at Gli-B1 and k at Gli-B2 were previously analysed (Ruiz 1993; Ruiz and
Carrillo 1993; Martinez 2001) in the F2 progeny of eight crosses involving 11 Spanish
landraces and old cultivars. These varieties were run with the Italian test varieties
(Kudryavtsev et al. 1996) to check that the same gliadin block variants were obtained in
the A-PAGE procedure used by us (Lafiandra and Kasarda 1985) and by Kudryavtsev et
al. (1996).
37
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
3.3. Statistical analysis
To analyse the gliadin gene diversity within and between varieties the following
genetic parameters were calculated in all populations: alleles per locus (A); effective
number of alleles per locus (ne) and total gene diversity over populations (Ht) divided
into average gene diversity within (Hs) and between (Dst) populations (Nei 1973). The
relative magnitude of gene differentiation between populations (Gst) was estimated as
Dst/Ht. The genetic distance of Rogers (1972) as modified by Wright (1978) was used
to build the UPGMA clustering phenogram, computed with the NTSYS-pc software
(Rohlf 1992). The data file was made recording by a set of 0 and 1 the presence/absence
of each allele.
4.Results
Gliadin allele composition of the varieties studied is indicated in Table 1.
Altogether 34 gliadin genotypes were identified in the 23 varieties analysed (genotype 3
of ‘Granja de Badajoz’ and ‘Recio de Baza’ are identical). The two accessions of the
cultivar ‘Mindum’ showed different gliadin phenotype, so they were studied separately
and designated ‘Mindum 1’ and ‘Mindum 2’. Fifteen varieties (65%) were characterised
by one specific type of gliadin genotype and identified as monomorphic. Eight
accessions comprised two, three or four different gliadin genotypes, so they were
considered polymorphic. All varieties, including the heterogeneous accessions,
displayed one gliadin genotype with a frequency at least of 70% (genotype 1) which
was considered the genotype of the variety. All the variety genotypes were genetically
unique.
38
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
Table 1. Gliadin alleles composition of 17 Spanish landraces and six old cultivars from
the durum wheat Spanish collection.
Variety
Alaga
Almendral
Almendral
Andalucía 344
Andalucía 344
Andalucía 344
Blanquillon de Boñar
Blanco de Corella
Berberisco
Berberisco
Carita de Ratón
Fanfarrón
Forment
Granja de Badajoz
Granja de Badajoz
Granja de Badajoz
Himera
Lebrija
Lebrija
Lebrija
Lebrija
Ledesma
Marques
Marques
Mindum 1
Mindum 2
Recio de Baza
Reción
Rubio de Badajoz
Rubio de Miajadas
Semental
Semental
Senatore Capelli
Torcal
Verdial
Genotype
number
1
1
2
1
2
3
1
1
1
2
1
1
1
1
2
3
1
1
2
3
4
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
Genotype
frequency
1
0.85
0.15
0.70
0.20
0.10
1
1
0.80
0.20
1
1
1
0.90
0.05
0.05
1
0.80
0.10
0.05
0.05
1
0.95
0.05
1
1
1
1
1
1
0.95
0.05
1
1
1
Gli-A1
Gli-A3
Gli-B5
Gli-B1
Gli-A2
Gli-B2
b
b
b
b
b
c
b
b
e
c
e
g
b
e
c
b
c
b
new-2
b
b
c
c
c
c
a
b
b
e
b
new-1
new-1
c
e
e
–
a
a
–
–
–
–
–
–
a
–
a
a
–
–
–
a
a
–
–
a
–
–
a
–
–
–
–
–
a
–
–
a
–
a
a
o
a
o
o
o
A
a
o
o
o
O
a
a
a
o
o
O
a
O
a
o
o
o
a
a
o
o
a
a
o
o
o
a
o
new-1
b
new-1
new-5
new-4
new-5
new-1
new-1
c
c
c
a
new-2
c
c
b
c
b
c
new-3
new-1
c
c
c
a
a
b
c
b
c
a
a
c
c
c
k
f
f
g
g
g
k
f
new-1
new-1
new-2
g
a
b
g
new-3
g
o
o
o
o
g
b
b
f
a
new-3
new-1
a
new-4
b
b
o
new-2
new-4
new-1
h
h
h
h
h
l
new-1
l
l
t
new-4
new-2
t
h
h
t
h
h
h
h
h
new-3
new-3
h
a
h
t
new-5
h
a
new-6
h
t
l
new-: new allele
Table 2 presents the different alleles detected at the loci analysed and their
frequency. A total of 38 different alleles were identified for the Gli-A1, Gli-A3, Gli-B5,
Gli-B1, Gli-A2 and Gli-B2 loci. For the Gli-A3 the presence or absence of allele a
(Figure 1: line 1) was analysed. The most polymorphic loci were Gli-A2 and Gli-B2,
both with 10 alleles, though the effective number of alleles at Gli-A2 locus was 8.987,
larger than 5.192 at Gli-B2 (Table 3). The most frequent alleles at each locus were GliA1b (41.08%), Gli-A3a absence (65.56), Gli-B5o (56.02), Gli-B1c (46.06%), Gli-A2g
39
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
(17.01%) and Gli-B2h (34.02%). The most common allele at each locus presented a
frequency larger than 30%, except for Gli-A2. A total of 17 new alleles, not previously
catalogued (designated as ‘new’) were found at the four main loci Gli-A1, Gli-B1, GliA2 and Gli-B2. The blocks of the new allelic variants identified are illustrated in Figure
1. Gli-B1 and Gli-B2 presented the largest number of new alleles. In general, the
frequency of the new alleles was small (<8.30) except for Gli-B1new-1 (Table 2). GliA1new-2 (characterised by the absence of any known gliadin encoded at Gli-A1), GliB1new-3 and Gli-B2new-6 (Figure 1: lines 4, 3 and 16, respectively) were unique
alleles, only present in one grain. Moreover, 12 alleles were rare, with a frequency
below 5% (Table 2). In general, the new alleles at Gli-A2 and Gli-B2, except for GliB2new-6 were present in the variety genotype (genotype 1 in Table 1). Also, all new
alleles at Gli-A2 were present in more than one variety. Respect to the Gli-B1 new
alleles, new-4 (Figure 1: line 12) contains γ-45 gliadin, and new-1 and new-3 (Figure 1:
lines 9 and 3, respectively) encoded γ-44. Neither new-2 (coding for γ-43 and 46) nor
new-5 (Figure 1: lines 10 and 15, respectively) included the most typical γ -gliadins 42,
44 nor 45, in fact the allele new-5 coded for none γ-gliadin.
Table 2. Alleles and frequencies at each of the six gliadin loci in the 17 Spanish
landraces and six old cultivars from the durum wheat Spanish collection.
Gli-A1
Gli-A3
Gli-B5
Gli-B1
Gli-A2
Gli-B2
a
4.15
34.44
43.98
16.60
12.45
7.88
b
41.08
14.11
12.03
c
23.24
46.06
e
22.82
f
12.45
g
4.15
17.01
h
34.02
l
12.45
k
8.30
o
56.02
8.71
t
20.33
new-1
4.15
14.52
8.30
8.30
new-2
0.41
4.15
8.30
4.15
new-3
0.41
4.15
4.15
new-4
0.83
8.30
4.15
new-5
3.32
4.15
new-6
0.41
?
65.56
new-: new allele; ?: absence of allele a.
40
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
Figure 1. Gliadin electrophoretic patterns of the variety genotypes (gt.) and test
varieties. Up line 1 to 15: 1) ‘Langdon’; 2) ‘Semental’ gt. 1; 3) ‘Lebrija’ gt. 3; 4)
‘Lebrija’ gt. 2; 5) ‘Lebrija’ gt. 4; 6) ‘Langdon’; 7) ‘Alaga’ gt. 1; 8) ‘Simeto’; 9) ‘Blanco
de Corella’ gt. 1; 10) ‘Forment’ gt. 1; 11) ‘Izumrud’; 12) ‘Andalucia-344’ gt. 2; 13)
‘Simeto’; 14) ‘Langdon’; 15) ‘Andalucia-344’ gt. 1. Botton line 16 to 31: 16)
‘Semental’ gt. 2; 17) ‘Semental’ gt.1; 18) ‘Rubio de Badajoz’ gt. 1; 19) ‘Marques’ gt. 1;
20) ‘Langdon’; 21) ‘Trinakria’; 22) ‘Fanfarron’ gt. 1; 23) ‘Langdon’; 24) ‘Recion’ gt. 1;
25) ‘Krasnodarskaya’ 362; 26) ‘Torcal’ gt. 1; 27) ‘Messapia’; 28) ‘Messapia’; 29)
‘Recio de Baza’ gt. 1; 30) ‘Langdon’; 31) ‘Verdial’ gt. 1. Blocks controlled by
corresponding new alleles identified in this work are indicated.
41
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
Table 3. Gene diversity within and between durum wheat varieties for each gliadin
locus and for the overall sample of 23 varieties.
Locus
Aa
neb
Htc
Hsd
Dste
Gstf
Gli-A1
Gli-A3
Gli-B5
Gli-B1
Gli-A2
Gli-B2
Mean
7
2
2
8
10
10
6.500
3.571
1.823
1.972
3.526
8.987
5.192
4.178
0.720
0.452
0.493
0.716
0.889
0.807
0.679
0.042
0.047
0.034
0.054
0.008
0.015
0.033
0.678
0.404
0.459
0.663
0.881
0.792
0.646
0.942
0.895
0.931
0.925
0.992
0.981
0.951
a
Alleles per locus.
Effective number of alleles per locus.
c
Total gene diversity.
d
Average gene diversity within varieties.
e
Average gene diversity between varieties.
f
Relative magnitude of gene differentiation between varieties.
b
Statistics of genetic diversity within and between varieties are given in Table 3.
All the loci were polymorphic. The overall gene diversity in the entire sample was Ht =
0.679 with more than 95% of the diversity due to differentiation between varieties (Gst
= 0.951) as opposed to within varieties (Hs = 0.037). In general, all the gliadin loci
presented large genetic diversity (Ht), small genetic variation within varieties (Hs) and
large inter-population differentiation (Gst). The Gli-A2, the most polymorphic locus,
displayed the largest gene diversity and the less intra-variety expected heterozygosity
(Hs). This locus was the most useful to distinguish between varieties (large Dst) and the
most fixed within them (large Gst). In contrast, the Gli-B1 showed the largest intrapopulation gene diversity (Hs) and the smallest genetic diversity between varieties (Gst)
of the four main gliadin loci.
The dendrogram presented in Figure 2 was done with the variety genotypes
(genotype 1 of each variety). The minimum genetic distance between the varieties was
0.41. There were two clearly separated groups, G1 and G2. The G1 was formed by the
cultivars ‘Fanfarron’ and ‘Semental’, both having the Gli-B1a alleles coding for γ-42
gliadin. The G2 included three varieties, ‘Alaga’, ‘Blanquillon de Boñar’ and ‘Blanco
de Corella’, having the Gli-B1new-1 allele, the two genotypes of the foreign cultivar
‘Mindum’ and the landrace ‘Rubio de Badajoz’. The Italian cultivars ‘Himera’ and
‘Senatore Capelli’ were grouped together and with ‘Ledesma’ (G3) according to the
42
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
pedigree of the later (‘Senatore Capelli’ x ‘Rubio de Belalcazar’) and the origin of the
former. The cultivars with foreign origin as ‘Marques’ and ‘Mindum’ were found to be
genetically distant, showing a minimum genetic distance of 0.67 with the Spanish
germplasm.
Genetic distance
Figure 2. Dendrogram of the 17 Spanish landraces and six old cultivars from the durum
wheat Spanish collection based on their dissimilarity in gliadin genotype.
43
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
5.Discussion
In this work gliadins were used to analyse the genetic variability of Spanish
durum wheat samples belonging to the collection conserved at the CRFI-NIA. Due to
previous investigations (Ruiz 1993; Ruiz and Carrillo 1993; Kudryavtsev 1994;
Kudryavtsev et al. 1996; Martinez 2001), almost all possible locations of protein
components could be identified and assigned to the loci Gli-A1, Gli-A3, Gli-B5, Gli-B1,
Gli-A2 and Gli-B2. The alleles detected at Gli-A1 locus were allele c (coding for ω-20–
24, γ-51 and one β gliadin), b (identical to c but lacking the ω-gliadins) and one new
allele (new-1) coding only for ω-24 gliadin (Figure 1: line 2). These results support the
suggestion of Kudryavtsev et al. (1996) about that it is likely that the two ω-gliadins (ω20–24) attributed to Gli-A1c are coded by other locus different from Gli-A1, but tightly
linked to it. Probably, this locus is Gli-A5 mapped 2% from Gli-A1 (Metakovsky et al.
1986, 1996). Nevertheless, in the present work these ω gliadins were included in the
Gli-A1 protein variants until further genetic analyses are carried out. We have also
detected some minor ω gliadins not included in the known blocks at Gli-A1 and Gli-B1.
Analysis of the F2 progeny from one inter-varietal cross indicated that these ω-gliadins
are not coded at Gli-B5 either (results not shown). Probably these fractions are coded at
some minor loci in the chromosomes A or B in agreement with Metakovsky et al.
(1996). In this work, all the gliadin loci analysed were polymorphic, possessed large
genetic diversity and small and large differentiation within and between varieties,
respectively (Table 3). The Gli-A2 and Gli-B2 loci were the most polymorphic, the most
fixed within varieties and the most useful to distinguish between varieties (Tables 2 and
3). Similar results were obtained by Kudryavtsev et al. (1996) in modern Italian durum
wheat cultivars and by Ruiz et al. (2002b) in a group of Spanish bread wheat landraces.
In these studies the loci of the sixth homeologous group showed the greatest variability
and Gli-A2 alleles were the most equally distributed. Alternatively, Gli-B1 locus
presented the least genetic variability out of the four main loci Gli-A1, Gli-B1, Gli-A2
and Gli-B2 (Table 3). By the way, Gli-B1 was the most useful and one of the most
polymorphic loci in discriminating Spanish common wheat varieties (Ruiz et al. 2002a).
These contrasting results between common and durum wheat could be due to the
genetic relationship of Gli-B1 with quality in durum wheat. It is known that alleles at
Gli-B1 code for the gliadins γ-42 and γ-45 used as genetic markers of gluten quality
(Damidaux et al. 1978). In this work, the alleles including the γ-45, associated with
44
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
good quality, had an accumulated frequency of 69.7%, showing that this gliadin was the
most common in the Spanish germplasm. On the other hand, the Gli-B1a (16.60%) was
the only allele coding for the γ-42, associated with poor gluten quality. We can deduce
that durum wheat Spanish germplasm is a good source of protein allelic variants for
breeding quality and to improve the genetic background of modern cultivars. In fact, the
frequencies of Gli-B1 alleles containing γ-45 and γ-42 were 58% and 36%, respectively,
in the bred varieties grown in Spain in the 80s (Carrillo et al. 1990) and 77% and 19%,
respectively, in the bred varieties grown in the 90s (Nieto-Taladriz et al. 1997). The
increase of frequency of Gli-B1 alleles coding for γ-42 in modern bred varieties,
especially in the 80s, respect to landraces could be due to the introduction of foreign
germplasm, mostly from CIMMYT, in the Breeding Programs. However, the
comparisons of data of the 80s and 90s indicate that a selection pressure towards good
gluten quality has been taken place for the last 10 years. The new Gli-B1 alleles, new-1
and new-3 coding for γ-44 (14.93%) and present in the Spanish landraces, have not been
detected in any modern cultivars grown in Spain (Carrillo et al. 1990; Nieto-Taladriz et
al. 1997). The genetic control of allele new-1 from the Spanish landrace ‘Alaga’ was
studied in an earlier research (Ruiz and Carrillo 1993). Kudryavtsev et al. (1996)
pointed out that this allele, also present in cultivar ‘Lambro’, was probably inherited
from Triticum turgidum L. ssp. dicoccoides (Körn. ex Asch. et Graebn.) Thell. or
Triticum carthlicum (Nevski) Mackey. Asins and Carbonell (1989) also detected
isoenzymatic characteristics of Triticum dicoccoides in durum wheat germplasm from
North Africa. This information could be useful to select material from the collection for
breeding purposes because other interesting genes from Triticum turgidum ssp.
dicoccoides could be also inherited and be present in these genotypes.
All the Spanish landraces analysed showed new alleles in contrast to the foreign
cultivars as ‘Himera’, ‘Mindum’ and ‘Senatore Capelli’. ‘Marques’, coming from
Portugal, carried the Gli-B2new-3, a new allele not found in the Spanish material. The
genotype of the variety ‘Granja de Badajoz’, ‘Lebrija’ and ‘Ledesma’ possessed none
new alleles, too. The former is a bred variety selected from a Spanish landrace and
‘Lebrija’ and ‘Ledesma’ are bred varieties from crosses of landraces with ‘Senatore
Capelli’. These results indicate that the new alleles detected in this work could be
regarded as specific to Spanish landraces, being Gli-B1 and Gli-B2 the loci with the
largest number of new alleles identified. The Gli-B1new-1, Gli-B2new-1 and all the new
alleles at Gli-A2 were observed in more than one Spanish variety genotype. The Gli45
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
B1new-1 and Gli-B2new-1 were only present in landraces from the North of Spain while
the Gli-A2 new alleles occurred in landraces from the South of the country (most of
them clustered in G4 of Figure 2). It is known that landraces posses large level of
adaptation to the particular environment of their cultivation. Moreover, gliadin genes,
not subjected to direct selection by breeders could be linked to genes directly selected
under different environmental conditions. So, these new gliadin alleles might be
associated with specific Spanish environment factors. The large number of new alleles,
17 in contrast to six found in other studies (Metakovsky et al. 1994; Metakovsky and
Branlard 1998), also indicates that durum wheat Spanish germplasm is rather unique.
This variability is conserved nowadays because Spanish breeders and curators did an
important effort to collect and maintain this germplasm in ex-situ collections before
being affected by the genetic erosion in the field. The same conclusion with regard to
Spanish common wheat germplasm was found in a previous research (Ruiz et al.
2002b). The knowledge about the distribution of alleles, especially of rare alleles, is
important to estimate the amount of gene variability but also to the creation of core
collections because the core entries should contain as many alleles as possible.
Very few reports have studied the gliadin polymorphism in durum wheat
cultivars (Kudryavtsev 1994; Kudryavtsev et al. 1996), so the comparisons between
germplasm from different countries are very limited. Kudryavtsev et al. (1996) analysed
the gliadin polymorphism of 72 modern Italian durum wheat cultivars. In that work a
total of 27 alleles were identified at the loci Gli-A1, Gli-B5, Gli-B1, Gli-A2 and Gli-B2
in contrast to the 38 found in the 23 varieties analysed in this work. The total gene
diversity was also larger in the Spanish germplasm (0.679 vs. 0.528). The comparative
analyses of the dendrograms obtained in both researches indicate that Italian material is
more related than the Spanish one. This result is according to Asins and Carbonell
(1989) who also found small variability in Italian entries maintained in the Consiglio
Nazionale delle Ricerche (CNR) in Bari. It was observed that Gli-A1b, very typical in
the Spanish germplasm was not present in the Italian one. Alternatively, allele c, the
most frequent in Italian cultivars, only occurred in three Spanish local varieties
(‘Andalucia-344’, ‘Berberisco’ and ‘Granja de Bandajoz’) and not in the most common
genotype. This allele was also found in the cultivars ‘Himera’, ‘Ledesma’, ‘Marques’,
‘Mindum’ and ‘Senatore Capelli’, all of them of foreign origin or having ‘Senatore
Capelli’ in its pedigree as ‘Ledesma’. The two alleles at Gli-B5 showed similar
frequencies in the Spanish material while in Italian germplasm allele o was more
46
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
widespread. Allele Gli-B5a was observed together with the alleles Gli-B1a, b and c, but
in Spanish germplasm Gli-B1a-Gli-B5a did not appear as frequently linked as in the
Italian material. For Gli-B1, allele c was the most frequent in both researches, probably
by its genetic relationship with good gluten quality (Damidaux et al. 1978). Allele GliA2o was the most common in Italian germplasm whereas it was absent in Spanish
landraces. Kudryavtsev et al. (1996) speculated that this allele comes from North Africa
and it was introduced in the Italian cultivars through cultivar ‘Capelli’. In the present
work only ‘Senatore Capelli’ and ‘Lebrija’ had this allele. This result corroborates the
suggestion made by Kudryavtsev et al. (1996) because ‘Lebrija’ has ‘Senatore Capelli’
in its pedigree. For Gli-B2, allele h was the most frequent in both studies while alleles l
and t were also widely distributed in Spanish germplasm. All the Spanish landraces
carrying the alleles Gli-B1c (Figure 2, G4 plus ‘Rubio de Miajadas’) and Gli-B2h
(Figure 2, G5 except ‘Forment’), the most frequent at these loci (Table 1), come from
the South of Spain. These alleles were also present in the cultivar ‘Senatore Capelli’
which has North African origin. It is plausible that these alleles could have reached
Spain from North Africa. Asins and Carbonell (1989) suggested that the Mediterranean
would be a secondary centre of durum wheat diversity involving the countries Egypt,
Yugoslavia, Tunisia, France, Spain and Greece, being Egypt a microcenter of genetic
diversity. The large differences between the Spanish and Italian materials in most
frequent alleles, mainly for the Gli-A1 and Gli-A2 loci, support that these gliadin alleles
may possess some adapted value, at least as markers of linked genes influencing wheat
adaptation. In the case of the Italian cultivars these alleles could be come from some
specific parents used intensively in the breeding programs (Kudryavtsev et al. 1996).
Gliadin alleles have revealed to be a powerful tool to estimate the amount and
nature of gene diversity and to corroborate known historical relationships between
varieties. Genetic analyses have indicated that the durum wheat Spanish collection
maintained at the CRF is largely structured genetically with about 95% of the total
genetic diversity occurring between accessions. The old varieties analysed are rather
unique and posses a large genetic variability.
The results obtained in the present work suppose a valuable aid to create the
durum wheat core collection and facilitate the selection of materials for quality breeding
and development of improved adaptable cultivars.
47
Capítulo 1. Genetic variability based on gliadin markers
6.References
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49
CAPÍTULO 2
COMBINED USE OF GLIADINS AND SSRs TO ANALYSE
THE GENETIC VARIABILITY OF THE SPANISH
COLLECTION OF CULTIVATED DIPLOID WHEAT
(Triticum monococcum L. ssp. monococcum)*
*
Magdalena Ruiz, Edurne Aguiriano, Rosario Fité and Jose M. Carrillo. 2007. Combined use of gliadins
and SSRs to analyse the genetic variability of the Spanish collection of cultivated diploid wheat (Triticum
monococcum L. ssp. monococcum). Genetic Resources and Crop Evolution 54 (8): 1849- 1860.
51
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
CAPÍTULO 2. COMBINED USE OF GLIADINS AND SSRs TO ANALYSE THE
GENETIC
VARIABILITY
OF
THE
SPANISH
COLLECTION
OF
CULTIVATED DIPLOID WHEAT (Triticum monococcum L. ssp. monococcum)
1.Abstract
This work studied the combined use of gliadins and SSRs to analyse inter- and
intraaccession variability of the Spanish collection of cultivated einkorn (Triticum
monococcum L. ssp. monococcum) maintained at the CRF-INIA. In general, gliadin loci
presented higher discrimination power than SSRs, reflecting the high variability of the
gliadins. The loci on chromosome 6A were the most polymorphic with similar PIC
values for both marker systems, showing that these markers are very useful for genetic
variability studies in wheat. The gliadin results indicated that the Spanish einkorn
collection possessed high genetic diversity, being the differentiation large between
varieties and small within them. Some associations between gliadin alleles and
geographical and agro-morphological data were found. Agro-morphological relations
were also observed in the clusters of the SSRs dendrogram. A high concordance was
found between gliadins and SSRs for genotype identification. In addition, both systems
provide complementary information to resolve the different cases of intraaccession
variability not detected at the agromorphological level, and to identify separately all the
genotypes analysed. The combined use of both genetic markers is an excellent tool for
genetic resource evaluation in addition to agromorphological evaluation.
Keywords: Genetic variability, Germplasm, Gliadin alleles, Microsatellites, Triticum
monococcum L.
2.Introduction
Genetic variability of the Plant Genetic Resources of a country conditions
breeder’s activities and the development of cultivars with improved adaptation. In order
to safeguard this genetic heritage, germplasm collections of many important crops are
currently conserved ex situ in genebanks. In many cases, this is the only possible type of
conservation because of social and economical impediments. However, ex situ
collections may have a considerable percentage of duplicate accessions as well as
53
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
entries misclassified (erroneous identification or accidental mixing) that difficult their
effective conservation and use in breeding. The proper maintenance of genetic variation
including heterogeneity of the accessions is one of the major aspects of genebank
management. To resolve these problems it is essential to monitor intra- and intercultivar variability using polymorphic markers for genotype identification. This
question is especially complex for cultivated einkorn wheat (Triticum monococcum L.
ssp. monococcum), which has been considered a very uniform species (Kuspira et al.
1989). This crop is a diploid wheat carrying the A genome which variability represents
a potentially useful source of high protein content and tolerance to biotic and abiotic
stresses for polyploid wheats (The 1973; Fedak 1985, Vallega 1992). Morphological
and physiological characters, traditionally used, provide practical information to
breeders but they cannot be sufficient because of low polymorphism and variation under
environment. The electrophoretic spectra of gliadins, however, have proved to be highly
polymorphic for genotype identification in einkorn (Metakovsky and Baboev 1992;
Saponaro et al. 1995; Ciaffi et al. 1997; Alvarez et al. 2006). One difficult in using
gliadin protein polymorphism is to reliably describe and compare complex gliadin
spectra. Another disadvantage of these markers to distinguish cultivars in T.
monococcum is that they are located at only two loci. Therefore, other polymorphic
markers should be used to identify closely related cultivars. In recent years
characterisation of germplasm by means of DNA fingerprinting techniques has supplied
a tool for precise einkorn identification and a quantitative estimate of genetic diversity
(Vierling and Nguyen 1992; Castagna et al. 1994; Le Corre and Bernard, 1995). In this
context, several authors have shown that microsatellites (SSRs) are genetic markers
with uniform distribution in the wheat genome (Röder et al. 1998) and very useful for
studying the variability of diploid wheat germplasm (Hammer et al. 2000; Medini et al.
2005). But, gliadins have in some aspects important advantages over DNA methods, in
particular the possibility to monitor intra-varietal polymorphism by analysis of single
grains and even half-grains. In addition, gliadin analysis is undoubtedly more quick,
cheap and less labour consuming. In spite of the fact that both types of markers can
complement each other, at least in the field of wheat genotype identification and
distinguishing, a direct comparison of the two methods on the same set of genotypes has
not been performed.
54
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
The aim of this work is to analyse the combined use of gliadins and SSRs for the
identification of cultivated einkorn genotypes, monitoring the intra-accession variability
and to estimate the genetic diversity of the collection.
3.Material and methods
3.1. Materials
The Spanish einkorn collection of Triticum monococcum L. ssp. monococcum
maintained in the National Plant Genetic Resources Centre (CRF-INIA) were analysed
in the present work. All the 17 landraces studied were released before 1960`s and
collected from 1931 until 1997. Passport data indicated that five accessions came from
three provinces (Jaen, Cadiz and Huelva) in the South of Spain, other five came from
the Centre of Spain (Cuenca province) and the rest (seven accessions) had unknown
Spanish province origin. The accessions analysed identified by their bank number were:
1937, 1938, 13623, 13624, 13625, 13626, 13627, 13628, 13629, 13630, 14269, 20465,
20466, 20467, 20470, 29108, 29109.
3.2. Gliadin analysis
Gliadins were extracted from half single seeds and fractionated in acid (pH 3.1)
polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) according to Lafiandra and Kasarda
(1985). As a minimum of eight grains per accession were analysed for intra-variety
characterisation. Identification of the Gli-A1m and Gli-A2m blocks in the protein spectra
were performed following the work by Metakovsky and Baboev (1992). Only clear and
contrast bands were considered. The durum wheat cultivar Langdon was included as
reference in all the gels.
55
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
3.3. Microsatellite (SSR) analyses
Plants germinated from the same grain analysed for gliadins were used to extract
leaf DNA based on the method of Saghai-Maroof et al. (1984). Two accessions (BGE
13630 and BGE 20467) were not analysed because none half grain germinated. For the
other 15 accessions 20 gliadin genotypes were examined for SSRs. Six primer pairs
selected on the basis of their independent genomic distribution were used to amplify A
genome (Table 4). Primers sequences, reaction mixture and PCR cycles were the same
described by Röder et al. (1998). The forward primers of each primer pairs were
fluorescently labelled with 6-FAM, HEX and TET fluorochrome tags. The allele size
was analysed in an ABI PRISM 310 Genetic Analyser. The method described by Ghosh
et al. (1997) was followed to determine the integer allele size.
3.4. Agro-morphological traits
The 17 accessions were sown for agro-morphological evaluation during 2001 in
Alcalá de Henares (Spain). One accession not germinated in the field (BGE 14269) but
the rest were evaluated for the agro-morphological traits shown in Table 1. The
variables were measured according to IBPGR (1985). All the accessions were classified
according to their botanical varieties (Dorofeev and Korovina 1979; Szabo and Hammer
1996).
56
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Table 1. List of the agro-morphological traits used as descriptors.
Growth habit:
3 Postrate
5 Intermediate
7 Erect
Days to heading (days)
Days to maturity (days)
Plant height (cm)
Stem hairiness:
1 In line
2 All the stem
Top nude stem hairiness:
1 Absent
2 Low
3 High
Leaf hairiness:
1 Hairless and hairy at the border
2 Hairy in the surface
3 Very hairy
Spike length (cm)
Lemma awn barbs:
1 Rough
2 Smooth
Lemma awn colour:
1 White
2 Black in the base
3 Black
Awnedness (cm):
1 Awless
1.1; awnless (falling-out)
2 Length: 1- 3 cm
3 Length: 3-8 cm
4 Length: > 8 cm
Number of spikelets per spike
Spike density:
3 Lax
5 Intermediate
7 Dense
9 Very dense
Glume hairiness:
1 Hairless:
1.1 Bright
1.2 Dull
2 Low
3 High
Glume colour
1 White
2 Red to brown
3 Purple to black
Seed colour
1 White
2 Red
3 Purple
3.5. Statistical analysis
To compare the gliadin and SSR polymorphism, the diversity indices calculated
were: alleles per locus, effective number of alleles, Nei’s diversity index and
polymorphic information content (PIC). Gene diversity and PIC were calculated
according to formulas of Nei (1973) and Anderson et al. (1993), respectively. To
analyse gliadin gene diversity within and between the varieties total gene diversity over
populations (Ht) was divided into average gene diversity within (Hs) and between (Dst)
populations (Nei 1973). The relative magnitude of gene differentiation between
populations (Gst) was estimated as Dst/Ht.
Three dendrograms were made by UPGMA aggregation method with the
distances of Rogers (1972) as modified by Wright (1978) for gliadin bands, Goldstein
and Pollock (1997) for SSRs and Squared Euclidean for agro-morphological characters.
The distances for SSRs were calculated with the computer package SPAGeDI 1.1
(Hardy and Vekemans 2002) and the rest of the analyses with the NTSYS-pc software
(Rohlf 1992). The correlation between the three distances matrices was tested with the
Mantel Z statistic (Mantel 1967). Significance of Z was determined by comparing the
57
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
observed Z values with a critical Z value obtained by calculating Z for one matrix with
out of 250 random permutations.
4.Results
4.1. Gliadin polymorphism
Twenty-two different electrophoretic patterns of gliadins were found in the 17
einkorn accessions analysed (Table 5). Taking into account the work of Metakovsky
and Baboev (1992), two independent gliadin blocks were determined for each
accession. The upper block was composed by - and -gliadins, and in some cases also
by one slow-moving β- gliadin, whereas the lower block was formed by β and αgliadins. These two blocks were encoded by the Gli-A1m and the Gli-A2m loci on the
short arm of chromosomes 1 and 6, respectively. In total seven different blocks were
identified at Gli-A1m and 17 at Gli-A2m. The Figure 1 shows some of these blocks.
There was a high similarity in gliadin composition between the Gli-A1m blocks. Some of
them differed only in one
(e.g. b and d, lines 2 and 3) or one β-gliadin (e.g. d and e,
lines 3 and 6). The most different Gli-A1m blocks were the Gli-A1mf and the Gli-A1mg
(lines 8 and 13). In contrast, Gli-A2m blocks shared less gliadin components. Table 2
shows the allele frequencies in the 17 accessions analysed. The most frequent alleles
were the Gli-A1md (44%) and the Gli-A1me (26%), only different in one -gliadin (Fig.
1, lines 3 and 6). The Fig. 2 shows the resemblance in component composition between
the Gli-A1md block (line 4) and some Gli-A1 blocks of T. turgidum and T. aestivum. For
the Gli-A2m, allele a was the most frequent (Fig. 2, lane 5). The rest of the alleles were
present in only one genotype and had low frequencies. Some Gli-A2m alleles as b, c, d
and o (Fig. 2, lane 4) were present only in biotypes.
58
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Figure 1. Main gliadin genotypes of some Spanish accessions of T. monococcum L. ssp.
monococcum. One durum and one bread wheat are included as test varieties.
Arrowheads indicated Gli-A1 alleles and arrows Gli-A2 alleles. Lane 1, T. turgidum
Langdon; 2, Gli-A1mb Gli-A2me; 3, Gli-A1md Gli-A2mp; 4, Gli-A2mh; 5, Gli-A2mk; 6, GliA1me Gli-A2mj; 7, Gli-A2mf; 8 Gli-A1mg Gli-A2mm; 9, T. aestivum Gli-A1o; 10, GliA2mg; 11, Gli-A1ma Gli-A2mp; 12 Gli-A2mi; 13 Gli-A1mf Gli-A2ml; 14, Gli-A2mn.
59
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Table 2. Alleles and frequencies at the gliadin and SSR loci in a sample of Spanish
einkorn accessions.
Allele/ Gliadin loci
locus
SSR loci
Gli-A1m
Gli-A2m
a
0.058
0.183
0.050
0.050
0.700
0.950
0.050
0.650
b
0.044
0.022
0.050
0.150
0.300
0.050
0.200
0.350
c
0.066
0.014
0.050
0.550
0.050
d
0.448
0.022
0.250
0.100
0.150
e
0.264
0.029
0.400
0.100
0.200
f
0.058
0.117
0.100
0.050
0.200
g
0.058
0.058
0.050
0.050
h
0.066
0.050
0.050
i
0.029
j
0.058
k
0.058
l
0.058
m
0.058
n
0.058
o
0.007
p
0.117
q
0.036
Xgwm136 Xgwm2 Xgwm601 Xgwm156 Xgwm570 Xgwm332
0.050
60
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Figure 2. A-PAGE of gliadins from different wheats. Arrowheads indicated Gli-A1
alleles and arrows Gli-A2 alleles. Lane 1, T. turgidum (Gli-A1dc, cv Langdon); 2, T.
turgidum (Gli-A1de, cv Kubanka); 3, T. aestivum (Gli-A1o); 4, T. monococcum L. ssp.
monococcum (Gli-A1md, Gli-A2mo); 5, T. monococcum L. ssp. monococcum (Gli-A1mc,
Gli-A2ma); 6, T. aestivum (Gli-A1d);7, T. aestivum (Gli-A1p).
61
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Statistics of genetic diversity within and between varieties are given in Table 3.
The overall gene diversity in the entire sample was Ht=0.810 with more than 90% of the
diversity due to differentiation between varieties as opposed to within varieties. The two
gliadin loci presented large genetic diversity, small genetic variation within varieties
(Hs) and large inter-population differentiation (Gst). The Gli-A2m, the most
polymorphic locus, displayed the largest gene diversity and intra-variety expected
heterozygosity (Hs). This locus was more useful to distinguish between varieties (larger
Dst) and it was less fixed within them (smaller Gst) than the Gli-A1m.
All the main genotype (gt. 1) of the 17 accessions analysed were different but
one duplication was found between the main genotype of one accession and the biotype
of other one (20466 gt. 1 and 1937 gt. 4, Fig. 3).
Table 3. Gene diversity within and between einkorn varieties for each gliadin locus and
for the overall sample of 17 accessions.
Locus
Gli-A1m
Gli-A2m
Mean
Aa
7
17
12.0
neb
3.472
10.996
7.235
Htc
0.712
0.909
0.810
a
Hsd
0.053
0.101
0.077
Alleles per locus
Effective number of alleles per locus
c
Total gene diversity
d
Average gene diversity within varieties
e
Average gene diversity between varieties
f
Relative magnitude of gene differentiation between varieties
b
62
Dste
0.659
0.808
0.733
Gstf
0.926
0.889
0.905
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Figure 3. Dendrogram of 17 Spanish einkorn accessions calculated from gliadin data.
Origin of the accessions: Centre (C) or South (S) of Spain is indicated. Heterogeneous
accessions are in bold.
4.2. Microsatellites polymorphism
Table 4 shows the list of the SSRs used, their map position, primer sequence
according to Röder et al. (1998), number and effective number of alleles, and PIC
values generated in the 15 einkorn accessions analysed. Table 2 shows the alleles
amplified at the SSR loci and their frequency and the SSRs allele size are in Table 5.
From two to nine alleles per locus were identified with an average of 4.8 alleles (Table
4). The most polymorphic loci were the Xwms570 and Xwms136 on the long and short
arm of the chromosomes 6A and 1A, respectively. All the main genotypes identified
with gliadins were distinguished with the SSR markers. The only duplicate detected was
for two genotypes different from the main genotypes (20470 gt. 2 and 29109 gt. 3, Fig.
4). In contrast, the two genotypes clustered together by their gliadin composition were
separated with the SSRs analysis (20466 and 1937 gt. 4). The PIC varied from 0.09 to
0.84 with a mean of 0.53 (Table 4). No correlation was observed between the number of
63
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
alleles and the motif and the repeat number of the units (r=0.638 ns). However, the
largest number of alleles was detected at the two loci with longer amplified fragment.
Table 4. SSR markers used, their map position, SSR motif, number and effective
number of alleles and PIC values generated in the 15 einkorn accessions analysed.
Motif
Aa neb
SSR Locus Chromosome arm
Xgwm136
1AS
(CT)58
8 4.081
Xgwm2
3AS
(CA)18
6 2.857
Xgwm601
4AL
(CT)17
2 1.724
Xgwm156
5AL
(GT)14
2 1.105
Xgwm570
6AL
(CT)14(GT)18 9 6.451
Xgwm332
7AL
(GA)36
2 1.834
Mean
4.8 3.009
PICc
0.755
0.650
0.420
0.095
0.845
0.455
0.536
a
alleles per locus
effective number of alleles per locus
c
polymorphic information content
b
Table 5. Gliadin alleles and SSR allele size of 17 Spanish einkorn accessions analysed.
Variety
Genotype
nº Freq
1937
1
2
3
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
2
3
1938
13623
13624
13625
13626
13627
13628
13629
13630
14269
20465
20466
20467
20470
29108
29109
0.500
0.250
0.125
0.125
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0.625
0.375
1
0.500
0.375
0.125
Gli-A1m Gli-A2m
b
b
d
c
d
d
d
e
a
e
f
e
d
g
d
c
d
d
d
e
e
d
d
e
c
o
a
g
p
k
a
p
j
l
f
n
m
f
a
a
q
b
h
i
d
h
1AS
Xgwm136
247
247
253
247
247
245
245
239
245
245
241
245
249
249
243
247
247
247
251
247
3AS
4AL
5AL
6AL
7AL
Xgwm2 Xgwm601 Xgwm156 Xgwm570 Xgwm332
179
150
150
150
148
152
150
150
150
154
152
150
136
154
148
150
148
150
150
150
64
121
123
121
123
121
121
123
121
121
123
123
123
121
121
121
121
121
121
121
121
266
266
266
268
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
266
148
150
100
150
150
100
148
100
150
90
146
100
152
140
146
148
158
160
146
148
195
193
195
193
193
193
193
195
193
195
193
193
195
193
195
193
193
195
193
193
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Figure 4. Dendrogram of 15 Spanish einkorn accessions calculated from SSR data.
Origin of the accessions: Centre (C) or South (S) of Spain is indicated. Heterogeneous
accessions are in bold.
4.3. Agro-morphological polymorphism
Eleven accessions belonged to the var. macedonicum Papag., three to var.
monococcum, one to var. vulgare Körn. and one to var. atriaristatum Flaksb. All
accessions had hairless leafs, rouge awn barbs, very dense spikes and red seeds. A great
part had intermediate growth habit, ítem hairs on line, bright hairless white glumes and
white awns. Other characters as hairiness of the top nude stem, days to heading, plant
height, awnedness, spike length and number of spikelets per spike showed higher
variability. Figure 5 shows the dendrogram obtained with these data. It was observed
that all the entries were different but a group of five cultivars belonging to var.
macedonicum showed high similarity (G1 in Fig. 5). None intra-accession variability
was detected.
65
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
Figure 5. Dendrogram of 16 Spanish einkorn accessions calculated from agromorphological data. Origin of the accessions: Centre (C) or South (S) of Spain is
indicated.
4.4. Analysis of the heterogeneous accessions
Three accessions, 1937, 20470 and 29109, were heterogeneous. The accession
20470 contained two genotypes (gt. 1 and gt. 2) with a frequency of 5/8 and 3/8,
respectively. Both had the same Gli-A1m allele but the main genotype had the Gli-A2mq
and the other the Gli-A2mb, differing mutually in four gliadins. Both genotypes showed
shorter distances with other genotypes based on their dissimilarity in gliadin bands (Fig.
3). Based on microsatellite results the two genotypes differed in four loci. Also gt. 2
was identical to other genotype found in another heterogeneous accession (29109 gt. 3,
Fig. 4). Considering the results of both markers, gt. 2 might be an off-type or admixture
resulting from errors during the maintenance of the collection.
Accession 29109 possessed three genotypes, gt. 1, 2 and 3, with a frequency of
4/8, 3/8 and 1/8, respectively. Gt. 2 and 3 differed from gt. 1 in both gliadin loci. These
66
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
dissimilarities affected one band for the Gli-A1m block, and two and one for gt. 2 and 3,
respectively, for the Gli-A2m. The two last genotypes were different in one gliadin at
Gli-A2m. The three genotypes were grouped in the dendrogram (Fig. 3), but gt. 1 was
closer to the accession 29108. Respect to the SSRs, gt. 1 differed in three and two
alleles from gt. 2 and 3, respectively and gt. 2 and 3 differed mutually in two alleles. Gt.
3 was identical to 20470 gt. 2 and presented shorter distances with other genotypes than
with gt. 2. Gt. 1 was also closely linked to the accession 29108 as with gliadin data (Fig.
4). Based on these results it seems that 29108 and 29109 (gt. 1) are very closely related
accessions, actually, they came from the same province but different locality. Gt. 2 and
3 might be a product of natural cross-pollination between accessions 29108, 29109 and
20470. In fact, the three accessions were sown next to each other in the field.
Accession 1937 contained four genotypes with a frequency of 4/8, 2/8, 1/8 and
1/8 for gt.1, 2, 3 and 4, respectively. Gt. 1 and gt. 2 differed in three Gli-A2m gliadins.
Gt. 1 had one different Gli-A1m gliadin, and five and three Gli-A2m gliadins,
respectively from gt. 3 and 4. Gt. 2 was clustered together accessions 20470 and 1938
but gt. 1 was not grouped with any accession. Gt. 3 and 4 showed shorter distances with
other entries (Fig. 3). SSRs data indicated that gt. 1 differed from gt. 2 and 4 in four and
three loci respectively (gt. 3 was not analysed). Similar to gliadin results, gt. 2 was
closely related to accession 1938, gt. 4 was grouped separately with other accessions
while gt. 1 was very different from the rest of entries. These data indicated that gt. 2, 3
and 4 might be off-types.
4.5. Genetic relationships among different geographical regions
Some relations between gliadins and province origin of the landraces were
observed. All the genotypes from the Jaen province (South of Spain) were grouped in
Group 3 (G3 Fig. 3). All of them had the Gli-A2m alleles d, h (Fig. 1, lane 4) or i (Fig 1,
lane 12) no present in any other accession. These alleles had in common the presence of
a β-gliadin (third β gliadin of Gli-A2m shown in lane 4, Fig 1) or the absence of βgliadins in this zone (Fig. 1, lane 12). Group 4 (G4) included the two accessions of the
Cadiz province (South of Spain). These accessions were the unique with the Gli-A2mp
allele (Fig. 1, lanes 3 and 11). All the genotypes in G3 and G4 had in common a βgliadin no present in other alleles. This band was the second β-gliadin of Gli-A2m (lanes
3, 4, 11 and 12 of Fig. 1). Only 29109 gt. 2 did not have this gliadin, supporting that this
67
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
genotype was not a biotype of the accession. Genotypes in Group 2 (G2) had the GliA2ma and they were from the Centre of Spain, except the 13625 from unknown
province. Two entries from unidentified province clustered separately from the rest of
accessions (G5) based on their difference in the Gli-A1m alleles (Fig 1, lanes 8 and 13).
In contrast to gliadin results, we have not observed geographical relations in the SSRs
and agro-morphological dendrograms (Fig. 4 and 5).
4.6. Relationships between characterisation data
Mantel statistic Z test was significant between gliadins and SSRs (p=0.02) and
no significant between agro-morphological data and gliadins (p=0.21), and agromorphological data and SSRs (p=0.07). However, comparisons of the dendrograms
showed some relationships between agro-morphological and gliadin data (Figs. 3 and
5). All the landraces analysed had a value of 230 or 234 for days to maturity. The six
accessions of the earlier group came from the South of Spain, or had unknown origin,
and all of them, except one, possessed the Gli-A1me allele in the main genotype. In
contrast, most of the accessions of the later group possessed the Gli-A1md allele and
came from the Centre of Spain or the province origin was unknown. Similar
relationship was observed between number of spikelets per spike and gliadins. So, most
of the accessions with higher values (≥ 33) possessed the Gli-A1me, the β encoded at
Gli-A1m was absent and came from the South of Spain. In contrast, the landraces with
less spikelets (<33) had the Gli-A1md and the Gli-A1m β-gliadin. These two associations
were verified for the gt. 1 of the heterogeneous accession 29109 (earlier, ≥ 33 spikelets
per spike and Gli-A1me), but the gt. 2 and gt. 3 possessed the Gli-A1md consistent with
these genotypes would not be biotypes of the accession.
Based on SSR markers the accessions were closer related than with gliadins
(Fig. 4). Only the group G1 was clearly separated based on their allele composition for
the locus Xgwm570. Some of these landraces were also grouped at the agromorphological level (G1, Fig. 5). All of them belonged to var. macedonicum and
possessed intermediate growth habit, stem hairs on line, white awns shorter than 8 cm
and bright hairless glumes. Two of these accessions were also separated by gliadins in
G5 (Fig. 3) because of possessing rare alleles at Gli-A1m. Also the main genotype of the
accession 1937 was the most different with gliadins and SSRs.
68
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
5.Discussion
Metakovsky and Baboev (1992) determined that nearly all gliadin bands in
einkorn wheat were inherited as two independent blocks. Since Gli-A1 and Gli-A2
gliadin loci of polyploid wheats control the synthesis of blocks located in the same
region of the electrophoretic spectrum (Metakovsky et al. 1984) it is assumed that the
same loci are found in the diploid wheat Triticum monococcum L. Also, Metakovsky
and Baboev (1992) found resemblance in component composition between the blocks of
T. monococcum L. ssp. monococcum and some blocks controlled by the A genome in
polyploid wheats. Similar to these authors, we confirmed that blocks encoded at GliA1d, o and p in bread wheat, and present in Spanish landraces (Ruiz et al. 2002), shared
some
- and -gliadin with Gli-A1m blocks in Spanish einkorn (Fig. 2). In the present
work, a total of seven and 17 gliadin alleles were found at Gli-A1m and Gli-A2m,
respectively in the 17 accessions analysed. These figures are comparable with those
found by Saponaro et al. (1995) in 58 varieties (30 and 45 alleles), Metakovsky and
Baboev (1992) in 109 entries (50 and 70 alleles) and Alvarez et al. (2006) in 22 Spanish
einkorn accessions (7 and 14). Although comparisons between different gliadin spectra
are not easy, some allele equivalences with this last work could be established since
some accessions were shared. So, the Gli-A1m alleles a, c and d corresponds to f, e and
a, respectively, and Gli-A2m a, l, n and p to j, d, a and f, respectively, of Alvarez et al.
(2006). However, some discrepancies were found in the mobility and components of
these blocks. Some differences could be due to variations in the electrophoretic methods
used. Another divergence was that we assumed that the slow β- gliadin present in some
cultivars was encoded at Gli-A1m (Fig. 1, lines 2, 3, 8 and 13) while Alvarez et al.
(2006) located this gliadin at Gli-A2m. This gliadin presented a similar mobility to the
β-gliadin coded at Gli-A1dc in durum wheat (Fig. 1, line 1). Metakovsky and Baboev
(1992) also showed that a slow β- gliadin was controlled by Gli-A1m in some einkorn
accessions. The analysis of this gliadin together to the cv. Kubanka (Fig. 2) indicated
that this gliadin had a similar mobility than that found by Metakovsky and Baboev
(1992). These results support that to consistently describe and compare gliadin patterns
is the main difficulty in using gliadins. We have also found a resemblance in component
composition of the Gli-A1m blocks except for the two accessions in Group 5 (lines 8 and
13, Fig. 3). Gli-A1m
blocks had all of them two identical gliadins and the presence or
absence of one to three additional bands. The most fast moving bands in
69
region were
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
found in all the accessions analysed in agreement with Metakovsky and Baboev (1992).
The Gli-A2m was the most polymorphic and the most useful to distinguish between
varieties (Tables 2 and 3). Similar results were obtained in polyploid wheats
(Kudryavtsev et al. 1996, Ruiz et al. 2002, Aguiriano et al. 2006) and in einkorn
(Metakovsky and Baboev, 1992, Castagna et al. 1994, Saponaro et al. 1995, Alvarez et
al. 2006). In contrast, Ciaffi et al. (1997) found more allelic variation at Gli-A1m than at
Gli-A2m (38 vs 22) in 74 einkorn accessions.
A set of six microsatellite markers was used to characterize most of the different
gliadin genotypes found. Alleles for each SSR locus were present in regular two or three
base-pair steps, indicating that genetic variation during wheat evolution occurred in a
continuous step-by-step manner. Gaps with one or more alleles were detected at two
loci between the alleles with the lowest frequencies. The low number of accessions
analysed could be the cause of these gaps. Three loci displayed the regular normal
distribution of allele frequencies and the other three a bimodal distribution. According
to Huang et al. (2002) it appears that natural selection plays a role in creating allelic
variation at the loci with bimodal distributions. The alleles with higher frequencies
might be selected and kept for adaptational reasons. Although the number of alleles was
not correlated with the repeat number of the dimeric unit, the largest number of alleles
was for the SSR with the largest repeat number and for the compound microsatellite
with very long repeat units (Table 4). This last locus was also used by Medini et al.
(2005), however these authors failed in its amplification in einkorn. Since these authors
only analysed one einkorn accession, it was possible that it had the null allele. No
correlation between the number of alleles and the motifs of microsatellites was detected
in agreement with Huang et al. (2002) in bread wheat. Similar to gliadin results the SSR
locus mapped on chromosome 6A (Xgwm570) was also the most polymorphic,
indicating the usefulness of markers located on this chromosome for genetic variability
studies in wheat.
Genetic analyses have indicated that the Spanish cultivated einkorn collection
maintained at the CRF is largely structured genetically with about 90% of the total
genetic diversity occurring between accessions and small differentiation within varieties
(Table 3). The high gene diversity found for gliadin alleles (0.81, Table 3) was higher
than that found by Alvarez et al. (2006) of 0.565 and it was in agreement with that
found in Spanish bread and durum wheat of 0.81 and 0.68, respectively (Ruiz et al.
2002, Aguiriano et al. 2006). Comparisons between the Ht of gliadins and the PIC of
70
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
SSRs (0.536) indicated that the discrimination power of gliadin loci was superior (Table
3 and 4). However, the PIC of 0.78 for the two SSRs mapped on chromosomes 1A and
6A was similar to that obtained with gliadins. Le Corre and Bernard (1995) obtained a
PIC of 0.234 for 20 RFLPs loci and 11 accessions from different countries supporting
the high uniformity of this crop.
The two genetic marker techniques gliadins and SSRs were able to discriminate
between all the main genotypes studied (gt.1). Moreover, all the 20 genotypes were
identified separately when the two approaches were used, indicating that both methods
provided additional genetic information. Mantel test detected an association between
both genetic markers. According to Bohn et al. (1999) these correlations can be found
for related cultivars or if linkage disequilibrium exists between the different markers
loci. In our study only the Gli-A1m and Xgwm136 could be linked, so this correlation
could be due to all the accessions are from Spain. In fact, Flaksberger (1935) classified
T. monococcum L. in three eco-morphological groups and one of them was the Ibericum
group (Spain, southern France and Morocco). Some associations were found between
Gli-A2m alleles and the origin of the accessions and Gli-A1m alleles and some agromorphological traits. Some relations between Spanish origin (North or South of Spain)
and gliadin alleles were also found in durum wheat landraces (Aguiriano et al. 2006).
Gliadin genes, not subjected to direct selection by breeders, could be linked to genes
directly selected under different environmental conditions. Similar to Hammer et al.
(2000) some agro-morphological relations were observed in the clusters of the SSRs
dendrogram.
Monitoring of intra- accession variability is an essential question for genebank
experts. Gene flow between accessions due to outcrossing during regeneration or
methodological errors during seed handing will cause unwanted contaminations. In this
work, three heterogeneous accessions contained two, three or four genotypes identified
with gliadins and with SSRs, and no detected at the agro-morphological level. The
analysis together of gliadin and SSRs data indicated that they might be admixtures or
result of natural cross-pollination between different accessions. Although a concordance
between both markers was obtained the complementary information provided was very
useful to resolve the different cases and to distinguish authentic biotypes from
contaminations.
The combined use of gliadins and SSRs is an excellent tool for the identification
of cultivated einkorn genotypes, mainly for verifying duplicates, and for monitoring the
71
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
genetic variability present in germplasm collections. The knowledge obtained with both
type of markers about the distribution of alleles, especially of rare alleles, is also
important to the creation of core collections. Both techniques possess complementary
advantages. Genetic variability estimation based on SSRs is more informative because
they map a wider genome area, but gliadins have shown to possess higher discriminant
power and stronger associations with geographical and agro-morphological data. The
lower cost (economic and personnel) of this last technique and the semi-automated
genotyping of SSRs are another important questions for using in genetic resources
evaluation.
72
Capítulo 2. Genetic variability of T. monococcum based on of gliadins and SSRs
6.References
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74
CAPÍTULO 3
GENETIC REDUNDANCY AMONG DURUM WHEAT
ACCESSIONS AS ASSESSED BY SSRs AND ENDOSPERM
PROTEINS*
*
M. Ruiz, E. Aguiriano, P. Giraldo and J. M. Carrillo. 2011 Genetic redundancy among durum wheat
accessions as assessed by SSRs and endosperm proteins. Spanish Journal of Agricultural Research 2011
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75
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
CAPÍTULO
3. GENETIC REDUNDANCY AMONG DURUM WHEAT
ACCESSIONS AS ASSESSED BY SSRs AND ENDOSPERM PROTEINS
1.Abstract
Reducing duplication in ex-situ collections is complicated and requires good
quality genetic markers. This study was conducted to assess the value of endosperm
proteins and SSRs for validation of potential duplicates and monitoring intra-accession
variability. Fifty durum wheat (Triticum turgidum ssp. durum) accessions grouped in 23
potential duplicates, and previously characterised for 30 agro-morphological traits, were
analysed for gliadin and high molecular weight glutenin (HMWG) subunit alleles, total
protein, and 24 SSRs, covering a wide genome area. Similarity and dissimilarity
matrices were generated based on protein and SSRs alleles. For heterogeneous
accessions at gliadins the percent pattern homology (PH) between gliadin patterns and
the Nei’s coefficient of genetic identity (I) were computed. Eighteen duplicates identical
for proteins showed none or less than 3 unshared SSRs alleles. For heterogeneous
accessions PH and I values lower than 80 identified clearly off-types with more than 3
SSRs unshared. Only those biotypes differing in no more than one protein-coding locus
were confirmed with SSRs. A good concordance among proteins, morphological traits,
and SSR were detected. However, the discrepancy in similarity detected in some cases
showed that it is advisable to evaluate redundancy through distinct approaches. The
analysis in proteins together with SSRs data are very useful to identify duplicates,
biotypes, close related genotypes, and contaminations.
Additional key words: cereals; duplicates; ex-situ collections; molecular data;
prolamins.
77
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
2.Resumen
Evaluación de la redundancia genética con microsatellites y proteínas del
endospermo en accesiones de trigo duro
Reducir la existencia de duplicados en las colecciones ex-situ es una tarea
complicada que require el uso de buenos marcadores geneticos. En el presente trabajo,
se evalúa el valor de las proteínas del endospermo y de los SSRs para la identificación
de duplicados potenciales y el análisis de la variabilidad dentro de las accesiones. Se
han seleccionado 50 accesiones de trigo duro (Triticum turgidum ssp. durum),
agrupadas en 23 duplicados potenciales y previamente caracterizadas para 39 caracteres
agro-morfológicos. Se ha analizado su composición en proteína total, alelos de
gluteninas de alto peso molecular (HMWG) y 24 SSRs, cubriendo gran parte del
genoma. Con los datos de los alelos de proteínas y SSRs se han generado matrices de
similitud y disimilitud. En las accesiones heterogéneas para gliadinas se ha calculado el
porcentaje de homología entre los patrones de gliadinas (PH) y el coeficiente de
identidad genética de Nei (I). Los 18 duplicados idénticos en su composición en
proteínas mostraron menos de 3 alelos SSRs diferentes. En las accesiones heterogéneas,
los valores de PH e I menores de 80 identificaron a los individuos fuera de tipo, con
más de 3 alelos SSRs diferentes. Solamente aquellos biotipos que diferían en no más de
1 locus proteico se confirmaron con SSRs. Se ha detectado una buena concordancia
entre los datos de proteínas, los SSRs y los caracteres agromorfológicos. Sin embargo,
las discrepancias observadas en algunos casos avalan la necesidad de evaluar la
redundancia mediante distintos marcadores. El análisis conjunto de los datos de
proteínas y SSRs es muy útil en la identificación de duplicados, biotipos, genotipos
cercanos y contaminaciones.
Palabras clave adicionales: cereales; collectiones ex-situ; datos moleculares;
duplicados; prolaminas.
Abbreviations: A-PAGE (acid polyacrylamide gel electrophoresis), d GP (Goldstein and Pollock distance),
dRW (distance of Rogers as modified by Wright), HMWG (high molecular weight glutenin), I (Nei
coefficient of genetic identity), PH (percent pattern homology), sj (Jaccard’s similarity index), SSR (short
sequence repeat).
78
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
3.Introduction
In a broader sense, genebank duplication can be defined as accessions derived
from the same original population, having alleles in common. Historical duplicate
accessions, however, may diversify from the primary sample in genetic composition
during maintenance in ex-situ collections (Hintum and Knüpffer, 1995). For these
reasons duplicate entries would be expected to be equally different from each other and
from their common original accession, and thus form a genetically homogeneous group
(Lund et al., 2003). But the amount of genetic diversity acceptable between duplicate
entries is still not well-defined. Consequently, reducing duplication is more complicated
than generally assumed and requires good quality genetic markers to estimate genetic
similarities. The potential use of these markers depends on their polymorphism and
repartition on the genome, avoiding redundant information. Speed, cost, and
reproducibility determine their utility for genebank management.
In wheat, morphological and physiological characters which were traditionally
used provide practical information to breeders, but they are not sufficient because of
low polymorphism and variation under environment. Molecular markers at the protein
level such as endosperm proteins (gliadins, glutenins, albumins, and globulins) are
primary products of gene expression and can reveal small changes (e.g. mutations)
inaccessible to visual examinations. The extensive heterogeneity of gliadin
electrophoretic composition confers a high level of discrimination among wheat
cultivars (Sapirstein and Bushuk, 1985; Metakovsky, 1991a; Kudryavtsev et al., 1996).
Allele identification is also useful to distinguish biotypes from an off-types, or
admixtures, in heterogeneous accessions (Metakovsky, 1991a; Kudryavtsev et al.,
1996). The disadvantage of this approach is that gliadins are encoded by only six loci
(Gli-) on the short arms of chromosomes of the first and sixth homoeologous groups
(Payne et al., 1982). Electrophoresis analysis of total endosperm protein, including
albumins and globulins, and HMWG (high molecular weight glutenin) subunits allows a
wider genome coverage because they are controlled by groups 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 of
wheat chromosomes (Fra-Mon et al., 1984; Singh and Skerritt, 2001).
Nowadays, characterisation of germplasm by means of DNA fingerprinting
techniques supplies a tool for a precise estimate of genetic diversity. In this context,
SSRs are high polymorphic genetic markers with a uniform distribution in the wheat
79
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
genome and are very useful for studying the variability of wheat germplasm (Röder et
al., 1998; Maccaferri et al., 2003).
In previous research, we identified 106 potential duplicates of durum wheat
accessions maintained at the National Plant Genetic Resources Centre (Spain) using
passport data, 30 agro-morphological characters and gliadin banding patterns (Ruiz and
Aguiriano, 2004). In some cases, potential duplicates similar in gliadin patterns differed
in two or more agro-morphological characters indicating that more molecular markers,
including SSRs, were required for resolving these cases. Furthermore, the identification
of gliadin alleles would allow the computation of genetic distances between duplicate
accessions and to identify admixtures in heterogeneous accessions.
In the present research, some of the duplicates previously studied have been
analysed for gliadin and HMWG subunits alleles, total protein, and SSR alleles. The
objective was to assess the value of endosperm proteins and SSRs for validation of
potential duplicates, and monitoring the intra-accession variability.
4.Material and methods
4.1. Materials
Fifty durum wheat accessions grouped in 23 potential duplicates were selected
from a previous study (Ruiz and Aguiriano, 2004). Some duplicates were similar in
gliadin patterns but differed in several agromorphological traits, and others showed
concordance between the two data sets. Potential duplicates (landraces or cultivars) had
identical variety names and contained two or three accessions. One cultivar, Andalucía
344, was also included because of its high intra-accession gliadin variability.
4.2. Agro-morphological traits
The accessions were evaluated in previous research (Ruiz and Aguiriano, 2004)
for 25 qualitative agro-morphological characters and five quantitative agromorphological traits (Table 6). These characters are habitually used for wheat variety
identification. Some of them are also recommended by IBPGR (1985) for wheat genetic
resources characterisation.
80
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 6. List of the agro-morphological traits used as descriptors to characterise the
durum wheat accessions.
Qualitative character
Vegetative
Growth habit (young)
Prostrate
Upright
Qualitative character
Inflorescence (Cont.)
Spike shape
Pyramidal
Tapering
Qualitative character
Inflorescence (Cont.)
Glume internal hairs
Weak
Strong
Quantitative character
Auricles hairiness
Absence
Presence
Lemna awn barbs
Rough
Smooth
Plant height (cm)
Auricle anthocyanin pigment
Absence
Low
High
Awn colour
White
Black at the base
Red to brown
Glume-shoulder shape
Sloping
Square
Elevated
Indented
Flag leaf habit
Erect
Recurved
Deflexed
Awnedness
Awnless
Awned (3 to 8 cm)
Long awned (>8 cm)
Inflorescence
Spike density
Lax
Anthers anthocyanin pigment
Intermediate
Absence
Dense
Presence
Glume hairiness
Spike waxiness
Absence
Absence
Presence
Presence
Glume colour
Mature spike habit
White
Erect
Red to brown
Semierect
Purple to black
Deflexed
Glume shape
Spike neck shape
Circular
Straight
Oval
Flexuos
Long
Glume-shoulder length
Narrow
Wide
Glume-beak curvature
None
Medium
Glume-beak length
Very short (<1 mm)
Short (1–2 mm)
Medium (2–5 mm)
Long (5–10 mm)
Very long (>10 mm)
Seed
Grain colour
White
Red
Grain shape
Oval
Long
Apical rachis hairiness
Weak
Medium
Glume length
Medium
Long
81
Days to flower
Days to maturity
Spike length (cm)
Spikelets per spike
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
4.3. Endosperm protein analysis
As a minimum, ten grains per accession were analysed for intra-variety
characterisation for gliadins, HMWG subunits, and total protein. Gliadins were
extracted from half single seeds and fractionated in acid (pH 3.1) polyacrylamide gel
electrophoresis (A-PAGE) according to Lafiandra and Kasarda (1985). Identification of
most of the Gli-alleles was performed in previous research (Aguiriano et al., 2006)
following the catalogue of Kudryavtsev et al. (1996). Electrophoresis of total protein
and HMWG subunits was performed on sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gels
according to Payne et al. (1980). HMWG subunits alleles at Glu-A1 and Glu-B1 loci
were identified following the nomenclature of Payne and Lawrence (1983).
4.4. SSR analyses
All the genotypes different in protein composition were examined with SSRs.
Three genotypes (accessions Granja de Badajoz and Raspinegro) were not analysed
because weak amplification products were produced. The same grain analysed for
protein was germinated and DNA was isolated from fresh leaves following a protocol of
Doyle and Doyle (1990). Twenty-three primer pairs, selected based on their
independent genomic distribution, profile quality and polymorphism level, were used to
amplify the A and B genomes. Primer sequences, reaction mixture, and PCR cycles
were same as described by Röder et al. (1998). The forward primers of each primer pair
were fluorescently labelled with 6-carboxyfluorescein (6-FAM), hexacloro-6carboxyfluorescein (HEX), and tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET). The allele size
was analysed in an ABI PRISM 310 Genetic Analyser. The method described by Ghosh
et al. (1997) was followed to determine the integer allele size. The analysed SSRs and
their chromosome arm location were: Xgwm2 (3AS), Xgwm11 (1BS), Xgwm46 (7BS),
Xgwm60 (7AS), Xgwm88 (6BL), Xgwm95 (2AS), Xgwm120 (2BL), Xgwm136 (1AS),
Xgwm148 (2BS), Xgwm154 (5AS), Xgwm155(3AL), Xgwm156 (5AL), Xgwm234
(5BS), Xgwm251 (4BL), Xgwm299 (3BL), Xgwm332 (7AL), Xgwm389 (3BS),
Xgwm408 (5BL), Xgwm445 (2AL), Xgwm513 (4BS), Xgwm570 (6AL), Xgwm577
(7BL), Xgwm601 (4AL). The primer pair for Xgwm332 amplified alleles from two
separate microsatellite loci in all accessions.
82
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
4.5. Statistical analysis
Similarity and dissimilarity matrices were generated for accessions within
duplicates. Three pairwise indexes were calculated: the distance of Rogers (1972) as
modified by Wright (1978), dRW, for gliadin and HMWG subunit alleles, Jaccard (1908)
similarity index, sj, for SSRs, and Goldstein and Pollock (1997) distance, dGP, for SSRs.
The threshold of genetic difference between accessions in a potential duplicate group
was the smallest value observed between any pair of distinct accessions. For
heterogeneous accessions at gliadin loci the percent pattern homology (PH) between
gliadin banding patterns (Sapirstein and Bushuk 1985) and the Nei (1972) coefficient of
genetic identity (I) were computed. Relationships between variables within duplicates
were examined by Pearson correlation coefficients. The Goldstein and Pollock distances
for SSRs were calculated with the computer package SPAGeDi 1.1 (Hardy and
Vekemans, 2002) and the rest of the analyses were performed with the NTSYS-pc
software (Rohlf, 1992).
5.Results
5.1. Protein analysis
Gliadin and HMWG subunit alleles of the varieties studied are shown in Table
1. Thirty-nine accessions were characterised by one specific gliadin genotype (gt. 1) and
identified as monomorphic. The rest comprised one gliadin more frequent genotype (gt.
1) and one or two less frequent (gt. 2 and gt. 3). All the accessions involved in the same
potential duplicate had the same gliadin gt. 1 except for the variety group Mindum and
accession 3 of Semental (Table 1). All the gt. 1 identical for gliadins showed no
differences in HMWG subunits and total protein, except for Berberisco and Reción
duplicates. So, three grains of accession 2 of Berberisco (gt. 1+) differed from gt. 1 in
one total protein band. The gt. 1+ of accession 2 of Recion differed from gt. 1 in the
slightly lower mobility of the HMWG subunit 8 encoded at Glu-B1.
83
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 1. Gliadin (Gli- alleles), high molecular weight glutenin (HMWG) subunits encoded at Glu- loci
and total protein of the potential duplicate groups of durum wheat accessions.
Variety
group
Access.
nº
Genotypea
No.
Gli-A1
Gli-A3 Gli-B5
Gli-B1
Gli-A2
Gli-B2
Glu-A1
Glu-B1
Total
proteinb
Freq
Alaga
1
2
1
1
1.00
1.00
b
b
—
—
a
a
new-1
new-1
k
k
new-1
new-1
1
1
13+16
13+16
S
S
Almendral
1
2
1
1
2
2+
1.00
0.50
0.30
0.20
b
b
b
b
a
a
a
a
o
o
a
a
b
b
new-1
new-1
f
f
f
f
h
h
h
h
N
N
2*
N
13+16
13+16
13+16
6+8
S
S
D
D
Andalucía
344
1
1
2
3
0.70
0.20
0.10
b
b
c
—
—
—
o
o
o
new-5
new-4
new-5
g
g
g
h
h
h
2*
2*
2*
6+8
20x+20y
6+8
S
D
D
Blanquillon
de Boñar
1
1
1.00
b
—
a
new-1
k
l
2*
7
S
2
1
1.00
b
—
a
new-1
k
l
2*
7
S
1
1
1.00
b
—
a
new-1
f
new-1
2*
6+8
S
2
1
1.00
b
—
a
new-1
f
new-1
2*
6+8
S
1
1
1.00
e
—
o
c
new-1
l
N
20x+20y
S
2
1 0.30
1+ 0.30
2 0.40
e
e
c
—
—
a
o
o
o
c
c
c
new-1
new-1
new-1
l
l
l
N
N
N
20x+20y
20x+20y
20x+20y
S
D
D
1
2
1
1
1.00
1.00
e
e
—
—
o
o
c
c
new-2
new-2
t
t
N
N
6+8
6+8
S
S
Fanfarrón
1
2
1
1
1.00
1.00
g
g
a
a
o
o
a
a
g
g
new-4
new-4
N
N
6+8
6+8
S
S
Forment
1
2
1
1
1.00
1.00
b
b
a
a
a
a
new-2
new-2
a
a
new-2
new-2
2*
2*
6+8
6+8
S
S
1
2
1
1
2
1.00
0.90
0.10
e
e
b
a
a
o
c
c
b
b
b
new-3
t
t
h
N
N
N
20x+20y
20x+20y
6+8
S
S
D
3
1
2
0.90
0.10
e
c
—
—
—
—
—
a
a
c
c
b
g
t
h
N
N
20x+20y
Hetb
S
D
Hymera
1
2
1
1
1.00
1.00
c
c
a
a
o
o
c
c
g
g
t
t
N
N
20x+20y
20x+20y
S
S
Lebrija
1
1
2
0.90
0.10
b
b
a
—
o
o
b
new-3
o
o
h
h
N
N
20x+20y
6+8
S
S
2
1
2
2+
3
0.70
0.10
0.10
0.10
b
b
b
new-2
a
a
a
—
o
a
a
a
b
new-1
new-1
c
o
o
o
o
h
h
h
h
N
N
1
N
20x+20y
20x+20y
6+8
20x+20y
S
D
D
D
Ledesma
1
2
1
1
1.00
1.00
c
c
—
—
o
o
c
c
g
g
h
h
N
N
20x+20y
20x+20y
S
S
Marqués
1
2
1
1
2
1.00
0.90
0.10
c
c
c
—
—
a
o
o
o
c
c
c
b
b
b
new-3
new-3
new-3
N
N
N
6+8
6+8
6+8
S
S
Het.
Blanco de
Corella
Berberisco
Carita de
Ratón
Granja de
Badajoz
84
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 1 (cont.).
Variety group
Access.
nº
Genotypea
No.
Gli-A1
Gli-A3 Gli-B5
Gli-B1
Gli-A2
Gli-B2
Glu-A1
Glu-B1 Total proteinb
Freq
Mindum
1
2
1
1
1.00
1.00
c
a
—
—
a
a
a
a
f
a
h
a
N
N
6+8
7+8
D
D
Raspinegro
1
2
1
1
2
1.00
0.90
0.10
c
c
c
a
a
—
o
o
o
c
c
c
o
o
o
h
h
h
N
N
N
20x+20y
20x+20y
20x+20y
S
S
S
1
1
1.00
—
o
b
new-3
h
N
6+8
S
2
1
1.00
b
—
o
b
new-3
h
N
6+8
1
1
1.00
b
—
o
c
new-1
t
N
6+8
S
2
2
1 0.70
1+ 0.30
b
b
—
—
o
o
c
c
new-1
new-1
t
t
N
N
6+8
6+8’
S
S
1
1
1.00
e
—
a
b
a
new-5
N
6+8
S
3
1
1.00
e
—
a
b
a
new-5
N
6+8
S
1
1
1.00
b
a
a
c
new-4
h
N
6+8
S
2
1
1.00
b
a
a
c
new-4
h
N
6+8
S
1
1
1.00
new-1
—
o
a
b
a
1
20x+20y
S
2
1
2
0.90
0.10
new-1
Het.
—
—
o
o
a
a
b
b
a
new-6
1
1
20x+20y
20x+20y
S
D
3
1
1.00
b
—
o
b
new-3
h
N
6+8
D
1
1
1.00
c
a
o
c
o
h
N
20x+20y
S
2
3
1
1
1.00
1.00
c
c
a
a
o
o
c
c
o
o
h
h
N
N
20x+20y
20x+20y
S
S
1
1
1.00
e
—
a
c
new-2
t
N
6+8
S
2
1
1.00
e
—
a
c
new-2
t
N
6+8
S
1
2
1
1
1.00
1.00
e
e
a
a
o
o
c
c
new-4
new-4
l
l
2*
2*
6+8
6+8
S
S
Recio de
Baza
Reción
Rubio de
Badajoz
Rubio de
Miajadas
Semental
Senatore
Capelli
Torcal
Verdial
a
The main gt. 1 of each accession is in bold.
b
S
S, similar; D, dissimilar, to the gt. 1. Het: heterozygous.
Except for Mindum and accession 3 of Semental, dRW between gt. 1 of
accessions in the same potential duplicate group was 0. The minimum dRW between
known distinct accessions was 0.353. Accessions of Mindum and accession 3 of
Semental showed larger values between gt. 1 of their duplicate group (dRW= 0.707 for
Mindum and 0.866 for Semental). In contrast accession 3 of Semental presented a
dRW=0 with gt. 1 of Recio de Baza accessions.
85
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
5.2. SSRs analysis
The SSR markers used, their map position, number and effective number of
alleles and PIC values generated in are shown in Table 4. Table 5 displays the SSR
allele size of the genotypes different in protein composition from the main genotype of
accessions studied. Table 2 shows the comparison of gt. 1 for agro-morphological
characters and SSRs between accessions within potential duplicate groups. Nine out of
the 23 potential duplicates showed no agro-morphological differences between
duplicate accessions. The rest were distinct in up to four agro-morphological characters
(Table 2). Differences in SSRs between gt. 1 of duplicates ranged from 0 to 19 alleles.
Most of them differed in two or fewer SSRs. The maximum sj for SSRs between distinct
accessions was 0.777. The two accessions of Alaga, Berberisco, Forment, Mindum and
accession 3 of Semental displayed shorter similarity values within duplicates. However,
accessions in Alaga, Berberisco, and Forment groups were closer to each other than to
other accessions. They differed in 4 SSRs at least, and in 1 or 2 agro-morphological
characters. The cut off threshold for dGP was 50.291. The two accessions of Alaga,
Hymera, Fanfarron, Mindum, accession 2 of Rubio de Badajoz and accession 3 of
Semental showed larger distances within duplicates, being closely related to other
accessions. Differences within these duplicates varied from 1 to 19 SSRs and from 0 to
4 agro-morphological characters (Table 2). An inter-group duplication was detected
between Raspinegro and ‘Senatore Capelli’ for gliadins, HMWG subunits, and total
protein (Table 1). The duplication was confirmed with SSRs (sj≥0.777 and dGP≤4.333)
and with the agro-morphological data.
86
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 4. SSR markers used, their map position, number and effective number of alleles
and PIC values generated in the durum wheat varieties analysed.
SSR locus
Chromosome arm
Aa
neb
PICc
Xgwm136
Xgwm11
Xgwm445
Xgwm95
Xgwm120
Xgwm148
Xgwm155
Xgwm2
Xgwm299
Xgwm389
Xgwm601
Xgwm251
Xgwm513
Xgwm156
Xgwm154
Xgwm408
Xgwm234
Xgwm570
Xgwm88
Xgwm332a
Xgwm332b
Xgwm60
Xgwm577
Xgwm46
1AS
1BS
2AL
2AS
2BL
2BS
3AL
3AS
3BL
3BS
4AL
4BL
4BS
5AL
5AS
5BL
5BS
6AL
6BL
7AL
7AL
7AS
7BL
7BS
22
10
4
5
6
5
8
3
8
9
9
7
5
13
9
9
6
6
11
7
10
8
15
8
14.019
6.727
2.545
3.383
3.951
3.888
2.261
1.356
3.909
6.395
3.407
4.382
3.063
6.597
4.288
5.080
3.878
2.025
8.055
4.166
4.528
3.044
5.879
5.695
0.929
0.851
0.607
0.704
0.747
0.743
0.558
0.263
0.744
0.844
0.706
0.772
0.674
0.848
0.767
0.803
0.742
0.506
0.876
0.760
0.779
0.672
0.830
0.824
Mean
8.460
St. Dev
4.000
a
alleles per locus
b
effective number of alleles per locus
c
polymorphic information content
4.688
2.571
0.731
0.141
87
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 5. SSR allele size of the genotypes different in protein composition together with
the main genotype of accessions studied.
Almendral
accession 2
main
diff.
2
2+
Andalucía 344
accession 1
main
diff.
2
3
Berberisco
accession 2
main
diff.
1+
2
G. de Badajoz
accession 2
main
diff.
2
1AS Xgwm136
299
312
null
299
310
null
303
null
310
null
310
310
1BS Xgwm11
189
189
189
209
207
209
207
207
211
217
211
211
2AL Xgwm445
189
185
185
187
187
187
187
187
189
187
189
189
2AS Xgwm95
120
120
120
118
116
116
120
120
118
120
116
118
2BL Xgwm120
141
148
148
127
141
141
141
127
127
127
127
127
2BS Xgwm148
164
162
162
162
162
162
166
166
166
144
166
166
3AL Xgwm155
141
141
141
121
125
121
125
125
125
125
125
125
3AS Xgwm2
116
116
116
116
118
118
116
116
116
116
116
116
3BL Xgwm299
202
202
195
210
210
210
214
214
191
191
191
191
3BS Xgwm389
120
120
120
124
124
124
126
126
128
112
128
128
4AL Xgwm601
151
151
null
153
153
null
151
151
151
155
151
151
4BL Xgwm251
104
104
104
88
104
88
110
110
104
74
104
104
4BS Xgwm513
140
128
140
138
136
138
140
140
140
138
140
140
5AL Xgwm156
306
268
266
291
291
291
324
324
297
293
266
297
5AS Xgwm154
115
115
115
117
117
117
128
128
113
115
113
113
5BL Xgwm408
151
153
186
180
176
176
180
180
145
178
145
145
5BS Xgwm234
228
234
228
228
228
228
224
224
228
224
228
228
6AL Xgwm570
143
102
143
102
102
102
146
102
102
102
102
102
6BL Xgwm88
131
131
129
146
146
133
146
146
129
135
129
129
7AL Xgwm332a
182
null
null
180
null
null
192
192
182
182
182
182
7AL Xgwm332b
200
198
null
239
198
200
202
202
200
200
200
200
7AS Xgwm60
214
207
214
216
216
216
214
214
216
201
216
216
7BL Xgwm577
141
155
155
212
128
212
128
128
139
212
137
139
7BS Xgwm46
169
171
169
167
167
167
179
179
175
181
175
175
Accession number
Genotype number
88
Recio de
Baza
main
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 5 (Cont.). SSR allele size of the genotypes different in protein composition
together with the main genotype of accessions studied.
Accession number
Genotype number
Lebrija
accession 1
main
diff.
2
main
Lebrija
accession 2
diff.
2
2+
3
Marqués
accession 2
main
diff.
2
Reción
accession 2
main
diff.
1+
Semental
accession 2
main
diff.
2
1AS Xgwm136
310
312
310
280
280
292
338
286
312
312
null
292
1BS Xgwm11
207
207/217
207
207
207
207
211
213
217
217
211
211
2AL Xgwm445
189
189
189
189
189
189
187
187
187
187
187
187
2AS Xgwm95
118
122
118
118
118
118
120
120
124
122
118
118
2BL Xgwm120
141
141
141
141
141
141
127
143
141
141
127
127
2BS Xgwm148
166
162
166
166
166
162
144
144
162
162
164
164
3AL Xgwm155
125
125
125
125
143
125
143
143
125
125
123
150
3AS Xgwm2
116
116
116
116
116
116
116
116
116
116
116
116
3BL Xgwm299
208
208
208
202
202
208
191
193
191
191
191
191
3BS Xgwm389
118
118
118
118
118
112
118
124
112
112
116
118
4AL Xgwm601
153
153
153
153
153
153
148
148
151
151
151
151
4BL Xgwm251
104
86/106
104
102
104
104
86
86
86
86
104
102
4BS Xgwm513
136
138
136
136
136
136
138
138
138
138
140
136
5AL Xgwm156
324
324
324
324
276
324
291
291
304
266
276
276
5AS Xgwm154
117
117
117
117
117
119
117
117
115
115
111
115
5BL Xgwm408
176
145
176
178
176
176
147
147
145
145
145
145
5BS Xgwm234
224
226
224
224
224
224
226
226
226
226
200
200
6AL Xgwm570
102
102
102
102
102
102
102
146
102
102
102
141
6BL Xgwm88
135
135
135
131
124
135
129
129
149
149
127
127
7AL Xgwm332a
192
192
192
194
194
192
192
null
null
null
192
190
7AL Xgwm332b
202
198
202
202
202
202
202
198
198
198
209
209
7AS Xgwm60
216
216
216
216
209
216
214
214
214
214
214
214
7BL Xgwm577
128
128
128
128
193
128
218
null
128
128
214
214
7BS Xgwm46
179
179
179
179
179
171
175
173
171
171
181
181
89
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 2. Comparison of the genotypes 1 for agro-morphological characters and SSRs
between accessions of the potencial duplicate groups.
Variety Group
Accesión
compared
Unshared agro-morphological
characters
Unshared
SSRs
sja
dGPb
Alaga
Almendral
Blanquillon de
Boñar
Blanco de Corella
Berberisco
Carita de Ratón
Fanfarrón
Forment
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
Grain color, Days to flower
None
None
7
0
0
0.548
1.000
1.000
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
0
4
1
2
4
1.000
0.000
0.714
1.166
0.920
0.166
0.846 5,704.335
0.714
12.083
Granja de Badajoz
1 vs 2
3 vs 1, 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 2
1 vs 3
2 vs 1, 3
1 vs 2
1 vs 2
3 vs 1, 2
Flag leaf habit
Mature spike habit
Flag leaf habit
None
Glume-shoulder shape, Glume-shoulder
length
Flag leaf habit
None
Anthers pigment
Flag leaf habit, Anthers pigment
None
Days to flower
Awn color, Plant height
Flag leaf habit
None
None
None
Mature spike habit
Flag leaf habit
Flag leaf habit, Mature spike habit
Glume hairiness, Glume colour, Glumebeak curvature, Glume-beak length
Mature spike habit, Days to maturity
Glume length, Plant height
None
Awn colour, Glume internal hairs,
Glume-beak length
0
1
1
0
0
0
19
0
0
0
0
1
1
0
16
1.000
0.000
0.920
0.166
0.920 3,750.000
1.000
0.000
1.000
0.000
1.000
0.000
0.116 951.416
1.000
0.000
1.000
0.000
1.000
0.000
1.000
0.000
0.920 5,766.000
0.920
0.166
1.000
0.000
0.200 1,820.958
Hymera
Lebrija
Ledesma
Marqués
Mindum
Raspinegro
Recio de Baza
Reción
Rubio de Badajoz
Rubio de Miajadas
Semental
Senatore Capelli
Torcal
Verdial
a
3 vs 1, 2
1 vs 2, 3
1 vs 2
1 vs 2
1
2
3
3
0.920
0.846
0.777
0.777
86.208
0.000
0.000
1.041
6.208
0.500
16.708
Jaccard similarity index. b Goldstein and Pollock distance.
5.3. Intra-accession variability
For heterogeneous accessions several genetic similarity parameters were
analysed to compare the intraaccession genotypes, gt. 1+, gt. 2, gt. 2+, and gt. 3, with gt.
1 (Table 3). Differences involved 0 to 5 gliadin loci and 2 to 16 SSRs. Dissimilarities in
two or more gliadin loci (putative off-types) were analysed separately from differences
in one or no loci (probable biotypes). Protein analysis indicated that 11 genotypes were
probable off-types differing in two gliadin loci at least (Table 1). All of them were
90
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
distinct in HMWG subunits and/or total protein. These genotypes had I ≤ 0.66 and PH <
80% with gt. 1, except for gt. 2 of accession 1 of Lebrija PH = 81.81 (Table 3). Genetic
distances dRW were shorter with other accessions than with accessions included in the
same duplicate. The same results were obtained with sj for SSRs data although gt. 2 of
accession 3 of Granja de Badajoz was not analysed. All these possible off-types were
confirmed with dGP, except for gt. 2 of accession 1, and gt. 2 and gt. 3 of accession 2 of
Lebrija group. Analysis of potential biotypes indicated that four genotypes (in
Andalucia 344, Marques and Raspinegro accessions) differed from gt. 1 in one gliadin
locus (Table 1). These genotypes possessed I > 83% and PH > 80% with gt. 1. Except
for Raspinegro, all of them were distinct from gt.1 in total protein (Tables 1 and 3). A
more precise analysis of the Marqués accession indicated that gt. 2 was a heterozygote
since total protein gt. 1 was included in gt. 2. Genotype 2 of Andalucia 344 also
diverged in HMWG subunits from gt. 1. The values of dRW with gt. 1 were shorter than
that found between different accessions, except for gt. 2 of Andalucia 344. SSR data
indicated that these potential biotypes differed from gt. 1 in 9 to 12 alleles and overtook
the threshold established for sj and dGP. However, they were more related to gt. 1 than to
other accessions based on sj values. In two additional cases intra-accession genotypes
were identical in gliadins but showed slight differences in HMWG subunits or total
protein (gt. 1+ of accession 2 of Berberisco and gt. 1+ of accession 2 of Recion, Table
1). Both were closely related to gt. 1 with dRW (Table 3). For SSRs, they were also
grouped with sj but not with dGP. In only one case an intra-accession genotype possessed
the same protein composition as the gt.1 of a distinct duplicate group: gt. 2 of accession
2 of Granja de Badajoz with gt. 1 of Recio de Baza (Table 1). They differed in 3 SSRs
and were grouped with both sj and dGP (Table 3). Pearson correlation coefficients (data
not shown) within duplicates indicated that the number of unshared SSRs, and sj, were
significantly correlated with the number of unshared agro-morphological traits (p <
0.01), PH (p < 0.05), and I (p < 0.01), while dGP was not significantly correlated with
the three later variables. Correlations were significant (p < 0.01) between PH and I, and
between sj and dGP.
91
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
Table 3. Comparison of genotypes (gt.) of heterogeneous accessions with the main
genotype (gt. 1) for gliadin, highmolecular weight glutenin (HMWG) subunits and total
protein.
Variety
Almendral
Andalucía 344
Berberiso
Granja de Badajoz
G. de Badajozg
Lebrija
Marqués
Raspinegro
Reción
Semental
Unshar
gt.
HMWG
Unshared
ed
compared
%PHa
Ib
/total dRWd
sje
number
SSRs
gliadin
c
with gt. 1
protein
loci
2
2
2
73.91
0.66 D/D 0.612
14
0.263
2
2+
2
73.91
0.66 D/D 0.612
12
0.333
1
2
1
82.35
0.83 D/D 0.500
12
0.333
1
3
1
88.23
0.83 S/D 0.353
9
0.454
2
1+
0
100.00 100.00 S/D 0.000
2
0.846
2
2
2
69.23
0.66 S/D 0.500
6
0.600
2
2
5
18.52
0.16 D/D 0.866
16
0.200
3
2
3
28.12
0.50 D/D 0.661
Accesión
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2+
3
2
2
1+
2
0
2
2
2
4
1
1
0
2
100.00 100.00
81.81
0.66
69.56
0.66
69.56
0.66
57.69
0.33
83.33
0.83
91.67
0.83
100.00 100.00
65.22
0.66
a
S/S
D/S
S/D
D/D
S/D
S/D
S/S
D/S
S/D
0.000
0.612
0.500
0.707
0.707
0.353
0.353
0.353
0.500
3
9
6
8
5
10
2
8
0.777
0.454
0.600
0.500
0.655
0.411
0.846
0.500
dgpf
14,852.875
4,371.833
4,656.583
11,046.667
1,697.708
117.208
1,899.000
40.375
40.958
40.166
331.791
18.500
7,750.666
60.333
415.041
Percent gliadin pattern homology. b Nei’s coefficient of genetic identity based on gliadin alleles. c S,D
are similar and dissimilar, respectively, to the gt. 1 of the duplicate. d Distance of Rogers as modified by
Wright based on gliadin and HMWG subunits alleles. e Jaccard similarity index based on SSRs alleles.
f
Goldstein and Pollock distance based on SSRs alleles. g The compared gt. 1 was from Recio de Baza.
92
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
6.Discussion
Most of the potential duplicate groups analysed in this study refer to accessions
derived from the same original population collected at the beginning of the 20th century.
These accessions were maintained in different breeder collections, or came from the
USDA-ARS germplasm collection. To characterise probable duplication, eight protein
loci (coding for gliadins and HMWG subunits) and 24 SSRs were used. This number is
comparable with that reported by Virk et al. (1995) who demonstrated that 26
polymorphic markers were enough to detect at least one difference between suspected
pairs of rice duplicates at 99% probability. The 24 SSRs were selected based on their
polymorphism in wheat and their position on the genetic map (Röder et al., 1998;
Maccaferri et al., 2003). Except for 1AL, 1BL, 4AS, 6AS, and 6BS, all the chromosome
arms were covered. Nevertheless, 6AS and 6BS were analysed with the gliadin loci Gli2, and 1AL and 1BL with HMWG subunit loci Glu-1. Moreover, the information from
total protein analyses allowed coverage of a wider genome area.
Twenty-one out of the 23 potential duplicates analysed possessed the same gt. 1
for gliadins, HMWG subunits and total protein (Table 1). They differed in three agromorphological characters at most. In general, these characters had low discriminating
power (flag leaf habit, mature spike habit, or glume length) or were affected by
environmental conditions, such as anther pigment (Ruiz and Aguiriano, 2004). The two
cases of dissimilarity, Mindum and accession 3 of Semental, were also confirmed with
SSRs (Table 2). Semental presented differences in four agro-morphological characters,
but Mindum differed only in two traits. So, the later duplicate group was difficult to
solve based only on agro-morphological data.
Eighteen of the 21 possible duplicates with identical gt. 1 for proteins showed
none or little differences in SSR alleles (from 1 to 3). In agreement with passport data
information, all of them presented shorter distances with accessions of the same
potential duplicate than those obtained for distinct accessions. Six of them were
identical duplicates with no differences between duplicate accessions for any of the
genetic markers analysed (agro-morphological, proteins, and SSRs). Identical duplicates
in ex-situ collections are not frequent, even in an autogamous species like wheat. In
three cases, discrepancies in variation detected by proteins and SSRs, and also between
sj and dGP indexes, were found. Three duplicates were verified with sj (Hymera,
Fanfarron, and accession 2 of Rubio de Badajoz) but not with dGP. The discrepancies
93
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
between both indexes were caused by the presence of null alleles, which increased dGP
values. On the contrary, two potential duplicates (Berberisco and Forment) with four
unshared SSRs were only verified with dGP because the differences between allele sizes
were short. A similar result was obtained with accession 3 of Semental that possessed
the same protein composition (Table 1) and morphotype as the two accessions of Recio
de Baza. They were separated with sj (6 unshared SSRs) but not with dGP (dGP= 0.833).
The two duplicate accessions of Alaga, with seven unshared SSRs, exceeded the
threshold established for sj and dGP. However, the two accessions were closer related to
each other than to other accessions with sj. Both accessions seem to be agro-types with
contrasting seed colour and days to flower (Table 2). In agreement with Aguiriano et al.
(2006), in the past, it could be intentional splitting of the original sample into
morphologically distinct parts. Tranquilli et al. (2000) also found an Argentinean wheat
landrace with considerable variation in agro-morphological characters but no variation
in HMWG subunits and isozymes. The diversity observed was explained by artificial
selection carried out in the local area.
The significant correlations detected between the number of unshared agromorphological traits and SSRs indicated a good concordance between molecular marker
diversity and morphotype when a small number of genotypes are screened (Crouch et
al., 2000). However, differences in agro-morphological traits did not imply differences
in molecular data and viceversa.
No obvious intra-accession differences for agromorphological descriptors were
detected in heterogeneous accessions at gliadin loci. A gliadin genotype was classified
as a biotype if its frequency was larger than 5% and it was different from gt. 1 in not
more than one gliadin-coding locus (Metakovsky, 1991a). Otherwise, a genotype was
classified as an off-type. All the potential off-types for gliadins were confirmed with sj.
They differed in 5-16 SSRs from gt. 1 (Table 3) in agreement with the upper limit of 3
unshared SSRs obtained between gt. 1 of accessions of the same duplicate (Table 2).
The potential gliadin off-types were also confirmed with dGP except for Lebrija
duplicate. In this case, the genotypes have probably varied for a long time but
maintaining a genetic relation with gt. 1. The heterozygosity at two SSR loci in gt. 2 of
accession 1 (Table 3) also suggests the possible occurrence of outbreeding during
multiplication. Accordingly, safety measures such as species alternation are
94
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
recommended during regeneration since other cases of heterozygosity were detected
(Table 1).
Most of the admixtures observed were heterogeneous at Gli-B1 (Table 1). It is
known that gliadin alleles encoded at this locus have contrasting relationships with
quality. Therefore, quality of a sample of a heterogeneous variety may depend on the
presence and frequency of diverse gliadin biotypes. In this study, gt. 2 and gt. 2+ of
accession 2 of Almendral possessed allele new-1, which conferred poorer quality than b
present in gt. 1 (Aguiriano et al., 2009). This valuable information should be considered
in evaluation and utilization of the sample.
The potential gliadin biotypes dissimilar in one locus were not confirmed as
biotypes with HMWG subunits or total protein, and SSRs (Table 3). Probably, these
closely related genotypes have diversified during maintenance in the Bank. Only those
genotypes identical in gliadin composition and showing few differences in HMWG
subunits or total protein were verified as biotypes with SSRs: gt. 1+ of accession 2 of
Berberisco, gt. 1+ of accession 2 of Reción, and gt. 2 of accession 2 of Granja de
Badajoz in comparison with Recio de Baza. The analysis indicated that the biotypes
verified with sj differed in no more than one proteincoding locus whether it coded for
gliadins, HMWG subunits, or one band of total protein.
Comparison analyses of the two similarity indexes used to examine gliadin
genotypes (PH and I) with SSRs showed that, in general, PH and I with values lower
than 80 identified clearly off-types with more than 3 SSRs unshared. Sapirstein and
Bushuk (1985) also considered a cutoff threshold of 80 for PH to differentiate varieties.
Although band treatment of the information (PH) appears less discriminating, because
of redundancy, than allelic treatment (I) both were significantly correlated. However,
correlations with the number of unshared SSRs were higher with I than with PH. One
disadvantage of the analysis of PH over allelic composition is the difficulty of
comparing protein patterns of different varieties evaluated in different electrophoretic
gels. The mistakes in accession 3 of Semental and gt. 2 of accession 2 of Granja de
Badajoz (both similar to Recio de Baza), and the duplication between Raspinegro and
Senatore Capelli, were detected based on protein alleles and confirmed with SSRs. In
contrast, identification of alleles is sometimes complicated and labour-consuming.
In the present research sj and dGP were significantly correlated. Jaccard’s index
is based on allele frequencies shared and an infinite allele mutation model. Goldstein
95
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
and Pollock distance, was developed specifically for microsatellite applications and
assumes a single-step mutation model. With Jaccard’s no homoplasy exists and it can
overestimate similarities among individuals. This overestimation was not observed in
this study. Possible bias to homoplasy could be minimized by the use of dinucleotide
loci and compound repeats as suggested Maccaferri et al. (2003). The discrepancies
between both genetic indexes were mainly due to the incidence of null alleles.
Moreover, similarities between and within accessions not found with sj were detected
with dGP. In these cases, allele differences were high in number but not in size,
indicating that there was a close relation between the genotypes compared. From the
standpoint of managing large ex-situ germplasm collections, the fate of not identical but
closely related accessions and genotypes are complex decisions.
In general, a good concordance among proteins, morphological traits and SSR
were detected, mainly when the differences were high. However, the discrepancy in
similarity detected in some cases between the different data sets showed that it is
advisable to evaluate germplasm through distinct approaches. The three types of
proteins used were an excellent tool to detect duplicates and discriminate among
admixtures in the accessions. In addition, protein analysis has a lower cost (economic
and personnel) than agro-morphological and SSRs data. There was a good concordance
between the two SSRs indexes used. In the cases of discrepancy both reported
complementary information if null alleles are avoided. The analysis together of proteins
and SSRs data are very useful to identify potential duplicates, mistakes not found with
passport information and to distinguish authentic biotypes, closely related genotypes,
and contaminations.
96
Capítulo 3. Identification of wheat duplicates using molecular data
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98
CAPÍTULO 4
GENETIC VARIATION FOR GLUTENIN AND GLIADINS
ASSOCIATED WITH QUALITY IN DURUM WHEAT
(Triticum turgidum L. ssp. turgidum)
LANDRACES FROM SPAIN*
*
E. Aguiriano, M. Ruiz, R. Fité and J. M. Carrillo. 2008. Genetic variation for glutenin
and gliadins associated with quality in durum wheat (Triticum turgidum L. ssp.
turgidum) landraces from Spain.Spanish Journal of Agricultural Research 2008 6(4),
599-609
99
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
CAPÍTULO 4. GENETIC VARIATION FOR GLUTENIN AND GLIADINS
ASSOCIATED WITH QUALITY IN DURUM WHEAT (Triticum turgidum L. ssp.
turgidum) ANDRACES FROM SPAIN
1.Abstract
The allelic variation at seven prolamin loci involved in quality has been studied
in a set of durum wheat landraces from all the Spanish regions where this crop has been
traditionally cultivated. The genetic variability was higher than that found in other
germplasm collections. All the loci, except Glu-B2, displayed a genetic variability
higher than 0.62, with Glu-3 the most polymorphic. In total, five alleles were studied at
Glu-A1, nine at Glu-B1, 15 at Glu-A3, 18 at Glu-B3, two at Glu-B2, and eight at Gli-A1
and Gli-B1. New allelic variants not previously identified in durum wheat were
detected. The 30 different genotypes of B low-molecular-weight (B-LMW) glutenin
subunits analysed, of which 25 are novel, provide an important source of genetic
variability for quality breeding. Protein patterns for convars. durum and turgidum, and
for the North and South of Spain were identified for the loci with significant influence
on quality. Higher variability was observed in convar. turgidum and in the North zone
than in convar. durum and the South, respectively, mainly for the Glu-B1 and Glu-B3.
Also, convar. turgidum appeared to be a valuable source for new alleles for the LMW
glutenin subunits. Wheats from the South were, however, more diverse for prolamins
encoded at Glu-A3.
Additional key words: convar. durum, convar. turgidum, germplasm, LMW
patterns, prolamin alleles, quality breeding.
101
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
2.Resumen
Variación genética de las gluteninas y gliadinas asociadas con calidad en
variedades locales españolas de trigo duro (Triticum turgidum L. ssp. turgidum)
Se ha estudiado la variación alélica en siete loci de prolaminas relacionados con
la calidad en un grupo de variedades locales de trigo duro procedentes de todas las
provincias españolas donde se cultivaba tradicionalmente. La variabilidad genética
encontrada fue mayor que la observada en otras colecciones de germoplasma. Todos los
loci, excepto el Glu-B2, mostraron una variabilidad genética mayor que 0,62, siendo los
Glu-3 los más polimórficos. En total se estudiaron cinco alelos en el Glu-A1, nueve en
el Glu-B1, 15 en el Glu-A3, 18 en el Glu-B3, dos en el Glu-B2 y ocho en el Gli-A1 y
Gli-B1. Se han detectado variantes alélicas nuevas que no se habían identificado antes.
Los 30 genotipos diferentes analizados de subunidades B de gluteninas de bajo peso
molecular (B-LMW), de los cuales 25 son nuevos, representan una fuente importante de
variabilidad genética para la mejora de la calidad. Se identificaron patrones de proteínas
para las convars. durum y turgidum, y para el norte y sur de España para los loci con
influencia significativa en calidad. En la convar. turgidum y en el norte se observó
mayor variabilidad que en la convar. durum y en el sur, respectivamente, principalmente
en el Glu-B1 y Glu-B3. Además, la convar. turgidum parece ser una fuente valiosa de
nuevos alelos para las subunidades LMW de gluteninas. Sin embargo, los trigos del sur
son más diversos para las prolaminas codificadas en el Glu-A3.
Palabras clave adicionales: alelos de prolaminas, convar. durum, convar. turgidum,
germoplasma, mejora de la calidad, patrones LMW.
Abbreviations used: A-PAGE (acid polyacrylamide gel electrophoresis), CRF-INIA (Plant Genetic
Resources Centre - Spanish Nacional Institute for Agricultural and Food Research and Technology),
HMW (high-molecular-weight), Ht (gene diversity), ICARDA (Internacional Centre for Agricultural
Research in the Dry Areas), LMW (low-molecular-weight), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate
polyacrylamide gel electrophoresis).
102
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
3.Introduction
In durum wheat, quality differences between cultivars are strongly dependent
upon their allelic composition for endosperm storage proteins, gliadins and glutenins
(Carrillo et al., 1990, 1991; Kaan et al., 1993; Turchetta et al., 1995; Porceddu et al.,
1998). Genetic studies have revealed that these proteins (prolamins) are encoded at
several, complex and highly polymorphic loci. Gliadins are controlled by six Gli loci
(Gli-1 and Gli-2) mapped on the short arms of the group 1 and 6 chromosomes,
respectively (Wrigley and Shepherd, 1973; Payne et al., 1982). Glutenin subunits are
classified as high-molecular-weight (HMW) and low-molecular-weight (LMW)
subunits on the basis of their mobility in sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE). The LMW glutenin subunits are subdivided into B, C and
D (Jackson et al., 1983), with the B subunits playing a major role in gluten quality
(Pogna et al., 1990; Ruiz and Carrillo, 1995; Turchetta et al., 1995). HMW subunits are
encoded at the Glu-1 loci on the long arm of the group 1 chromosomes (Payne et al.,
1980). B-LMW glutenin subunits are inherited as groups (designated LMW-) controlled
at Glu-A3, Glu-B3 and Glu-B2 (Singh and Shepherd, 1988; Ruiz and Carrillo, 1993).
Glu-A3 and Glu-B3 are tightly linked to Gli-A1 and Gli-B1, respectively (Singh and
Shepherd, 1988). The natural variation found at all these prolamin loci is very important
to improve durum wheat quality. However, the narrow genetic background of modern
wheat cultivars may lead to a loss of the exploitable diversity (genetic erosion) and a
decrease in the efficiency of breeding. In this context, the diversity of old varieties and
forms preserved in gene banks represents an important source of genetic variability and
consequently, of valuable traits for wheat improvement. In fact, landrace varieties have
proven especially useful to supply new alleles at the protein loci involved in gluten
strength (Carrillo et al., 1991; Porceddu et al., 1998; Raciti et al., 2003). On the other
hand, prolamins are valuable molecular markers for genetic analysis and for the
quantification of the genetic diversity present in wheat collections (Kudryavtsev et al.,
1996; Aguiriano et al., 2006; Moragues et al., 2006).
In this paper, the allelic variation at seven prolamin loci has been studied in a set
of durum wheat landraces from Spain. Allelic frequencies were used to analyse genetic
diversity and the presence of protein patterns for convars. durum and turgidum, and for
the North and South of Spain.
103
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
4.Material and methods
4.1. Materials
A collection of the Plant Genetic Resources Centre at the Spanish National Institute for
Agricultural and Food Research and Technology (CRF-INIA) was analysed for allelic
variation at seven prolamin loci. The sample included 52 accessions of Spanish durum
wheat (Triticum turgidum L. ssp. turgidum) landraces. Table 1 shows the Bank number,
local name, and geographical region of the landraces analysed. Additional passport and
characterisation data are available in http://wwwx.inia.es/crf. About 50 seeds per
accession were sown in a single row (2 m long, 1.12 m apart) during the 2001-2002
season at Alcalá de Henares, Madrid. One plant representative of the accession was
bagged. To select this plant it was previously verified that its agromorphological
characters matched the descriptions published for these varieties (Gadea, 1954). The
variety identity was also confirmed using the spike collection held since the 1950s at the
CRF-INIA. The rest of the plants of the same variety plot were harvested and milled as
a whole. The grain of the bagged selected plant was sown in one row with a 1.12 m
inter-row spacing during 2003-2004. Each row was harvested by hand and the flour
used for prolamin analysis. These gliadin profiles were compared with those from the
flour obtained with the plants of the same variety harvested as a whole, and, in some
cases, with those from a grain of the spike collection. The results of these comparisons
allowed confirming that the selected genotype represented the variety.
104
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 1. Genebank number, local name and geographical region of the landraces
analysed.
Genebank
number
BGE 2869
BGE 2881
BGE 2882
BGE 2883
BGE 2887
BGE 4165
BGE 8366
BGE 12346
BGE 12383
BGE 12537
BGE 12555
BGE 13065
BGE 13066
BGE 13068
BGE 13076
BGE 13077
BGE 13080
BGE 13089
BGE 13090
BGE 13093
BGE 13100
BGE 13103
BGE 13590
BGE 13603
BGE 13622
BGE 13645
BGE 13651
BGE 13683
BGE 13688
BGE 17170
BGE 18266
BGE 18267
BGE 18268
BGE 18271
BGE 18304
BGE 18602
BGE 18615
BGE 18619
BGE 18646
BGE 18648
BGE 18653
BGE 18654
BGE 19293
BGE 20940
BGE 20942
BGE 20946
BGE 20948
BGE 21774
BGE 21783
BGE 21787
BGE 26954
BGE 30923
Local name
Region
Caravaca 7
Morisco de Tenerife
Raspinegro de Alcolea
Recio de Aranjuez
Rubial de Liebana
Trigo
Raspinegro canario
Caravaca 4
Cascalvo
Rubion de Higueruela
Rubio de Madrigalejo
Espiga negra
Negro velloso
Chile
Trigo alto
Blat mort
Gigante lampiño de Najera
Cañivano
Bizarzari
Radondell blanco
Heraldo del Rhin
Trigo
Claro de Balazote
Las Mesas
Mondragon de Castronuevo
Obispado de Lebrija
Molla temprano
Reción
Obispado
Tremen
Rubio de Espiel
Macho Ciudad
Colorado de Jerez
Rojo de Lebrija
Caravaca colorado cañigrueso
Griego de Baleares
Asturias L7
Blat obeia
Redondillo de Fuentesaúco
Redondillo
Duro mocho
Trigo
Fino
Blanquillon de Boñar
Carita de raton
Rubion
Asturias H1
Murcia
Tenerife
Córdoba
Madrid
Asturias
Burgos
Sevilla
Las Palmas
Murcia
Córdoba
Albacete
Cáceres
Jaén
Jaén
Palencia
Avila
Baleares
La Rioja
Almería
Vizcaya
Gerona
Barcelona
Toledo
Albacete
Cuenca
Valladolid
Sevilla
Baleares
Málaga
Granada
Cádiz
Sevilla
Córdoba
Real
Cádiz
Sevilla
Murcia
Baleares
Asturias
Tarragona
Zamora
Navarra
105
Huelva
Badajoz
Badajoz
León
Cádiz
Almería
Asturias
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
4.2. Prolamin analysis
Glutenins were extracted following a sequential procedure (Singh et al., 1991).
Electrophoresis of glutenin subunits was performed on SDS-PAGE according to Payne
et al. (1980). HMW glutenin alleles at Glu-A1 and Glu-B1 loci were identified using the
nomenclature of Payne and Lawrence (1983). B-LMW glutenin alleles at Glu-A3, GluB3 and Glu-B2 loci were designated following Nieto-Taladriz et al. (1997). B-LMW
subunits were numbered according their relative electrophoretic mobility. New bands
between two subunits previously catalogued (Nieto-Taladriz et al., 1997) were
designated with the same number as the higher subunit plus “*” in agreement with
Martinez et al. (2004). The locus to which a novel allele belonged was predicted on the
basis of the electrophoretic mobility of the gene products. Thus, for example, new
subunits 21 and 22 were provisionally assigned to Glu-A3 because subunit 20 in the
zone of highest mobility was encoded at that locus (Nieto-Taladriz et al., 1997;
Martinez et al., 2004). In the same way, the rest of new subunits were assigned to GluB3. The provisional location of some subunits was confirmed with the analysis of
linkage relations to gliadin alleles. All these alleles were designated following the
international nomenclature system by McIntosh et al. (2003) Supplement 2006.
Gliadins were extracted from flour and fractionated in acid (pH 3.1) polyacrylamide gel
electrophoresis (A-PAGE) according to Lafiandra and Kasarda (1985). The
identification of Gli-A1 and Gli-B1 alleles was performed following the catalogue and
nomenclature proposed by Kudryavtsev et al. (1996). The new alleles detected in the
present work were termed as ‘new-’. Genetic diversity (Ht) was calculated according to
Nei (1973).
5.Results
5.1. Prolamin analysis
Duplicate profiles were produced for seven of the 52 entries, so these putative
duplicates were removed from the statistical analysis. Table 5 displays the prolamin
allele composition of all landraces studied. Table 2 shows the alleles identified at the
prolamin loci and their frequencies. The value of Ht across the collection is 0.721,
ranging from 0.458 to 0.856 for the individual loci. Five and nine alleles were detected
106
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
at Glu-A1 and Glu-B1, respectively (Table 2). Six of these alleles were rare (frequency
<5%). One allele not previously described in wheat was identified at Glu-B1 (new-1).
This allele controlled two subunits with mobilities lower and higher than that of subunit
8* (Fig. 1 lane 3). A total of 15, 18 and two alleles were detected at Glu-A3, Glu-B3 and
Glu-B2, respectively. Twenty-four of these alleles were rare. Eight new alleles were
studied at Glu-A3 and 12 at Glu-B3 (Table 2). LMW-subunits encoded by these new
alleles are shown in Table 3. In general, most of Glu-A3 new alleles encoded subunits
5*, 21 or 22 in addition to other subunits (Fig. 1 lanes 7 and 9). In contrast, most of the
new alleles at Glu-B3 produced combinations of previously reported subunits (e.g.,
new-1 and -2, see Fig. 1 lanes 5 and 11; and -4, -9, -10, -12 and -13, see Table 3). Some
new subunits were also identified at this locus (specifically, 1*, 1**, 7*, 7**, 7***, 8*
and 14*, see Fig. 1). Subunits 1* and 1** were not present with subunit 1, subunits 7*,
7**, 7*** and 8* with 7, 8 or 9, and subunit 14* with 14 or 13. This observation is
consistent with the suggestion that these subunits are allelic variants of established
subunits. For gliadins, eight alleles were detected at Gli-A1 and Gli-B1. Six of these
alleles were rare. One new allele was identified at Gli-A1 (new-3) and four at Gli-B1
(new-6 to new-9). Gliadins controlled by these alleles are described in Table 3 and
shown in Fig. 2.
107
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
1
1
7
8
HMW
subunits
6*
13
8*
16
2*
6
2*
6
13
q
8
16
1
1
6
6
8
1
3
6
B-LMW
subunits
1
3
13*
14
18
19
7***8*
2
5*
4
5*
11
12
15
16 16
20
22 14*
5
8
9
13
16
1
2*
1
7
8
7
13
8
16
7** 7***
1
8* 1
1
4
3 3
3 3
6
3
3
7*
3
13
133 3 3
3
3
4
15
14* 3 173 3 153
16
4
193
3
19
3
3
21
3
3
3
3
3
6
20x
20y
6
8
1**
1*
3
2
2
6
43
14 4
18 15
153
3
19
173 16
1
3
6 10
14
18
3
3
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11 12 13
14
15 16
Figure 1. High-molecular-weight (HMW) and low-molecular-weight (LMW) glutenin
subunits of some entries with new alleles. Lane 1: ‘Camacho’ (Glu-B1b); lane 2:
Triticum aestivum L. cv. Dawbull (Glu-B1w); lane 3: BGE 18646 (Glu-B1new1); 4:
‘Alaga’ (Glu-B3h); 5: BGE 13077 (Glu-B3new-1); 6: ‘Claro de Balazote’(Glu-B3g); 7:
BGE 13089 (Glu-A3new-8, Glu-B3new-6); 8: ‘Langdon’ (Glu-A3b, Glu-B3b); 9: BGE
13093 (Glu-A3new-5, Glu-B3new-8); 10: BGE 13100 (Glu-B3new-7); 11: BGE 13103
(Glu-B3new-2); 12: BGE 13590 (Glu-B3new-11); 13: ‘Alaga’; 14: BGE 8366 (GluB3new-3); 15: BGE 12537 (Glu-B3new-5); 16: BGE 12555 (Glu-A3c, Glu-B3h).
Subunits encoded at Glu-A1 and Glu-A3 are in italic, at Glu-B1 and Glu-B3 in regular,
and at Glu-B2 in bold. ‘Camacho’, ‘Dawbull’, ‘Alaga’, ‘Claro de Balazote’ and
‘Langdon’ are test varieties for the alleles indicated.
108
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
β
α
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figure 2. Gliadin electrophoretic spectra of some entries with new gliadin alleles. Lane
1: ‘Langdon’ (Gli-B1a); 2: BGE 12537 (Gli-B1new-9); 3: ‘Mexicali 75’ (Gli-B1c); 4:
BGE 13080 (Gli-B1new-6); 5: ‘Mexicali 75’ (Gli-B1c); 6: BGE 20942 (Gli-B1new-7);
7: ‘Alaga’ (Gli-B1new-1); 8: BGE 13100 (Gli-A1new-3, Gli-B1new-8); 9: ‘Mexicali 75’
(Gli-A1c, Gli-B1c). Arrowheads and arrows refer to bands encoged at the Gli-A1 and
Gli-B1 loci, respectively. ‘Langdon’, ‘Mexicali 75’ and ‘Alaga’ are test varieties for the
alleles indicated.
109
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 2. Allelic fequencies at each loci and gene diversity (H) for the whole sample,
convars. durum and turgidum and the North and South geographical groups.
Locus
Glu-A1
Allele
Frec
Total
%
convar. durum
Frec
%
convar. turgidum
North
South
Frec
% Frec
% Frec
%
a
b
c
f
o
Ht
15 33.3
11 24.4
17 37.8
1 2.2
1 2.2
0.685
7
2
17
1
25.9
7.4
63.0
3.7
0.529
8
9
1
-
44.4
50.0
5.6
0.549
6 46.2
6 46.2
1 7.7
0.567
7 29.2
3 12.5
13 54.2
1 4.2
0.603
a
an
b
d
e
f
q
y
new-1
Ht
3 6.7
2 4.4
2 4.4
24 53.3
5 11.1
3 6.7
3 6.7
1 2.2
2 4.4
0.683
1
1
1
17
5
2
-
3.7
3.7
3.7
63.0
18.5
7.4
0.559
2
1
1
7
1
3
1
2
11.1
5.6
5.6
38.9
5.6
16.7
5.6
11.1
0.783
2 15.4
1 7.7
4 30.8
1 7.7
1 7.7
3 23.1
1 7.7
0.804
2 8.3
16 66.7
3 12.5
1 4.2
1 4.2
1 4.2
0.527
a
b
c
d
e
f
h
new-1
new-2
new-3
new-4
new-5
new-6
new-7
new-8
Ht
16 35.6
4 8.9
1 2.2
1 2.2
9 20.0
2 4.4
1 2.2
3 6.7
2 4.4
1 2.2
1 2.2
1 2.2
1 2.2
1 2.2
1 2.2
0.812
12
1
1
6
2
1
1
1
1
1
-
44.4
3.7
3.7
22.2
7.4
3.7
3.7
3.7
3.7
3.7
0.738
4
3
1
3
2
1
1
1
1
1
22.2
16.7
5.6
16.7
11.1
5.6
5.6
5.6
5.6
5.6
0.863
6 46.2
1 7.7
2 15.4
1 7.7
1 7.7
7 29.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
5 20.8
2 8.3
1 4.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
a
b
d
f
h
i
new-1
new-2
new-3
new-4
new-5
new-6
new-7
new-8
new-9
new-10
new-11
new-12
new-13
Ht
15 33.3
2 4.4
3 6.7
1 2.2
4 8.9
2 4.4
3 6.7
1 2.2
1 2.2
1 2.2
1 2.2
3 6.7
1 2.2
1 2.2
2 4.4
1 2.2
1 2.2
1 2.2
1 2.2
0.856
14
1
3
3
1
1
1
1
1
1
51.9
3.7
11.1
11.1
3.7
3.7
3.7
3.7
3.7
3.7
0.696
1
1
1
1
1
3
1
1
3
1
1
2
1
-
5.6
5.6
5.6
5.6
5.6
16.7
5.6
5.6
16.7
5.6
5.6
11.1
5.6
0.900
1 7.7
2 15.4
Glu-B1
Glu-A3
1
1
7.7
7.7
0.733
1
1
-
4.2
4.2
0.846
Glu-B3
110
3 23.1
1 7.7
2 15.4
1 7.7
1 7.7
1 7.7
1 7.7
0.863
11 45.8
1 4.2
3 12.5
1 4.2
2 8.3
1 4.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
1 4.2
0.753
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 2.
(Cont.)
Locus
Glu-B2
Allele
a
b
Ht
Frec
Total
%
convar. durum
Frec
%
16 35.6
29 64.4
0.458
convar. turgidum
North
South
Frec
% Frec
% Frec
%
9
18
33.3
66.7
0.444
7
11
38.9
61.1
0.475
6 46.2
7 53.8
0.497
8 33.3
16 66.7
0.444
35.6
22.2
15.6
4.4
13.3
2.2
2.2
4.4
0.777
9
7
5
2
3
1
-
33.3
25.9
18.5
7.4
11.1
3.7
0.768
7
3
2
3
1
2
38.9
16.7
11.1
16.7
5.6
11.1
0.765
4
3
1
2
1
2
30.8
23.1
7.7
15.4
7.7
15.4
0.792
10
3
5
2
3
1
-
2 4.4
4 8.9
18 40.0
9 20.0
3 6.7
4 8.9
3 6.7
1 2.2
1 2.2
0.772
1
4
15
3
1
1
1
1
3.7
14.8
55.6
11.1
3.7
3.7
3.7
3.7
0.649
1
3
6
2
3
3
-
5.6
16.7
33.3
11.1
16.7
16.7
0.789
2
6
2
3
-
15.4
46.2
15.4
23.1
0.685
1 4.2
4 16.7
13 54.2
3 12.5
1 4.2
1 4.2
1 4.2
0.655
0.706
0.653
Gli-A1
b
c
e
f
g
k
new-2
new-3
Ht
16
10
7
2
6
1
1
2
41.7
12.5
20.8
8.3
12.5
4.2
0.742
Gli-B1
a
b
c
new-1
new-6
new-7
new-8
new-9
heterozygous
Ht
Ht
0.721
0.625
0.732
Table 3. B low-molecular-weight (B-LMW) glutenin subunits and gliadins encoded by
the new alleles found in the durum wheat varieties analysed. New B-LMW glutenin
subunits previously not identified (Nieto-Taladriz et al., 1997; Martinez et al., 2004) are
in bold
Glu-A3
Glu-B3
Gli-A1
Gli-B1
New1
5*, 11, 20
1, 3, 13*, 19
-
ω-34-37 γ-44a
New2
10
1, 3, 13, 17
γ-53a
New3
5, 11, 21
1**, 2, 4, 15, 17, 19
γ-48-50-51
New4
11, 21
7, 8, 15, 17
New5
6, 21
1*, 2, 4, 15, 16
New6
5*, 20
7***, 8*, 14*, 16
γ-40
New7
5*
7***, 8*, 14*, 16, 19
γ-43
New8
5*, 11, 22
4, 7**, 13, 15
ω-37 γ-44
New9
13, 15, 19
ω-35 γ-41
New10
13, 17, 19
New11
1, 3, 7*, 15, 19
New12
15, 17, 19
a
Described in Aguiriano et al. (2006)
111
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 4. Glutenin genotype of the low-molecular-weight (LMW) models found and the
gliadin alleles linked to them. For the new patterns the alternative Glu-3 or Glu-B2
allele previously found in Nieto-Taladriz et al. (1997) or Martinez et al. (2004) is within
parenthesis. A bank accession for the new alleles is also included.
Model
LMW-2
*
*
*
*
*
LMW-2*
*
*
*
*
LMW-2*
*
*
*
*
*
LMW-1
LMW-1*
*
Others
*
*
*
*
*
*
*
*
Glu-A3
Glu-B3
Glu-B2
Gli-A1
Gli-B1
a
d
f
a
a
new-6
new-7
new-5
a
a
a
a
a
a
a
new-8
a
b
b
b (a)
b (a)
a
a
b
c/b
b
b
c
b
g
g
k
c
b
c/ b
c/b
c/ new-1
c
c
c
BGE 18268
BGE 13603
BGE 13093
e
e
e
e
new4
d
d
new-3
new-5
f
b (a)
b (a)
b
b
b
e
f
e
e
e
c
b
c
new-9
c
BGE 8366
BGE 12537
BGE 13090
a (d)
c (d)
a
e
e
h
h
new-1 (l)
new-2
new-11
b
b
b
b
a
b/c
b
b
e
new-2
new-1
new-1
new-1
new-1
c
BGE 13077
BGE 13103
BGE 13590
b
b
b
i
b
b
b
b
a
new-6
h
e
b
new-4
a (b)
b
f
c
a
new-6
BGE 13080
e
new-1
new-8
new-1
new-2
new-2
b
new-3
new-7
new-6
new-6
new-9
new-9
new-10
new-12
new-6
a
a
a
a
a
b
a
a
new-3
g
g
g
new-3
e
c
b
new-8
new-8
new-8
new-7
new-7
new-7
new-7
new-1
BGE 13100
BGE 18646
BGE 13089
BGE 20942
BGE 30923
BGE 13622
BGE 2887
BGE 20948
*Pattern not previously described
112
Bank accession
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 5. Allele composition at prolamin loci related to durum wheat quality of the
landraces analysed.
Genebank
number
Gli-A1
Gli-B1
BGE002869
BGE002881
BGE002882
BGE002883
BGE002887
BGE004165
BGE008366
BGE012346
BGE012383
BGE012537
BGE012555
BGE013065
BGE013066
BGE013068
BGE013076
BGE013077
BGE013080
BGE013089
BGE013090
BGE013093
BGE013100
BGE013103
BGE013590
BGE013603
BGE013622
BGE013645
BGE013651
BGE013683
BGE013688
BGE017170
BGE018266
BGE018267
BGE018268
BGE018271
BGE018304
BGE018602
BGE018615
BGE018619
BGE018646
BGE018648
BGE018653
BGE018654
BGE019293
BGE020940
c
c
b
b
c
c
e
c
f
e
b
b
b
g
b
b
c
g
e
k
new-3
e
new-2
g
e
c
b
b
b
b
c
b
g
e
e
f
c
c
g
c
b
b
b
c
c
c
c
b
new-7
c
c
c
b
new-9
new-1
c
c
het
new-1
new-1
new-6
new-8
c
c
new-8
new-1
c
c
new-7
new-1
c
new-6
c
b
b
new-1
c
c
c
a
c
c
new-8
b
new-1
new-1
a
c
Glu-A1 Glu-B1 Glu-A3
b
a
a
c
a
c
c
c
c
c
a
a
a
c
b
b
b
b
a
a
a
b
c
c
a
a
a
c
c
c
c
a
c
o
c
c
b
f
a
c
b
b
b
f
d
d
d
d
d
e
e
e
d
an
d
d
d
e
q
q
d
an
y
d
d
a
b
f
d
f
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
f
new-1
d
q
q
a
f
113
a
a
f
f
b
a
e
a
e
e
c
a
a
new-1
a
a
e
new-8
new-4
new-5
e
e
e
new-7
new-2
a
a
b
a
d
a
a
new-6
e
e
h
a
a
new-1
a
a
a
b
a
Glu-B3
Glu-B2
a
a
a
a
new-12
a
new-3
a
d
new-5
h
a
a
het
new-1
new-1
new-4
new-6
f
new-8
new-7
new-2
new-11
a
new-10
h
a
i
a
a
a
h
a
d
d
b
a
a
new-6
a
new-1
new-1
b
a
b
b
b
b
a
a
b
a
b
b
b
b
b
a
b
b
b
a
b
b
a
b
a
a
b
b
b
b
a
b
b
b
a
b
b
a
b
b
a
b
b
b
b
b
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
Table 5. (Cont.)
Genebank
number
Gli-A1
Gli-B1
BGE020942
BGE020946
BGE020948
BGE021774
BGE021783
BGE021787
BGE026954
BGE030923
g
b
b
b
b
e
c
new-3
new-7
new-6
new-1
new-6
new-1
c
c
new-7
Glu-A1 Glu-B1 Glu-A3
a
b
b
b
b
c
c
a
d
b
new-1
b
a
d
e
d
new-1
b
new-3
b
a
e
a
new-2
Glu-B3
Glu-B2
new-9
i
new-6
i
h
d
a
new-9
a
b
a
b
b
b
a
a
Table 4 shows the different LMW genotypes identified and the gliadin alleles
linked to them. Some accessions having new alleles are included in the Table 4 and
Figs. 1 and 2. Eight different genotypes of the LMW-2 model, five of them not
previously identified, were studied. All these LMW-2 variants had the Glu-B3 alleles a
or new-8 (Fig. 1 lane 9), most of them linked to the gliadin alleles Gli-B1b or c (both
coding for gliadin γ-45). Five LMW-2- genotypes, all of them new, were identified.
These patterns possessed the Glu-A3 alleles e or new-4, linked to Gli-A1e or f (both
coding for γ-49 instead of the most common γ-51). Five LMW-2* variants, all of them
new, were observed. These patterns contained Glu-B3h (Fig. 1 lane 4) or new alleles,
linked to Gli-B1new-1 (γ-44), with one exception. The two LMW-1 genotypes detected
had been previously described, while the two LMW-1- were new. All of them were
linked to Gli-B1a (γ-42) or new- group, most of them with new alleles at both Glu-3
loci. Four genotypes were linked to Gli-B1new-1 or new-8 (both coding for γ-44) and
the other four to Gli-B1new-7 (γ-43).
5.2. Analysis of convar. durum and convar. turgidum
Table 2 also shows the allelic frequencies and gene diversity separately for
convars. durum and turgidum. At Glu-A1 locus, allele c (subunit Null) was the most
frequent in convar. durum but it was absent in convar. turgidum, while alleles a and b
(subunits 1 and 2*) were very common in the latter group. At Glu-B1, allele d (subunits
6+8) was the most frequent in both groups. In contrast to convar. durum, none variety of
convar. turgidum had the allele e (20x+20y). Also, convar. turgidum possessed larger
variability at this locus. Considering LMW subunits, the Glu-A3 alleles a and e were the
114
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
most frequent in both groups. Allele b, very common in convar. turgidum, was rare in
the durum set. The two groups had identical number of alleles but convar. turgidum
included more new alleles, more equally distributed and larger gene diversity (Table 2).
At Glu-B3, more than the 50% of durum accessions had the allele a (pla- ced within
LMW-2 model), while the most frequent alleles in convar. turgidum were new-1 and
new-6 (within LMW-2* or “others”). This latter group exhibited greater variability
being the highest allele frequency of 16.7%. The two Glu-B2 alleles presented similar
frequencies in both convarieties. Respect to the gliadin alleles, Gli-A1b and c (both
coding for γ-51) were widely distributed in the two groups. At Gli-B1, alleles c (γ-45)
and new-1 (γ-44) were the most common in convars. durum and turgidum, respectively.
In the latter group the gliadin alleles coding for γ-44 had a frequency of 50%, whereas
alleles controlling γ-45 were present in the 70% of the durum germplasm. Gene
diversity was larger in the turgidum group although more alleles were identified in
convar. durum.
5.3. Analysis of the North and South geographical areas
The accessions were classified into two groups according to their geographical
region of origin: the North (latitude > 41º 5´ 16´´ N) and the South of Spain (latitude ≤
41º 5´ 16´´ N). These two wide geographical areas had significant environmental
differences mainly in solar radiation and temperature. Of the 52 accessions, three had no
geographical origin known, five came from the islands and seven were duplicates. We
finally studied 37 accessions. Some differences in the allele frequencies were detected
between both geographical groups (Table 2). Among HMW glutenin alleles, Glu-A1c
was more frequent in the South, whereas a and b were more common in the North. At
Glu-B1, some alleles were present in one set but not in the other, showing the North
accessions higher diversity. For LMW glutenins, the Glu-A3 locus presented higher
variability in the wheats from the South and Glu-B3 in those from the North. The allele
Glu-B3a was the most common in the South (45.8%) and new-1 in the North. At GluB2, allele b was more frequent than a in the South, whereas they appeared almost
equally distributed in the North accessions. Regarding gliadin alleles, Gli-A1e and GliB1c were more frequent in the South, and Gli-A1c and Gli-B1new-1 in the North. The
latter group displayed higher variability at Gli-B1.
115
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
6.Discussion
The sample analysed included landraces from all the Spanish regions where
durum wheat has been traditionally cultivated. The genetic variability of 0.72 was
higher than the 0.36 which was obtained in cultivars from Portugal (Igrejas et al., 1999)
and the 0.67 obtained in Mediterranean landraces (Moragues et al., 2006). All the loci,
except Glu-B2, displayed a genetic variability higher than 0.62, being Glu-3 the most
polymorphic (Table 2). The number of alleles detected at Glu-1, Glu-3 and Gli-1 was
higher than those from other collections such as a world and ICARDA (International
Centre for Agricultural Research in the Dry Areas) collection (Kaan et al., 1993; Raciti
et al., 2003), landraces from Turkey, Portugal and Mediterranean basin (Turchetta et al.,
1995; Igrejas et al., 1999; Moragues et al., 2006) and cultivars grown in Portugal and
Spain (Brites et al., 1996; Nieto-Taladriz et al., 1997).
A great part of the variability found was due to the presence of new alleles at all
the loci, except for Glu-B2. At Glu-A1, allele f has not been previously reported in
durum wheat. This allele identified in bread wheat (Igrejas et al., 1997) conferred better
quality than the “Null” allele c, usually found at this locus (Brites et al., 2000). Most of
new alleles at Glu-A3 controlled new subunits. Subunit 5* present in cv. ‘Claro de
Balazote’ (Fig. 1 lane 6) probably corresponds to subunit 3 encoded at Glu-A3 analysed
by Ruiz and Carrillo (1993). Only six subunits encoded at Glu-A3 have been identified
so far (Nieto-Taladriz et al., 1997; Lerner et al., 2004). Although the assignment of new
subunits is provisional, the three new subunits reported in the present work would
increase considerably the variability at this locus. Subunit 13* has been identified
previously by Martinez et al. (2004), where it occurred in conjunction with subunits 1, 3
and 16 by Glu-B3aa (McIntosh et al., 2003, Supplement 2006).
The gliadin alleles Gli-A1new-2 and Gli-B1new-1 were previously studied in
Aguiriano et al. (2006). Furthermore, all new alleles at Gli-B1 encoded other gliadins
different from the most common γ-42 and γ-45. A total of 30 LMW patterns were
described in the present work, whereas 11 and 18 were reported by Turchetta et al.
(1995) and Moragues et al. (2006), respectively. LMW model variation was also higher
in the landraces analysed than in the cultivars grown in Spain (Nieto- Taladriz et al.,
1997). The most common LMW-pattern in both collections had allele a at Glu-3
(LMW-2), but differed in Glu-B2 alleles (a in cultivars and b in landraces) and in their
frequency (40% in cultivars vs. 13% in landraces). In the present work, this model was
116
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
typical of convar. durum, which is consistent with its high frequency in cultivars. On the
other hand, five different variants for LMW-2* models were found in the landraces in
contrast to the one found in the cultivars.
The frequencies of alleles associated with quality were compared with those
from other collections. At Glu-A1, allele c was the most frequent (subunit Null) in other
genepools (Brites et al., 1996; Igrejas et al., 1999; Raciti et al., 2003; Moragues et al.,
2006). In the present study, similar frequencies were observed for alleles a (subunit 1),
b (2*) and c (Null), probably due to the inclusion of convar. turgidum in our germplasm
(Table 2). Several studies (Ruiz and Carrillo, 1995; Turchetta et al., 1995; Brites and
Carrillo, 2001) have shown the better quality associated with the presence of an encoded
subunit at this locus. At Glu-B1, the most frequent alleles were d (6+8) and e (20x+20y)
in agreement with Brites et al. (1996), Igrejas et al. (1999) and Raciti et al. (2003).
Other studies have shown negative effects of Glu-B1e on quality (Ruiz and Carrillo,
1995; Turchetta et al., 1995; Brites and Carrillo, 2001). At Glu-A3, alleles a and e were
the most frequent in our collection, while b and h were more widespread in germplasm
from other Mediterranean countries (Igrejas et al., 1999; Moragues et al., 2006). Alleles
a and h have been associated with good gluten quality and e and b with poor quality
(Ruiz and Carrillo, 1995; Carrillo et al., 2000; Martinez et al., 2005). Similar to other
collections the Glu-B3a allele was the most common (Igrejas et al., 1999; Moragues et
al., 2006). This allele related to good quality (Ruiz and Carrillo, 1995; Brites and
Carrillo, 2001; Martinez et al., 2005) was very frequent in convar. durum. Gliadin
alleles Gli-B1c (γ-45) and new-1 (γ-44) were widely distributed in the Spanish
germplasm, whereas Gli-B1a (γ-42) and c (γ-45) were very common in landraces from
Portugal (Brites et al., 1996). Several studies have shown that γ-45 and γ-44 were
associated with better quality than γ-42 (Carrillo et al., 1990; Pogna et al., 1990; Ruiz
and Carrillo, 1995). All these results indicate that the sample analysed in the present
work could be an important source of valuable alleles for quality.
The linkage relationships between Glu-3 and Gli-1 (Table 4) have shown that
gliadins can be useful to detect new alleles coding for LMW glutenin subunits (not
linked to the most common γ-45 or γ-51) and to easily and quickly discard materials
(presence of γ-42 or γ-40) for quality improvement.
Relationships between prolamin composition and the botanical and geographical
classification were detected. Differences between convars. durum and turgidum often
coincided with those between North and South zones. While convar turgidum, more
117
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
resistant to low temperatures, has been traditionally grown in the North, convar durum,
more resistant to drought, has been grown in the South (Gadea, 1954). As a result, 77%
of varieties from the North belonged to convar. turgidum, and 83% of varieties from the
South belonged to convar. durum. Both convars. differ in some agromorphological traits
related to the spikes and grain. Convar. durum is more commonly grown and associated
with better quality. The most important allelic differences were at Glu-A1, Glu-B1, GliB1 and Glu-B3. Alleles Glu-A1c and Glu-B1e only present in convar. durum have
shown negative effects on quality, while Glu-A1b and a, very frequent in convar.
turgidum have shown positive effects (Ruiz and Carrillo, 1995; Turchetta et al. 1995;
Brites and Carrillo, 2001). In the present study, the genotype Glu-B3new-1 (LMW –2*)
- Gli-B1new-1 (γ-44) was very common in convar. turgidum and the North, and GluB3a (LMW-2)- Gli-B1c (γ-45) in convar. durum and the South. This result is consistent
with the better quality, in general, of convar. durum than turgidum considering that GluB3 alleles show the most significant effect on gluten quality (Ruiz and Carrillo, 1995;
Porceddu et al., 1998; Carrillo et al., 2000). On the other hand, Kudryavtsev et al.
(1996) pointed out that the Gli-B1 block (new-1) of cultivar ‘Lambro’ was probably
inherited from Triticum turgidum L. ssp. dicoccoides (Körn. Ex Asch. et Graebn.) Thell
or Triticum carthlicum (Nevski) Mackey. So, convar. turgidum could be more related to
these species than convar. durum.
118
Capítulo 4. Genetic variation for prolamins associated with quality
7.References
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121
CAPÍTULO 5
EFFECTS OF N FERTILISATION, YEAR AND
PROLAMIN ALLELES ON GLUTEN QUALITY
IN DURUM WHEAT (Triticum turgidum L. ssp. turgidum)
LANDRACES FROM SPAIN *
*
E. Aguiriano, M. Ruiz, R. Fité and J. M. Carrillo. 2009. Effects of N fertilisation, year
and prolamin alleles on gluten quality in durum wheat (Triticum turgidum L. ssp.
turgidum) landraces from Spain.Spanish Journal of Agricultural Research 7(2), 342-348
123
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
CAPÍTULO 5. EFFECTS OF N FERTILISATION, YEAR AND PROLAMIN
ALLELES ON GLUTEN QUALITY IN DURUM WHEAT (Triticum turgidum L.
ssp. turgidum) LANDRACES FROM SPAIN
1.Abstract
A subset of durum wheat Spanish landraces, previously evaluated for yield at
low and high nitrogen (N) levels, was analysed for quality, protein content (P) and
sodium dodecyl sulphate sedimentation (SDSS) test. The evaluation was carried out at
the two N rates and in two years. The influence of prolamin alleles at the Glu-1, Glu-3,
Glu-B2 and Gli- 1 loci on quality parameters was also studied. The non significant
Variety-by-Year or Variety-by-N interactions suggested that year and N affected all the
varieties in a similar manner. Year and N effects were larger than variety effect for P,
which increased with N. In contrast, variety genotype exhibited a stronger influence on
SDSS test, which was not affected by year and fertilizer. Variety effects on P did not
reflect the variety differences for SDSS test. A high positive influence of some prolamin
alleles on quality parameters was detected, mainly for SDSS values. No correlation
between yield and P was detected in the landraces adapted to low N. Based on the
results of yield and quality evaluations, four landraces with high yield and high gluten
strength were pre-selected for low N production.
Additional key words: cereals, germplasm, gliadins, glutenins, low-N, quality
breeding.
Abbreviations used: CRF-INIA (Plant Genetic Resources Centre - Spanish National
Institute for Agricultural and Food Research and Technology), HMW (high-molecularweight), LMW (low-molecular-weight), N (nitrogen), P (protein content), SDSS test
(sodium dodecyl sulphate sedimentation test),Y (year).
125
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
2.Resumen
Efectos del abonado N, año y alelos de prolaminas en la calidad del gluten en
variedades locales españolas de trigo duro (Triticum turgidum L. ssp. turgidum)
Se ha evaluado la calidad (contenido en proteína, P, y test de sedimentación con
dodecil sulfato sódico, SDSS) de un grupo de variedades locales españolas cuyo
rendimiento había sido estudiado previamente para alto y bajo abonado nitrogenado (N).
Los parámetros de calidad se han analizado para las dos dosis de N y en dos años.
También se ha estudiado la influencia en la calidad de los alelos de prolaminas de los
loci Glu-1, Glu-3, Glu-B2 y Gli-1. La existencia de interacciones no significativas
Variedad × Año ó Variedad × N indicaron que el año y el N afectaron a todas las
variedades de una forma similar. Los efectos del año y del N fueron mayores que el
efecto de la variedad para P, el cual aumentaba con el nivel de N. Por el contrario, la
variedad influyó más en el test SDSS que no se vio afectado por el año ni el abonado.
Los efectos de las variedades en P no reflejaron las diferencias en el SDSS. Se detectó
una influencia alta y positiva de algunos alelos de prolaminas en los parámetros de
calidad, principalmente en los valores del SDSS. No se detectaron correlaciones entre el
rendimiento y P en las variedades adaptadas a bajo N. En función de los resultados se
han seleccionado cuatro variedades locales con alto rendimiento y fuerza del gluten para
producción con bajo N.
Palabras clave adicionales: cereales, bajo-N, germoplasma, gliadinas, gluteninas,
mejora de la calidad.
126
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
3.Introduction
High yield and good quality are necessary features in today´s durum wheat
market. Both aspects respond positively to nitrogen (N) fertilization. However, there are
situations, as in marginal areas or for ´organic´ production, where reduced N use is
desired for environmental and economic reasons. Identification of wheat genotypes that
maintain quality and yield with minimal fertilizar input has a particular relevance. Pasta
quality depends mainly on grain protein, clearly influenced by environment and
correlated negatively with yield, and on the seed storage prolamin proteins. Some
studies have shown that particular allelic combinations of prolamins are responsible for
differences in gluten strength among cultivars (Carrillo et al., 1990; Kaan et al., 1993).
Hence, durum wheat quality can vary widely in response to environmental and
genotypic factors.
Local varieties possess a fair stability of production under sustainable farming
systems. The potential of such germplasm to reduce input use is considerable as a
source of genes for yield stability, stress tolerance and end-use quality. Also, these
varieties usually display higher genetic diversity than modern cultivars. The ability to
tap into that diversity depends on identifying those accessions containing alleles of
interest (Boggini et al., 1997). The evaluation of landraces for quality and yield at low
N rate can help to pre-select genotypes adapted to reduced N application.
In a previous study, a set of durum wheat landraces was evaluated for grain yield
at two N levels to identify genotypes adapted to low nitrogen production (Ruiz et al.,
2008). The allelic variation at seven prolamin loci involved in quality was also analysed
(Aguiriano et al., 2008). The objectives of the present work were to evaluate the same
landraces for quality at two N levels and in two different years, and to study the
influence of prolamin alleles on quality parameters.
127
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
4.Material and methods
4.1. Material
Fifty Spanish durum wheat (Triticum turgidum L. ssp. turgidum) landraces from
27 provinces were selected from the wheat collection maintained in the Plant Genetic
Resources Centre at the Spanish National Institute for Agricultural and Food Research
and Technology (CRF-INIA). The Bank number, local name, and geographical region
of the landraces were described in Aguiriano et al. (2008). This sample set was
evaluated during two seasons (2001-2002 and 2003-2004) and at two N rates in 2004.
All the varieties were sown in a randomized-complete-block design described by Ruiz
et al. (2008), under rainfed conditions at Alcalá de Henares, Madrid. The N experiment
was design with two treatments (varieties and N fertilizer) in November 2003. The
seeding rate was 400 seeds per plot for both N levels. The harvested plot size was 1.5
m2 (two rows, 2 m long, 37.5 cm apart) with a plot spacing of 112.5 cm. Nitrogen was
applied at a rate of 40 kg/ha (8-24-8) prior to sowing. In February, two rates of N as
ammonium nitrate were applied, 40 kg/ha in the low N level experiment and 180 kg/ha
in the high N level experiment. Four cultivars were used as test varieties: ‘Senatore
Capelli’, an old cultivar released in Italy before 1930, ‘Cocorit-71’, a semidwarf cultivar
released in Spain in1977, ‘Yavaros-79’, one of the most cultivated varieties in Spain
released in 1984 and 'Don Pedro', released in 1990 and cultivated in the South of Spain.
4.2. Quality evaluation
The prolamin composition of the landraces was reported in Aguiriano et al.
(2008) (Table 5 of chapter 4). HMW glutenin alleles at Glu-1, and B-LMW glutenin
alleles at Glu-3 and Glu-B2 were identified with the nomenclature of Payne and
Lawrence (1983) and Nieto-Taladriz et al. (1997), respectively. Gliadin alleles at Gli-1
were designated following Kudryavtsev et al. (1996). Gluten strength was estimated by
SDSS test, according to Dick and Quick (1983). Grain protein (P) at 14% moisture was
measured by a near-infrared reflectance analyser. The data were analysed by a two-way
ANOVA. Differences between means and relationships between variables were tested
using Student´s t-test and Pearson correlation coefficients, respectively.
128
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
5.Results
5.1. Quality parameters
The SDSS and P values obtained for each treatment are shown in table 4.
Analyses of variance of grain protein and SDSS test showed no significant Variety-byYear and Variety-by N fertilizer interactions (Table 1). Variety, year and N rate affected
significantly grain protein (P), with N showing the greatest effect (Table 1). Ninety two
percent of the varieties had higher P at high N than at low N level. The best test variety
at low N was the old cultivar Senatore Capelli with a P of 14.4 %. Fourteen landraces
had P values higher than 14.0 % at low N level, which is considered a «good» value for
durum wheat quality.
Variety was the only significant effect on SDSS over years and N rates (Table
1). Senatore Capelli had the best values in all the experiments (50.5 to 67.2 mm) typical
of «very high» gluten strength. Yavaros and Don Pedro showed values from 37.5 to
43.5 mm, which is in agreement with the «high» gluten strength of these cultivars.
Twenty-two landraces had «high» SDSS values (>43.5 mm) and ten «very high» (>50
mm) at low N rate.
129
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Table 1. Statistical significance and range of variation of grain protein (P) and sodium
dodecyl sulphate sedimentation (SDSS) test over years and nitrogen (N) fertilisation
rates.
Treatment
2002
2004
Low-N
High-N
ANOVA
F-Variety (Y)
F-Year
F-Variety (N)
F-Nitrogen
V Y
V N
P (%)
Mean
14.6a
14.1b
13.5a
14.2b
SDSS (mm)
Range
12.9-16.5
11.9-16.2
11.8-16.6
12.8-15.8
2.57**
10.96**
3.76**
51.71**
0.59 NS
0.08 NS
Mean
40.5
40.6
42.7
41.5
Range
22.5-70.0
21.5-74.5
18.0-78.7
21.5-69.7
11.64**
0.00 NS
26.66**
3.92 NS
3.86 NS
0.51 NS
NS., *,**: non significant, significant at P=0.05 and P=0.01, respectively. Between
years and N rates means followed by a different letter aresignificantly different at P ≤
0.05
The accessions were classified in two groups by their geographical region: North
(latitude > 41º 5´ 16´´ N) and South of Spain (latitude ≤ 41º 5´16´´ N). These two wide
geographical areas have significant environmental differences in solar radiation and
temperature. For P, both groups showed similar values over years and fertilizer. In
contrast, landraces from the South had higher SDSS values than those from the North in
both years and N rates (Table 2). Varieties were classified according to their convar.
durum (27 entries) or turgidum (18 entries). No significant differences were observed
between both groups (results not shown).
130
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Table 2. Statistical significance of grain protein (P) and sodium dodecyl sulphate
sedimentation (SDSS) test means between the North and South geographical groups.
P
Low-N
High-N
Two-year average
North
13.7
14.5
14.6
South
13.4
14.1
14.3
North
38.6a
38.3a
37.6a
SDSS
South
47.0b
45.5b
44.4b
Means in the same row followed by a different letter are significantly different at P ≤ 0.05
5.2. Parameter correlations
Correlations between SDSS test and P were significant only in year 2002 (r =
0.296, P ≤ 0.05). Significant correlations (r ≥ 0.428, P ≤ 0.01) were detected between
the four P values from the four experiments (in the two years and at both N levels). The
four SDSS values were also significantly correlated (r ≥ 0.760, P ≤ 0.01). Correlations
between P and yield (yield data in Ruiz et al., 2008) were calculated at the two N levels.
No significant correlation was detected at low N while a significant negative correlation
was found at high N level (P ≤ 0.05). In previous work (Ruiz et al., 2008), these
varieties were classified according to their yield response to N fertilizer in low-N
varieties (negative response), high-N varieties (positive response) and indifferent-N
varieties (indifferent response). The analysis for each subgroup indicated that
correlations between P and yield were negatively significant only for high-N varieties at
high N.
5.3. Effects of prolamin alleles on quality parameters
Due to the observed P dependence upon environmental conditions (N and year,
Table 1) only the allelic variants with means significantly different in more than one
experiment were considered. P values at low and high N level, respectively, for the
alleles Glu-A1a (13.7 and 14.6) and c (13.7 and 14.2) were higher than for allele b (12.9
and 13.8). For the rest of the loci, Glu-A3new-1 (14.5 and 15.0) was better than e (13.4
and 13.9), Gli-A1new-3 (13.9 and 14.8) than e (12.8 and 13.6), and Gli-B1b (14.1 and
14.8) than new-6 (12.5 and 13.3).
131
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Analyses of the SDSS data for all the allelic variants of prolamins are shown in
Table 3. Since no significant year effect was evident from ANOVA (Table 1) the
average of the two seasons 2002 and 2004 was studied.
For HMW glutenin subunits, landraces with Glu-A1b had lower SDSS values
than those with allele a. For Glu-B1, allele b had the highest mean value but the
differences were not statistically proved because of the high variance of the landraces of
this group. Glu-B1new-1 had higher values than a, d, e and q in the two years and in the
N experiments, although the differences were not statistically evident in the latter.
Allele a was associated with lower values than d and e at low N level and in both years.
Regarding LMW glutenin subunits encoded at Glu-A3, allele f was associated
with the best SDSS values, but differences were not statistically significant due to the
high variability of the group. Allele new-1 had higher values than a, b and e in both
years and in the N experiments although the differences were not significant in the
latter. At Glu-B2, allele a resulted better than b at both N rates. At Glu-B3, allele a
performed significantly better than h and new-1 at low N, than b and h at high N, and
than b and new-1 in both years. The new alleles new-6 and new-9 showed the best
values (not statistically proven). For the gliadins encoded at Gli-A1, significant
differences were obtained only at high N level. In this experiment, allele b performed
better than f and new-3. At Gli-B1, allele a had significantly coger values than b and c at
high N level and in both years. At low N, alleles b and c were associated with
significantly better SDSS values than new-1.
132
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Table 3. Means and standard deviation of the sodium dodecyl sulphate sedimentation
(SDSS) test values for the prolamin alleles at both Nitrogen (N) fertilizer levels and the
two-year average.
Locus
Glu-A1
a
b
c
Glu-B1
a
an
b
d
e
f
new-1
q
Glu-A3
a
b
e
f
new-1
new-2
Glu-B2
a
b
Glu-B3
a
b
d
h
i
new-1
new-6
new-9
Gli-A1
B
c
e
f
g
new-3
Gli-B1
a
b
c
new-1
new-6
new-7
new-8
Low- N
High -N
Two-year average
46.9 ± 12.2a
37.1 ± 7.8b
43.5 ± 13.1
43.8 ± 10.2
37.6 ± 8.8
43.0 ±12.4
44.4 ± 10.6a
35.7 ± 8.8b
41.9 ± 10.9
31.8 ± 4.3a
26.0 ± 11.3
54.3 ± 15.2
44.1 ± 12.2b
44.0 ± 11.1b
42.3 ± 14.6
49.8 ± 7.4
39.2 ± 1.0
32.7 ± 2.3bd
25.3 ± 5.3cd
53.5 ± 15.6
42.0 ± 10.4ac
43.0 ± 11.3ab
41.8 ± 16.8
51.0 ± 9.2
41.7 ± 3.4 ac
29.5 ± 4.2b
28.4 ± 7.6
54.4 ± 10.7
41.7 ± 10.6c
41.4 ± 7.5c
40.8 ± 15.3
53.1 ± 1.8a
37.8 ± 1.6bc
43.0 ± 8.0
34.3 ± 7.5
34.6 ± 13.9
66.1 ± 17.9
49.5 ± 10.3
49.5 ± 13.4
41.7 ± 8.9
35.9 ± 6.0
35.9 ± 12.6
61.1 ± 12.2
45.7 ± 5.3
43.0 ± 14.1
38.9 ± 7.7a
35.0 ± 8.3a
37.5 ± 12.0a
64.0 ± 11.7
51.8 ± 3.0b
41.0 ± 10.6
47.3 ± 9.9a
40.2 ± 12.3b
45.9 ± 10.4a
39.2 ± 10.4b
44.8 ± 9.6a
38.8 ± 10.7b
49.5 ± 11.1a
35.5 ± 4.9
37.2 ± 9.3
36.9 ± 5.5b
34.5 ± 12.7
39.2 ± 1.3b
44.5 ± 10.5
49.5 ± 13.4
47.0 ± 11.4a
36.0 ± 2.8b
36.5 ± 8.5
35.8 ± 5.6b
35.5 ± 9.9
41.7 ± 4.2
43.7 ± 14.3
42.5 ± 13.4
45.0 ± 11.5a
32.9 ± 2.3b
41.0 ± 8.0
34.7 ± 8.3
37.4 ± 13.3
37.8 ± 2.0b
46.7 ± 11.3
44.8 ± 16.0
44.6 ± 12.9
41.1 ± 8.9
36.3 ± 15.0
41.0 ± 2.8
47.5 ± 10.5
37.0 ± 4.2
44.1 ± 11.1a
39.4 ± 9.7
36.7 ± 11.5
37.8 ± 0.4b
44.8 ± 11.4
34.8 ± 2.5b
42.3 ± 12.0
37.9 ± 8.3
36.1 ± 9.1
41.0 ± 9.2
47.3 ± 10.9
36.1 ± 3.7
35.5 ± 3.5
47.0 ± 4.7a
47.2 ± 12.7a
38.4 ± 8.4b
32.2 ± 9.9
48.5 ± 12.2
37.5 ± 6.1
36.0 ± 2.0a
45.0 ± 7.4
44.1 ± 12.5b
40.1 ± 8.9
33.2 ± 8.1
44.1 ± 9.9
36.7 ± 7.8
32.9 ± 1.6a
46.5 ± 7.1b
42.9 ± 11.8b
37.9 ± 8.9
34.6 ± 10.6
43.0 ± 11.2
41.5 ± 9.4
Means in the same column and locus followed by different letters are significantly different at P ≤ 0.05
133
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Table 4. SDSS and P values obtained for each treatment in the fifty Spanish landraces
and four test varieties of dururm wheat.
Genebank number
BGE 2881
BGE 2882
BGE 2883
BGE 2887
BGE 4165
BGE 8366
BGE 12346
BGE 12383
BGE 12537
BGE 12555
BGE 13065
BGE 13066
BGE 13068
BGE 13076
BGE 13077
BGE 13080
BGE 13089
BGE 13090
BGE 13093
BGE 13100
BGE 13103
BGE 13590
BGE 13603
BGE 13622
BGE 13645
BGE 13651
BGE 13683
BGE 13688
BGE 17170
BGE 18266
BGE 18267
BGE 18268
BGE 18271
BGE 18304
BGE 18602
BGE 18615
BGE 18619
BGE 18646
BGE 18648
BGE 18653
BGE 19293
BGE 20940
BGE 20942
BGE 20946
BGE 20948
BGE 21774
BGE 21783
BGE 21787
SDSS (mm)
Year
N level
2002
2004
High
Low
46.25
52.50
32.75
48.25
70.00
74.50
69.75
78.75
52.50
59.00
52.50
53.50
33.50
34.50
38.50
36.00
49.50
42.00
44.00
45.50
29.50
28.50
29.00
28.00
50.00
33.50
56.50
54.00
46.00
49.00
37.50
43.00
22.50
23.50
21.50
18.00
42.00
45.00
41.00
42.00
51.00
54.00
41.50
46.50
51.00
49.50
46.00
47.50
49.50
45.00
40.50
45.00
36.00
36.50
42.00
41.00
33.50
46.50
39.50
38.00
25.00
33.00
28.50
27.50
34.50
33.00
29.00
34.00
37.50
37.00
39.50
44.50
39.50
41.50
43.50
47.00
40.00
37.50
36.50
34.00
31.00
34.00
34.00
27.50
55.50
68.50
64.50
65.00
54.00
60.00
59.50
58.00
47.00
50.00
53.00
59.00
37.00
41.00
40.00
40.00
46.50
34.00
54.50
54.00
26.00
30.00
28.50
25.50
49.50
42.50
52.50
55.50
40.00
37.50
40.00
44.00
41.50
46.50
50.00
47.50
34.50
28.50
32.00
29.50
42.50
32.50
43.50
44.50
44.50
42.50
44.50
42.00
31.50
32.50
27.50
26.50
37.00
32.00
38.00
39.00
30.00
23.50
33.00
35.50
29.00
24.00
26.00
29.00
50.25
53.50
44.50
44.50
40.00
42.00
55.50
51.75
36.50
38.50
46.50
39.00
30.50
32.00
34.00
32.00
31.00
21.50
30.50
34.00
53.00
59.25
52.00
59.00
38.00
40.00
43.00
41.50
60.00
48.75
57.50
55.00
43.00
50.75
42.50
43.50
27.50
22.00
30.00
36.00
27.50
26.00
33.50
38.50
134
P (%)
Year
N level
2002
2004
High
Low
14.95
15.15
15.14
14.12
16.55
14.11
14.61
13.35
15.03
14.78
15.24
14.82
15.83
15.07
15.84
14.66
15.43
15.71
15.44
16.60
16.08
16.19
14.14
15.07
15.03
15.46
14.88
13.91
14.44
14.11
14.80
14.11
14.17
14.96
13.78
11.77
14.38
14.57
14.50
13.19
15.01
14.04
15.22
12.74
15.32
14.37
15.04
13.48
14.51
13.72
14.25
13.98
15.46
12.63
14.57
12.59
14.54
13.13
13.48
12.12
12.91
13.86
13.02
12.59
14.35
14.75
14.04
12.05
13.84
14.59
13.42
13.20
15.64
13.24
13.87
14.24
14.96
14.81
14.78
14.09
14.70
13.32
13.28
12.74
15.17
14.64
14.30
13.60
14.70
14.72
13.40
13.69
13.11
14.25
13.53
12.40
15.68
13.79
14.33
12.66
15.49
15.99
15.41
14.11
14.30
14.19
14.07
12.26
15.08
14.81
13.51
13.31
14.13
13.03
13.69
13.38
14.54
15.83
15.30
13.98
14.24
13.35
13.91
13.02
13.29
13.68
13.87
12.99
13.00
13.59
14.01
13.57
14.87
13.69
13.66
13.30
15.36
13.95
13.95
13.58
13.95
13.47
13.24
12.38
13.41
13.35
13.19
12.96
16.02
15.67
15.19
14.72
14.41
15.39
14.30
14.76
14.52
12.82
13.85
13.82
13.98
14.11
14.30
14.11
13.86
11.88
14.08
13.76
14.81
13.37
14.78
14.23
13.48
13.98
14.09
13.00
13.67
13.70
14.51
12.73
13.27
12.27
12.80
12.69
14.06
12.95
15.25
14.06
14.96
14.04
15.02
13.64
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
Table 4 (Cont.).
Genebank number
BGE 26954
BGE 30923
‘Cocorit-71’
‘Senatore Capelli’
‘Don Pedro’
‘Yavaros-79’
SDSS (mm)
Year
N level
2002
2004
High
Low
40.00
46.50
45.00
47.50
33.00
34.00
33.00
40.00
43.00
46.50
42.50
49.00
52.50
50.50
67.25
53.00
40.50
43.50
41.00
37.50
P (%)
Year
N level
2002
2004
High
Low
13.38
12.70
13.25
12.70
14.76
14.04
14.86
13.72
14.14
13.42
13.44
12.20
14.81
13.61
14.07
14.43
13.28
12.47
12.69
11.27
6.Discusión
The absence of significant Variety-by-Year or by-N interactions (Table 1)
suggested that year and N affected all the varieties in a similar manner. This stability is
desirable if selecting for use in diverse environments. Ames et al. (2003) obtained the
same result for the SDSS test but they found a significantV × N interaction for P. In
contrast, Lerner et al. (2006) detected no significant V × N interaction for P, and
significantY × V interaction for P and SDSS. Boggini et al. (1997) found significant
genotype-environment interaction for both quality parameters. The wide ranges of
variation found for P and SDSS test were expected because the landraces analysed
varied greatly in geographical origin and agro-morphological characters (Ruiz et al.,
2008).
6.1.Quality parameters
Although P was affected significantly by genotypic variation, the environmental
effect (Y and N) was greater (Table 1). These results were in agreement with Boggini et
al. (1997), Abad et al. (2004) and Lerner et al. (2006). In general grain protein
responded positively to increasing levels of N fertilizer in agreement with Ames et al.
(2003) and Abad et al. (2004).
Varieties had a large effect on SDSS test in both years and N rates, but year and
fertilizer did not affect this quality parameter (Table 1). Ames et al. (2003) detected a
positive influence of N on SDSS values, whereas Abad et al. (2004) observed that the N
effect depended on location and year. Lerner et al. (2006) found significant effects of Y
and fertilizer but V was the most important factor for SDSS. The significant correlations
found among all the P and among all the SDSS values, in spite of the different
135
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
environmental conditions (Y and N), indicated that both parameters were under genetic
control. The high correlation obtained for SDSS values confirms the strong influence of
variety genotype on this test. Variety effects on P did not reflect the variety differences
for SDSS test. These results suggested that loci controlling both factors were different
and increased P did not significantly influence gluten strength. Negative correlation
between yield and P were detected at high N only in high-N varieties. The absence of
correlation between yield and P for the varieties adapted to low N (low- and indifferentN varieties) allows simultaneous selection for yield and P together with high quality.
6.2.Effects of prolamin alleles on quality parameters
Very few significant differences were found between prolamin alleles for P.
There was a negative influence of the alleles Glu-A1b, Glu-A3e, Gli-A1e and GliB1new-6, and a positive influence of Glu-A1a and c, Glu-A3new-1, Gli-A1new-3 and
Gli-B1b. In contrast, Kaan et al. (1993) found a negative effect of Glu-A1c and no
significant effect of a and b. These authors also found no significant differences
between the Glu-B1b, d, e and f as in the present work.
The ranking of prolamin alleles obtained in relation to SDSS test was similar in
the four experiments (Table 3). The influence of alleles a (subunit 1) and b (2*) at GluA1 has not often been studied since most durum wheats possess allele c (Null). In this
work, allele b showed a negative influence while allele a improved SDSS values (Table
3). In the varieties analysed, allele b appeared together with the Gli-B1new-1 or new-6
and Glu-B3new-1, which conferred poorer quality than other alleles at the same loci
(Table 3). For instance, Glu-A1a was more frequently linked to Gli-B1c (γ-45) and GluB3a, both associated with good quality (Table 3). These results confirmed those of Kaan
et al. (1993) who found a positive influence of Glu-A1a and a relationship between this
allele and the presence of γ-45. On the other hand, Brites and Carrillo (2001) obtained
no significant differences between b and c, whereas Raciti et al. (2003) observed that
allele b had better gluten quality than c. In the present work, it seems that the remaining
allelic composition at Gli-B1-Glu-B3 is too prejudicial to allow compensation. It is
known that Glu-A1 is genetically independent of Gli-B1 and Glu-B3, so the association
found (linkage disequilibrium) could be affected by a selection process or confer some
selective advantage.
136
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
For Glu-B1 alleles, a positive contribution of new-1, d (6+8) and e (20x+20y),
and a negative contribution of a (7) were observed. Allele new-1 controlled two
subunits with mobility lower and higher, respectively, than that of subunit 8*
(Aguiriano et al., 2008). Only two varieties were analysed having allele b (7+8), but its
presence was associated with the highest values, supporting the results of Boggini et al.
(1997) and Lerner et al. (2006). The positive effects of d and b on SDSS were also
detected by Turchetta et al. (1995), Raciti et al. (2003) and Martinez et al. (2005).
Contrary to these results, several studies have observed a negative contribution of allele
e to gluten quality (Ruiz and Carrillo, 1995; Turchetta et al., 1995; Brites and Carrillo,
2001). However, Raciti et al. (2003), Vazquez et al. (1996) and Ciaffi et al. (1991)
found that allele e had similar quality to d. Nevertheless, the varieties with allele e
analysed in this study frequently possessed allele a at Glu-B3 and c at Gli-B1, which
had a clear positive influence on quality (Table 3).
Regarding LMW glutenin subunits, Glu-B2a was better than b at both N levels
(Table 3). In general, no significant differences between both alleles have been shown
in other studies (Ruiz and Carrillo, 1996; Brites and Carrillo, 2001) although Martinez
et al. (2005) found a positive effect of a on the mixograph test. Alleles at Glu-A3 and
Gli-A1 loci, both tightly linked, showed very few significant differences, mainly at low
N level (Table 3). The Glu-A3new-1 and f were associated with the highest values, and
a, b and e with the lowest. Allele f was analysed only in two varieties, both having the
Glu-B3a related to high gluten strength. Very few reports have studied the relations
between Glu-A3 alleles and quality. Ruiz and Carrillo (1995) and Vazquez et al. (1996)
found no influence of Glu-A3 on SDSS test. In contrast, Carrillo et al. (2000) observed
that allele a, more common in wheat cultivars, was superior to f, and both better than b
and e. The superiority of new-1 with respect to the «good» allele a may be a valuable
find for quality breeding that should be confirmed with further study. In agreement with
this result, the best allele at Gli-A1, allele g, was linked to Glu- A3new-1. At Glu-B3,
allele a was clearly superior with respect to h, new-1 and b. Alleles a and b are usually
present, respectively, in the glutenin patterns LMW-2 and LMW-1 which are associated
with high and low gluten quality (Carrillo et al., 1990; Ciaffi et al., 1991).
For Gli-B1, the results were in agreement with the tight linkage between Glu-B3
and Gli-B1. Hence, Gli-B1b and c (γ- 45 and linked to Glu-B3a) were associated with
higher SDSS values than new-1 (γ-44 and linked to Glu-B3new-1) and a (γ-42 and
linked to Glu-B3b). This result is consistent with the better quality of landraces from the
137
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
South than from the North of Spain (Table 2), taking into account that Glu-B3a and GliB1c were more frequent in the former group and Glu-B3new-1 in the latter (Aguiriano et
al., 2008).
The same durum wheat landraces studied in this work were previously evaluated
for grain yield at low N production (Ruiz et al., 2008). Based on the results of both
evaluations, four landraces were selected, all of them low-N varieties from the South of
Spain, with high yield and high gluten quality at low N level. These varieties preselected, after confirmation through more extensive trials, could be a reservoir of widely
adapted germplasm for sustainable low-input production.
138
Capítulo 5. N, year and prolamin effects on quality
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140
DISCUSIÓN GENERAL
141
DISCUSIÓN GENERAL
DISCUSIÓN GENERAL
1.Selección de los SSRs para identificación de variedades locales españolas de
T. monococcum y T. turgidum
Se han puesto a punto un grupo de 24 SSRs repartidos por todo el genoma de
trigo duro, cada uno en un brazo cromosómico diferente, que han mostrado ser de gran
utilidad para la caracterización de recursos fitogenéticos del T. turgidum y de T.
monococcum (Tabla 5 Cap. 3). Como los resultados obtenidos con los SSRs, en cuanto
al polimorfismo y la calidad del producto amplificado, varían en función del
germoplasma analizado (Mathias et al., 2007), se seleccionaron, de entre los más
polimórficos, los SSRs que mostraron los mejores resultados en el análisis de las
variedades locales españolas de la colección de trigo duro. La calidad del producto
amplificado afecta directamente a la fiabilidad de la lectura de los alelos de SSRs, que
puede complicarse considerablemente con la aparición en la amplificación de
secuencias inespecíficas (Shigemori et al, 2005). Esto ocurre frecuentemente cuando el
cebador no está bien diseñado y encuentra secuencias semejantes en otras regiones del
genoma. Este problema puede solventarse ajustando las condiciones de la PCR
(reacción en cadena de la polimerasa) para cada SSR; sin embargo, cuando deben
analizarse muchas muestras con un gran número de SSRs, como ocurre en los bancos de
germoplasma, el emplear un grupo de cebadores con requerimientos muy diferentes
hace inviable su aplicación. Los microsatélites puestos a punto en esta tesis cumplen
esta condición, ya que las necesidades de amplificación difieren solo en la temperatura
de anillamiento del cebador, aunque con tres diferentes se amplifican los 24 SSRs. El
emplear SSRs con requerimientos semejantes permite abaratar los costes y reducir el
trabajo, al combinar en la misma PCR cebadores de varios SSRs con un tamaño alélico
esperado muy diferente (PCR múltiple) (Ma et al., 2003). Además, uno de ellos, el
Xgmw332, amplifica dos loci polimórficos, lo que supone mayor información con el
mismo coste (Tabla 4 Cap. 3).
143
DISCUSIÓN GENERAL
2.Identificación genética con alelos de gliadinas y SSRs de variedades locales
españolas de trigo duro (Cap. 1 y Cap. 3) y de T. monococcum L. (Cap. 2).
Para identificar los diferentes genotipos presentes en las submuestras analizadas
de T. monococcum y trigo duro, se realizó, como primer, paso un análisis de la
homogeneidad de las entradas, comparando los perfiles electroforéticos de al menos 8
individuos por accesión para T. monococcum y de 10 para trigo duro. De esta forma, se
identificaron las entradas homogéneas que presentaban un único genotipo (gt. 1) para
gliadinas, gluteninas HMW y proteína total, y las entradas heterogéneas que mostraban
un genotipo principal (gt. 1) con una frecuencia mayor y otros genotipos menos
frecuentes (gt. 2, gt. 3…). La caracterización genética de los alelos de gliadinas,
gluteninas HMW y SSRs se realizó en todos los genotipos diferentes detectados para
proteínas. Para ello, se identificó cada grano con su genotipo; medio grano se utilizó
para el análisis de las proteínas (gliadinas, gluteninas HMW y proteína total), y el otro
medio grano con el embrión se sembró para obtener ADN suficiente para analizar los 24
SSRs seleccionados.
En las 17 entradas españolas de T. monococcum, se han identificado los dos
bloques alélicos independientes codificados por los loci Gli-A1m y Gli-A2m de gliadinas.
En total, se han detectado 22 genotipos diferentes, identificándose 7 y 17 alelos en los
loci Gli-A1m y Gli-A2m, respectivamente (Tabla 5 Cap. 2). El número de alelos
diferentes observados en esta colección es comparable al obtenido en otros trabajos que
analizaban también escaña menor o T. monococcum (Saponaro et al., 1995; Metakovsky
y Baboev, 1992; Álvarez et al., 2006). El número efectivo de alelos para el Gli-A1m fue
bajo (3,4) debido a que dos alelos, el d y el e, de los 7 detectados acumularon más del
70% de la variabilidad (Tabla 2 Cap. 2). Al igual que en trigo duro, el Gli-A2m fue el
más polimórfico y el más útil para diferenciar variedades (Tablas 3 y 4 Cap. 2). Este
resultado coincide con el obtenido en otros trabajos con T. monococcum (Metakovsky y
Baboev, 1992; Castagna et al., 1994; Saponaro et al., 1995; Álvarez et al., 2006). Se han
observado similitudes entre algunos bloques del Gli-A1m de T. monococcum y algunos
bloques del Gli-A1 de T. turgidum L. y T. aestivum L. (Fig. 2 Cap. 2), lo que confirma
la similitud genética entre cromosomas del mismo grupo de homeología de las
diferentes especies de la tribu Triticeae.
En trigo duro, el empleo conjunto de gliadinas, gluteninas HMW y proteína total
permitió diferenciar 42 genotipos en la muestra de 23 variedades (17 variedades locales
144
DISCUSIÓN GENERAL
y 6 cultivares antiguos) cultivadas en España (Tabla 1 Cap. 3). La caracterización solo
con alelos de gliadinas identificó 34 genotipos diferentes. Todos los loci de gliadinas
analizados (Gli-A1, Gli-B1, Gli-A2, Gli-B2, Gli-B3 y Gli-B5) fueron polimórficos, con
los que se identificaron 38 alelos diferentes, con una media de 6,5 alelos por locus. Los
loci Gli-A2 y Gli-B2 fueron los más polimórficos (Tablas 2 y 3 Cap. 1). Kudryavtsev et
al. (1996) en cultivares modernos italianos de trigo duro, Ruiz et al. (2002b) en un
grupo de variedades locales españolas de trigo panadero y Melnikova et al. (2010a) en
variedades locales búlgaras de trigo duro, también encontraron que los loci del grupo 6
de homeología presentaban la mayor variabilidad genética. En el presente trabajo el
locus Gli-B1 mostró el menor polimorfismo de los cuatro loci principales Gli-A1, GliB1, Gli-A2 y Gli-B2 (Tabla 3 Cap. 1). Esta diferencia en el polimorfismo de los loci de
gliadinas puede deberse a la estrecha relación del locus Gli-B1 con la calidad del trigo
duro, que ha podido provocar la desaparición de algunas variantes alélicas asociadas a
mala calidad. De hecho, la frecuencia acumulada de los alelos que presentaron la
subunidad γ-45 de gliadinas, empleada como marcador genético para buena calidad del
gluten, fue del 69,7%. Se han detectado 17 alelos nuevos en los cuatro loci principales,
con frecuencias en general bajas, siendo el Gli-B1 y Gli-B2 los que presentaron mayor
número de variantes nuevas. En general, estos alelos de los loci Gli-2 estaban presentes
en el genotipo principal de la variedad (el genotipo 1 de la Tabla 1 Cap. 1). Todas las
variedades locales españolas analizadas, incluida una de procedencia portuguesa,
presentaron alelos nuevos (Tabla1 Cap. 1). Este resultado, junto al gran número de
alelos nuevos encontrados en comparación con los detectados en otros estudios
(Metakovsky et al., 1994; Metakovsky y Branlard, 1998) indica que el germoplasma
español de trigo duro es muy singular, y que las nuevas variantes pueden ser específicas
de las variedades locales de la Península Ibérica. A la misma conclusión, con respecto al
germoplasma español de trigo blando, llegaron Ruiz et al. (2002b). Los alelos nuevos
encontrados amplían el catalogo de bloques alélicos de gliadinas de trigo duro
publicado en Kudryavstsev et al. (1996). Así mismo, se han observado grandes
diferencias en los alelos más frecuentes entre las variedades locales españolas
analizadas y las del germoplasma italiano estudiado por Kudryavtsev et al. (1996),
principalmente para los loci Gli-A1 y Gli-A2. Se sabe que las variedades locales poseen
un gran nivel de adaptación a las condiciones particulares del lugar de origen. Como los
genes de gliadinas no están sometidos a la selección directa de los mejoradores, estos
145
DISCUSIÓN GENERAL
alelos podrían poseer cierto valor adaptativo o por lo menos podrían servir como
marcadores de genes que influyen en la adaptación del trigo.
La mayoría de los genotipos de T. monococcum diferentes en gliadinas se
caracterizaron con seis SSRs del genomio A, puestos a punto en esta tesis. Con la
combinación de las gliadinas y de los SSR, se consiguió diferenciar 23 genotipos, ya
que dos genotipos que no se discriminaban con gliadinas se separaron con SSRs y
viceversa (Figuras 3 y 4 Cap. 2). Todos los genotipos principales, gt. 1, se
diferenciaron, tanto con gliadinas como con los SSRs. Los genotipos que no se
separaron con uno u otro marcador, eran genotipos poco frecuentes. Con los SSRs se
observó menor polimorfismo y una mayor relación entre las variedades que con las
gliadinas. En total, se identificaron 29 alelos con los seis SSRs, con una media de 4,8
alelos por locus. Los alelos de cada locus SSR variaron de forma regular en saltos, en
general, de 2 pares de bases, lo que indica que la variación genética durante la evolución
del trigo siguió un modelo de mutación por pasos. En algunos SSRs, se detectaron
saltos mayores entre alelos poco frecuentes. Posiblemente, el bajo número de entradas
analizadas no ha permitido que estén incluidos en la muestra todos los alelos. Tres loci
mostraron una distribución normal de frecuencias alélicas, y los otros tres bimodal.
Según Huang et al. (2002), parece que la selección natural juega un papel importante en
la creación de la variación alélica en los loci con distribuciones bimodales. Los alelos
con frecuencias más altas podrían ser seleccionados y conservados por razones
adaptativas. Aunque el número de alelos de los SSRs no se correlacionó con el número
de repeticiones del dinucleótido, los SSRs con mayor número de alelos correspondieron
al locus Xgwm570, que es un microsatélite compuesto con un número de repeticiones
bastante alto, y el Xgwm136, que es el que tiene el mayor número de repeticiones (Tabla
4 Cap. 2). Coincidiendo con Huang et al. (2002), tampoco se observó correlación entre
el número de alelos y los motivos de los microsatélites. Al igual que en gliadinas, el
locus más polimórfico, el Xgwm570, se localizó en el cromosoma 6A, lo que indica la
gran utilidad de los marcadores ubicados en este cromosoma para estudios de
variabilidad genética en T. monococcum.
En trigo duro, con los 24 SSRs se han discriminado 54 genotipos en la muestra
de 23 variedades locales y cultivares antiguos, siendo por tanto el marcador molecular
que identificó más genotipos (Tablas 2 y 3, Cap. 3). Los loci de SSRs más polimórficos
fueron el Xgwm136, localizado en el brazo corto del cromosoma 1A, en el que se
detectaron 22 alelos, y el Xgwm577 del brazo largo del cromosoma 7B, con 15 alelos
146
DISCUSIÓN GENERAL
(Tabla 5 Cap. 3). En T. monococcum, el Xgwm136 también fue uno de los más
polimórficos. El número medio de alelos por locus fue de 8,4; aunque el número
efectivo de alelos medio fue casi la mitad (4,6) (Tabla 5 Cap. 3). De los 203 alelos
detectados, 83 eran alelos raros con una frecuencia menor del 0,05%.
En esta tesis, las gliadinas mostraron correlaciones con el origen geográfico de
las variedades. En T. monococcum, se detectó una asociación entre las variantes alélicas
del locus Gli-A2m y la provincia de origen de las entradas, observándose una separación
entre las entradas del centro y las del sur de España (G2, G3 y G4 Fig. 3 Cap. 2). En
trigo duro, las gliadinas discriminaron claramente las variedades procedentes del sur de
España y sirvieron para confirmar relaciones de parentesco conocidas históricamente
(G3 Fig. 2 Cap. 1). Otros trabajos también han encontrado asociaciones entre la
variación alélica en gliadinas y el origen geográfico y filogenético de las variedades
(Melnikova et al. 2010a,b).
En el análisis de las variedades, tanto de escaña menor como de trigo duro, se
detectó una correlación entre las gliadinas y los SSRs, probablemente debido a que se
trataba de un material muy relacionado (Bohn et al., 1999), por ser todas ellas
variedades españolas. En T. monococcum, los caracteres agro-morfológicos mostraron
cierta relación con los SSRs, como en Hammer et al. (2000), y con los alelos del locus
Gli-A1m de gliadinas. También en trigo duro, se detectó una correlación significativa
entre el número de caracteres agro-morfológicos y de alelos de SSRs no coincidentes.
Según Crouch et al. (2000), se puede obtener una buena concordancia entre ambos
marcadores cuando se examinan pocos genotipos. Aunque se vio que las diferencias
detectadas con los caracteres agro-morfológicos no implicaban necesariamente
diferencias en los datos moleculares y viceversa.
El conocimiento sobre la distribución de los alelos, en especial de los poco
frecuentes, es importante no solo para estimar la cantidad de variabilidad genética, sino
también para la creación de colecciones nucleares que deben contener el mayor número
posible de alelos diferentes. La determinación de la composición alélica permite una
identificación genotípica mucho más precisa, y una determinación más exacta de la
diversidad intra e inter-varietal. Además, proporciona a los bancos de germoplasma la
posibilidad de registrar en bases de datos de manera fiable el genotipo de una variedad,
que de otro modo sería muy complicado. Este registro de genotipos puede ser muy útil
para subsanar errores en el Banco al identificar el genotipo correcto.
147
DISCUSIÓN GENERAL
3.Análisis de la variabilidad genética intra- e inter-varietal con proteínas del
endospermo y SSRs en la colección de T. monococcum L. (Cap. 2) y en la de
trigo duro (Cap. 1 y 3)
Los estudios genéticos con los marcadores moleculares han revelado que la
colección española de T. monococcum L. y la muestra estudiada de T. turgidum. L,
mantenidas en el CRF, tienen una estructura genética con más del 90% de la diversidad
total debida a la diferenciación entre las variedades, y una baja variabilidad dentro de
las accesiones. La diversidad genética total observada con los 6 loci de gliadinas en la
colección de trigo duro fue de Ht= 0,68 con más del 95% de la diversidad debida a la
diferenciación entre las variedades (Tabla 3 Cap. 1). La diversidad encontrada en la
colección de T. monococcum fue mayor, Ht= 0,81 (Tabla 3 Cap. 2), con una
diferenciación entre las variedades del 91% y una diferenciación intra-varietal mayor
que en el trigo duro (0,08 vs 0,03). Aunque hay que tener en cuenta que la muestra
analizada no es representativa de la diversidad de la colección de trigo duro, sino que
era una selección de variedades que formaban parte de casos de duplicados potenciales,
de la que se han analizado los parámetros de diversidad genética, obviando las
redundancias. No obstante, comparando estos resultados con los obtenidos en
germoplasma de trigo duro de otros países, puede verse que la colección de variedades
españolas estudiada presentó mayor diversidad genética que la observada en un grupo
de 72 cultivares modernos italianos (Ht= 0,53) (Kudryavtsev et al., 1996) y la de una
colección mundial de trigo duro (Ht= 0,55) (Melnikova et al., 2010b), y fue similar a la
diversidad encontrada en variedades locales búlgaras (Ht=0,70) (Melnikova et al
2010a). La diversidad genética de la colección de T.monococcum también fue mayor
que la observada (Ht=0,56) para la misma especie en Álvarez et al. (2006). En general,
en las dos especies, todos los loci de gliadinas presentaron una gran diversidad genética,
baja variabilidad intra-varietal y una gran diferenciación entre variedades. Por otro lado,
el índice de contenido polimórfico (PIC) calculado con los 24 SSRs varió en la
colección de trigo duro de 0,26 a 0,93, siendo el PIC medio de 0,73 (Tabla 4 Cap. 3),
observándose resultados semejantes entre las gliadinas y los SSRs. Sin embargo, en la
colección de escaña menor, el PIC varió de 0,09 a 0,84 con un PIC medio de 0,54. En
este caso, se vio que el poder de discriminación de las gliadinas fue mayor (Tablas 3 y 4
Cap. 2). Aunque el valor medio del PIC (0,80) para los SSRs de los cromosomas 1A y
6A, donde se localizan los loci de gliadinas, fue similar a la Ht de gliadinas.
148
DISCUSIÓN GENERAL
El flujo de genes entre poblaciones debido a la polinización cruzada durante la
regeneración de las muestras, o los errores metodológicos en el manejo de semillas,
pueden provocar contaminaciones indeseadas en las entradas. Por ello, el seguimiento y
control de la variabilidad intra-accesión es una cuestión esencial para la gestión de las
colecciones en los bancos de germoplasma. En la colección de T. monococcum, se
encontraron tres entradas heterogéneas con dos, tres y cuatro genotipos diferentes
(incluido el genotipo principal gt. 1) identificados con gliadinas y SSRs, y no detectados
con los caracteres agro-morfológicos. Según Metakovsky (1991a), un genotipo de trigo
se clasifica como biotipo cuando difiere del principal en no más de un locus de
gliadinas; en caso contrario se considera un fuera de tipo o mezcla. Por otro lado, se
espera que la distancia entre un biotipo y el gt. 1 de la misma accesión sea menor que la
mínima encontrada entre los genotipos de dos accesiones que se sabe que son distintas
(Ortiz et al., 1998). En esta tesis, se consideraron ambos criterios, alelos de gliadinas y
distancia con gt. 1 para diferenciar posibles biotipos de mezclas. La mayoría de los
genotipos no principales mostraron diferencias en los dos loci de gliadinas, en 3-4
SSRs, y distancias mayores con el gt. 1 de su accesión que con los genotipos de otras
variedades (Fig. 3 y 4 Cap. 2), demostrando que se trataban de mezclas indeseadas. En
un caso, los genotipos de la misma accesión (BGE 29109) mostraron pocas diferencias
en los alelos de gliadinas y SSRs (2 ó 3), agrupándose entre ellos y formando un grupo
genéticamente similar junto con genotipos de otras dos entradas. El análisis conjunto de
ambos marcadores indicó que ha habido una posible polinización cruzada entre las tres
accesiones, que de hecho se sembraron juntas durante la multiplicación, junto con una
diferenciación de la entrada durante la propia conservación en el Banco.
De las 51 variedades de trigo duro analizadas, 39 fueron homogéneas
presentando un único genotipo (gt. 1) con gliadinas. Tampoco se detectó variabilidad
intra-accesión con proteína total y con gluteninas HMW, excepto en dos casos en que
los genotipos diferían del gt. 1 en una banda de proteína total o en una subunidad de
glutenina HMW que tenía una movilidad relativa ligeramente menor (Tabla 1 Cap. 3).
En todos los casos menos en uno, el gt. 1 presentó una frecuencia mayor del 70%. De
acuerdo con los criterios anteriormente expuestos, para diferenciar biotipos de mezclas
(diferencias en gliadinas y distancia con el gt. 1), los resultados indicaron que las
mezclas (más de un locus de gliadinas diferente) se diferenciaban del gt. 1 en más de
tres SSRs (Tabla 3 Cap. 3). Este resultado concuerda también con el obtenido en T.
monococcum, en el que diferencias de más de 3 SSRs indicaban genotipos fuera de tipo.
149
DISCUSIÓN GENERAL
Los genotipos de gliadinas se compararon con el porcentaje de homología PH
(Sapirstein y Bushuk, 1985), el índice de identidad genética I (Nei, 1972) y la distancia
de Rogers (1972) modificada por Wright (1978) (dRW). Mientras que el PH se basa en el
número de bandas de gliadinas comunes entre dos perfiles electroforéticos, el I
considera diferencias en las frecuencias alélicas, por lo que es necesario identificar los
bloques alélicos de gliadinas. Ambos índices mostraron una correlación significativa
entre ellos en este trabajo. Para el estudio con los SSRs, se analizó también el índice de
similitud de Jaccard (sj) y la distancia genética de Goldstein y Pollock (dGP). La dGP fue
desarrollada específicamente para los SSRs y asume que el modelo de mutación de los
microsatélites es por pasos. El sj se basa en las frecuencias de los alelos compartidos y
sigue el modelo de mutación de alelos infinitos, en el que se considera que cada
mutación da lugar siempre a un alelo nuevo. De acuerdo con las diferencias encontradas
en gliadinas y SSRs, se establecieron unos valores límite para cada parámetro de
diversidad analizado, con el fin de diferenciar los biotipos de las mezclas (Tabla 3 Cap.
3). En la Tabla 1, se muestran los valores obtenidos en este estudio, con los materiales y
marcadores empleados.
Tabla 1. Valores límite de los parámetros de diversidad de gliadinas y SSRs
establecidos para los biotipos y para las mezclas.
Gliadinas
comparación con gt. 1
nº loci
diferentes
I
PH
SSRs
comparación con gt. 1
dRW
nº loci
diferentes
sJ
dGP
1
≥ 0,83 ≥ 80
<0,35
≤3
≥ 0,78
<50,29
Mezcla > 1
<0,83 <80
≥ 0,35 y <
con otras
accesiones
>3
<0,78 y >
con otras
accesiones
≥ 50,29 y <
con otras
accesiones
Biotipo
De los posibles biotipos con gliadinas, solo cumplieron los límites de la Tabla 1
los genotipos idénticos en gliadinas, y que mostraron pocas diferencias en las
subunidades de gluteninas HMW y en proteína total. El resto de los posibles biotipos
para gliadinas no fueron confirmados con los otros marcadores, presentando diferencias
en proteína total, en gluteninas y en de 9 a 12 loci de SSR (sJ< 0,78 y dGP> 50,29). Sin
150
DISCUSIÓN GENERAL
embargo, según el sJ, la mayor similitud fue con el gt. 1 de su variedad. Esto puede
deberse a que estos genotipos se han ido diferenciando durante su conservación en el
Banco, pero manteniendo una similitud genética con el material inicial, por lo que no se
trataría de mezclas externas de otras accesiones, sino que originalmente procederían de
la misma accesión.
Para conservar las entradas con la constitución genética lo más parecida posible a
la original, las mezclas observadas deben ser eliminadas. En algunos casos, las mezclas
detectadas eran genotipos heterocigotos para algún locus de los marcadores proteicos
utilizados (Tabla 1 Cap. 3) y de los SSRs (Tabla 4 Cap. 3). Es posible que durante la
multiplicación de las accesiones se hayan producido cruzamientos, por lo que deben
extremarse las precauciones y tomar medidas adecuadas de aislamiento o de alternancia
de especies. En la Figura 1, se muestra un caso de contaminación por cruzamiento,
detectado con proteína total. Se demuestra la utilidad de estos marcadores para revelar
contaminaciones con polen.
Figura 1. Perfil electroforético de proteína total de un genotipo heterocigoto de la
variedad Semental. Las flechas rojas señalan las subunidades de proteínas del otro
parental del cruzamiento.
151
DISCUSIÓN GENERAL
Los resultados obtenidos demostraron que el análisis combinado de gliadinas y
SSRs es una excelente herramienta para distinguir biotipos auténticos de genotipos muy
relacionados y de contaminaciones. La caracterización agro-morfológica fue menos
discriminante y no permitió distinguir los diferentes genotipos de las variedades
heterogéneas.
4.Uso de las proteínas del endospermo y de los SSRs para detectar y confirmar
duplicados potenciales en trigo duro (Cap. 3)
La muestra de trigo duro de 50 variedades, que formaban 23 casos de duplicados
potenciales, se empleó para determinar la utilidad de las proteínas del endospermo y de
los SSRs para detectar y confirmar duplicados. En todos los casos, las accesiones de un
duplicado tenían el mismo nombre local, y en el caso de las variedades locales el mismo
nombre, origen histórico y geográfico. Así mismo, se disponía, para todas las
accesiones, de información de un trabajo previo (Ruiz y Aguiriano, 2004) para 30
caracteres agro-morfológicos utilizados en la identificación de variedades y
recomendados por IBPGR (1985) (Tabla 6 Cap. 3). Ruiz y Aguiriano (2004) analizaron
277 accesiones de 106 duplicados comparando los perfiles de gliadinas y la
caracterización agro-morfológica. En algunos casos, los datos de gliadinas y agromorfológicos eran coincidentes (Figura 2); sin embargo, en otros, las accesiones eran
similares en gliadinas pero se diferenciaban en varios caracteres agro-morfológicos, por
lo que se necesitaba más información para tomar alguna decisión.
152
DISCUSIÓN GENERAL
Figura 2. Siembra de los duplicados potenciales en el CRF-INIA.
En esta tesis todos los duplicados potenciales se analizaron con 8 loci de
proteínas, 6 de gliadinas y dos de gluteninas HMW (Tabla 1 Cap. 3) y 24 SSRs (Tabla 4
Cap. 3). Los SSRs se seleccionaron por su distribución en los distintos cromosomas del
trigo. Este número de marcadores es comparable al que utilizaron Virk et al. (1995),
quienes demostraron que 26 marcadores polimórficos fueron suficientes para detectar,
con una probabilidad del 99%, por lo menos una diferencia entre dos variedades de
arroz sospechosas de ser duplicadas. Por otro lado, la información del análisis de la
proteína total permitió la cobertura de un área más amplia del genoma, ya que las
proteínas del endospermo están controladas por los 7 grupos de cromosomas (Fra-Mon
et al., 1984; Singh y Skerritt, 2001).
La similitud genética entre los duplicados se analizó siguiendo los mismos
criterios que para el análisis de las entradas heterogéneas; no más de un locus diferente
de proteínas y distancias menores que la mínima encontrada entre dos accesiones
distintas. Esta similitud se cumplía para diferencias de 3 o menos SSRs. Por tanto, los
valores de corte para los parámetros genéticos fueron los mismos que los fijados para
los biotipos (Tabla 1).
153
DISCUSIÓN GENERAL
Veintiuno de los 23 duplicados potenciales analizados presentaron un único
genotipo (gt. 1) con todos los marcadores proteicos (Tabla 1 Cap. 3) y se diferenciaron
en menos de 3 caracteres agro-morfológicos (Figura 3). Estos caracteres agromorfológicos eran, en general, menos discriminantes (hábito de la hoja bandera, hábito
de la espiga madura y longitud de gluma) o afectados por las condiciones ambientales
(pigmentación de las anteras) (Ruiz y Aguiriano, 2004). Dieciocho de estos 21
duplicados potenciales mostraron pocas diferencias con los SSRs (de 0 a 3 alelos
distintos). Seis de ellos fueron duplicados idénticos, sin que se haya apreciado ninguna
diferencia con ninguno de los marcadores moleculares empleados. No es común
encontrar duplicados exactos en colecciones conservadas ex situ, ni siquiera en especies
autógamas como el trigo.
Figura 3. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Blanquillón de Boñar.
Un caso de duplicado potencial confirmado.
En tres casos, se encontraron discrepancias en la variación detectada con
proteínas y con los SSRs. Las accesiones de los duplicados de Alaga, Berberisco y
Forment, que presentaron el mismo genotipo con todas las proteínas, se diferenciaron en
154
DISCUSIÓN GENERAL
más de tres alelos de SSRs; sin embargo, estas accesiones presentaron menores
distancias entre ellas que con otras entradas, lo que confirma que se trataba de
materiales genéticamente relacionados. Las dos accesiones de Alaga (Fig. 4) parecen ser
agro-tipos con diferencias en días a espigado y color del grano. Es posible, que en el
pasado fueran intencionadamente separadas de la muestra original, debido a que las
diferencias eran apreciables a simple vista, dando lugar a dos accesiones diferentes en
esos caracteres. Tranquilli et al. (2000) también encontraron una variedad local de trigo
con considerables diferencias agro-morfológicas, e iguales en gluteninas HMW y en
isoenzimas. La diversidad agro-morfológica la atribuyeron a una selección artificial
llevada a cabo en la zona de origen.
5.
Figura 4. Espigas y perfil electroforético de dos accesiones de Alaga, idénticas en
proteínas y diferentes en el color del grano y en días a espigado. Un caso de duplicado
potencial en el que los genotipos están estrechamente relacionados.
Los dos casos de duplicados en los que las accesiones no presentaron el mismo
genotipo con proteínas, Mindum (Figura 5) y la accesión 3 de Semental, difirieron en 19
y 16 SSRs, respectivamente (Tabla 2 Cap. 3). Las accesiones de Mindum se
155
DISCUSIÓN GENERAL
diferenciaron solo en el color de la barba y la altura de la planta, por lo que los
marcadores moleculares fueron útiles para confirmar que las accesiones son muy
diferentes.
Figura 5. Perfil electroforético de 10 granos de las dos accesiones de Mindum. Un caso
de duplicado potencial no confirmado, con diferente genotipo de gliadinas.
En unos pocos casos, se detectaron discrepancias entre los índices genéticos
utilizados con los SSRs, sJ y dGP, en la verificación de los duplicados. En algunos casos
fue debido a la incidencia de alelos nulos que incrementaba el valor de d GP, como
ocurrió con tres duplicados que se verificaron con el sj y no con la dGP (Hymera,
Fanfarrón y la accesión 2 de Rubio de Badajoz) (Tabla 2 Cap. 3). Por el contrario, dos
duplicados potenciales, Berberisco y Forment, que se diferenciaban en 4 alelos de SSRs,
se confirmaron solo con la dGP. En esta ocasión, se debió a que los alelos no
compartidos tenían un tamaño semejante, lo que indicó que a pesar de diferenciarse con
el sj, sí que había una relación estrecha entre los genotipos comparados. En el resto de
los casos, se detectó una gran concordancia entre ambos índices. El sJ al seguir un
modelo de alelos infinitos considera que no existe homoplasia. La homoplasia en los
156
DISCUSIÓN GENERAL
SSRs daría lugar a alelos con el mismo tamaño que podrían considerarse iguales cuando
en realidad existen diferencias en la secuencia de nucleótidos. Esto provocaría una
sobrestimación de la similitud genética. Esta sobrestimación no se ha reflejado en los
resultados de esta tesis, ya que se observó una correlación significativa entre el sJ y la
dGP. Posiblemente, el efecto de la homoplasia se minimizó debido al uso de SSRs
dinucleótidos y con motivos de repetición compuestos como sugirieron Maccaferri et al.
(2003). En los casos en que se produjeron discrepancias los dos índices aportaron
información complementaria. La dGP mostró ser muy útil, (siempre que no se incluyeran
alelos nulos en el análisis), para detectar relaciones genéticas entre accesiones en
aquellos duplicados que se han ido diferenciando con el tiempo, pero que provienen de
un material común.
En general, se ha encontrado gran concordancia entre las proteínas, los
caracteres agro-morfológicos y los SSRs, especialmente cuando las diferencias entre los
genotipos eran grandes. Los tres tipos de proteínas empleadas han sido una excelente
herramienta para detectar duplicados. El análisis de proteínas tiene la ventaja de que los
requerimientos, tanto económicos como humanos, son menores. Sin embargo, cuando la
información de las proteínas y los caracteres agro-morfológicos no fue suficiente para
resolver la duplicación, los SSRs aportaron información muy útil, indicando que es
aconsejable evaluar el germoplasma con diferentes tipos de marcadores genéticos.
Por otro lado, la identificación de alelos tiene la ventaja de poder comparar
genotipos y detectar más fácilmente errores, como ocurrió con una accesión de
Semental que se correspondía con la variedad Recio de Baza. Es frecuente que en los
Bancos, sobre todo si se manejan muchas variedades, durante la manipulación de las
muestras se produzcan errores y se pierda la correspondencia entre los datos de
pasaporte y el material conservado en las cámaras. La detección y resolución de estos
errores es muy importante para la racionalización de las colecciones y la utilización de
las mismas.
157
DISCUSIÓN GENERAL
5.Caracterización genética con proteínas del endospermo con influencia en la
calidad (gliadinas y gluteninas) de una submuestra de variedades locales de
la colección de trigo duro del CRF-INIA (Cap. 4)
Se ha llevado a cabo la caracterización de las proteínas del endospermo con
influencia en la calidad (gliadinas de los loci Gli-1 y gluteninas HMW y B-LMW) en
una submuestra representativa de la colección de trigo duro del CRF-INIA compuesta
por 52 variedades locales de todas las regiones españolas donde el trigo duro se ha
cultivado tradicionalmente (Tabla 1 Cap. 4). Para la selección de la submuestra, se
establecieron distintas zonas agro-ecológicas en función de los datos geográficos,
climáticos y de rendimiento del cultivo desde 1920, siguiendo la metodología de Igartua
et al. (1998). El número de entradas seleccionadas originarias de cada zona agroecológica fue proporcional a la superficie sembrada de trigo antes de 1960. Para la
selección de las entradas se tuvo en cuenta la información de caracterización, de forma
que se incluyese la mayor variabilidad agro-morfológica posible. La diversidad genética
obtenida con las proteínas (Ht=0,72) fue mayor en nuestra submuestra que la encontrada
en un grupo de cultivares portugueses (0,36) (Igrejas et al., 1999) o en variedades
locales de la cuenca mediterránea (0,62) (Moragues et al., 2006), y similar a la obtenida
en variedades locales españolas de trigo blando (Ht=0,81) (Ruiz et al., 2002), lo que
demuestra la gran riqueza del germoplasma español de trigo. La alta diversidad
encontrada con proteínas se confirmó con los SSRs, obteniéndose un valor de 0,80, que
fue mucho mayor que el encontrado en colecciones de trigo duro de otros países como
Italia, Omán, Siria y Etiopía, que mostraron una diversidad genética media con valores
entre 0,55 y 0,68 (Eujayl et al., 2002; Macaferri et al., 2003; Teklu et al., 2006; Alkhanjari et al., 2007; Achtar et al., 2010). Estos resultandos indicaron que la submuestra
de variedades locales españolas es muy diversa y que puede ser un material muy útil
sobre el que estudiar la influencia de las prolaminas en la calidad.
El número de alelos detectados en los loci Glu-1, Glu-3 y Gli-1 fue también
mayor que los encontrados en otras colecciones; una colección mundial y otra de
germoplasma mediterráneo (Kaan et al., 1993; Raciti et al., 2003); en variedades locales
turcas, portuguesas y de la Cuenca Mediterránea (Truchetta et al., 1995; Igrejas et al.,
1999; Moragues et al., 2006); y en cultivares portugueses y españoles (Brites et al.,
1996; Nieto-Taladriz et al., 1997). Es importante destacar el número de alelos nuevos
encontrados en el material analizado, ya que una gran parte de la variabilidad se debió a
la presencia de estos alelos en casi todos los loci. La identificación de alelos nuevos era
158
DISCUSIÓN GENERAL
previsible, ya que en trabajos anteriores con variedades locales españolas de trigo duro
se detectaron alelos de proteínas no descritos hasta el momento (Carrillo et al., 1990;
Vázquez et al., 1996; Martínez et al., 2004). Para las gluteninas HMW, se detectó un
alelo nuevo en el Glu-B1 (Figura 1 Cap. 4), y el alelo Glu-A1f (Tabla 5 Cap. 4), descrito
en trigo blando (Igrejas et al., 1997), pero que hasta ahora no se había hallado en trigo
duro. Según Brites et al. (2000), este alelo confiere mejor calidad que el más frecuente
de este locus, el alelo nulo c. Para las gluteninas LMW y gliadinas, se encontraron
alelos nuevos en todos los loci analizados, excepto en el Glu-B2. En total, se han
identificado 29 alelos nuevos: 21 de gluteninas LMW y 8 de gliadinas (Tablas 2 y 3,
Figuras 1 y 2, Cap. 4). Algunos de los alelos nuevos codificaron 10 subunidades de
gluteninas LMW no descritas anteriormente (Tabla 3 Cap. 4). La asignación de los loci
Glu-A3 o Glu-B3 a estas subunidades se realizó comprobando que su movilidad
electroforética estuviese en el rango de variación de las subunidades de ese locus, su
ligamiento con los alelos de gliadinas Gli-A1 o Gli-B1, respectivamente, y su
alternancia con otras subunidades codificadas en el mismo locus. De especial
importancia fue la identificación de tres subunidades nuevas codificadas por el locus
Glu-A3. Hasta el momento solo se habían identificado seis subunidades (Nieto-Taladriz
et al., 1997; Lerner et al., 2004), por lo que las identificadas en esta tesis incrementarían
considerablemente la variabilidad de este locus. Los alelos nuevos de gliadinas GliA1new-2 y Gli-B1new-1 se identificaron también en la muestra de los 23 casos de
duplicados (líneas 4 y 9 Figura 1 Cap.1). Por otro lado, todos los alelos nuevos del GliB1 codificaron subunidades de gliadinas diferentes de las más comunes, la γ-42 y la γ45 (Figura 2 Cap. 4).
Se han identificado un gran número de patrones de gluteninas LMW (28
patrones), de los que 25 no se habían descrito anteriormente (Tabla 4 Cap.4). La
mayoría están formados por alelos nuevos de los loci Glu-3; aunque también se han
encontrado 7 nuevas combinaciones de alelos anteriores. En otros trabajos, se ha
obtenido un número menor de patrones: 11 en Turchetta et al. (1995) y 18 en Moragues
et al. (2006). También se encontró mayor variedad de patrones que en un grupo de
cultivares, sembrados en España, analizados por Nieto-Taladriz et al. (1997). El patrón
más común en este grupo de cultivares y el nuestro fue el LMW-2; aunque la frecuencia
fue mucho mayor en los cultivares (40% vs 13%). En esta tesis, se vio que el modelo
LMW-2 era típico de la convariedad durum, lo cual concuerda con la alta frecuencia de
este patrón en el grupo de cultivares. Por otro lado, en las variedades locales se
159
DISCUSIÓN GENERAL
encontraron 5 variantes diferentes para el modelo LMW-2*, mientras que en la
colección de los cultivares solo se identificó uno.
Comparando las frecuencias de los alelos asociados con la calidad con las de
otras colecciones, se vio que el el alelo c (subunidad nula) del locus Glu-A1, fue el más
frecuente en los trabajos Brites et al. (1996), Igrejas et al. (1999), Raciti et al. (2003) y
Moragues et al. (2006), mientras que en nuestra submuestra los alelos a, b, y c
presentaron frecuencias similares, probablemente debido a la inclusión de la
convariedad turgidum (Tabla 2 Cap. 4). Varios estudios (Ruiz y Carrillo, 1995;
Turchetta et al., 1995; Brites y Carrillo, 2001) han mostrado una mejor calidad con la
presencia de alguna subunidad codificada por este locus. En el Glu-B1, los alelos más
frecuentes fueron d (6 +8) y e (20x+20y), igual que en Brites et al. (1996), Igrejas et al.
(1999) y Raciti et al. (2003). En el Glu-A3, los alelos a y e fueron los más frecuentes,
mientras que el b y el h fueron más comunes en el germoplasma de otros países
mediterráneos (Igrejas et al., 1999; Moragues et al., 2006). Al igual que en otras
colecciones, el alelo Glu-B3a fue el más común (Igrejas et al., 1999; Moragues et al.,
2006.). Este alelo, relacionado con buena calidad (Ruiz y Carrillo, 1995; Brites y
Carrillo, 2001; Martínez et al., 2005), fue muy frecuente en la convar. durum. Respecto
a los alelos de gliadinas del Gli-B1, se vio que el c (γ-45) y el new-1 (γ-44) estaban
ampliamente distribuidos en el germoplasma español, mientras que el a (γ-42) y el c (γ45) eran muy comunes en las variedades tradicionales de Portugal (Brites et al., 1996).
Varios estudios han demostrado que la γ-45 y γ-44 se asocian con mejor calidad que la
γ-42 (Carrillo et al., 1990; Pogna et al., 1990; Ruiz y Carrillo, 1995).
Todos estos resultados indican que la submuestra de variedades locales
analizada podría ser una fuente muy importante de alelos valiosos para la calidad. Las
relaciones de ligamiento encontradas entre los loci Glu-3 y Gli-1 (Tabla 4 Cap.4) han
demostrado que las gliadinas pueden ser útiles para la mejora de la calidad; para
detectar nuevos alelos de gluteninas LMW, no ligados a las subunidades más comunes
γ-45 o γ-51, y descartar los materiales que presenten las subunidades γ-42 o γ-40, por
su relación con una calidad peor.
Se han detectado relaciones entre la composición en prolaminas y la
clasificación botánica y geográfica de las variedades (Tabla 2 Cap. 4). Las diferencias
entre las convariedades turgidum y durum coinciden a menudo con las existentes entre
las variedades de las zonas norte y sur, respectivamente. Este resultado concuerda con
que la convar. turgidum, más resistente a las bajas temperaturas, se ha cultivado
160
DISCUSIÓN GENERAL
tradicionalmente en el norte, mientras que la convar. durum, más resistente a la sequía,
se ha cultivado en el sur (Gadea, 1954). En consecuencia, el 77% de las variedades del
norte pertenecían a la convar. turgidum, y el 83% de las variedades del sur eran de la
convar. durum. Ambas convariedades difieren en algunos caracteres agronómicos, como
el hábito de crecimiento y la precocidad, y otros relacionados con la morfología de la
espiga y el grano. La convariedad que más se cultiva es la durum, y se asocia con una
mejor calidad. Las diferencias más importantes en prolaminas entre ambas
convariedades fueron las de los loci Glu-A1, Glu-B1, Gli-B1 y Glu-B3. Los alelos GluA1c y Glu-B1e solo estuvieron presentes en la convar. durum, mientras que el Glu-A1b
fue más frecuente en la convar. turgidum. El genotipo Glu-B3new-1 (LMW 2*) - GliB1new-1 (γ-44) (Figuras 1 y 2 Cap. 4) fue muy común en la convar. turgidum y la zona
norte, mientras que el Glu-B3a (LMW-2) - Gli-B1c (γ-45) fue más frecuente en la
convar. durum y el sur. Kudryavtsev et al. (1996) señalaron que el bloque Gli-B1new-1
de gliadinas, también detectado en el cultivar italiano Lambro, proviene, probablemente,
del Triticum turgidum L. ssp. dicoccoides (Körn. Ex Asch. Graebn et.) Thell o del
Triticum carthlicum (Nevski) Mackey. De acuerdo con ello, la convar. turgidum podría
estar más relacionada con estas especies que la convar. durum. Además, en la convar.
turgidum y en el norte se observó mayor variabilidad que en la convar. durum y en el
sur, principalmente en el Glu-B1 y Glu-B3, lo que indica que la convar. turgidum puede
ser una fuente valiosa de nuevos alelos de gluteninas.
6.Influencia de las variantes alélicas de prolaminas, del año y del abonado
nitrogenado en la calidad de una submuestra de variedades locales de la
colección de trigo duro del CRF-INIA (Cap. 5)
La evaluación del germoplasma de trigo duro para calidad y rendimiento a
bajas dosis de abonado nitrogenado, es importante para identificar genotipos
adaptados a niveles reducidos de nitrógeno, que mantengan rendimientos y calidad
adecuados. La calidad en trigo duro depende, principalmente, del contenido de proteína
y la fuerza del gluten (Khan y Bushuk, 1979; Dexter y Matsuo, 1977). El contenido en
proteína (P) tiene una gran dependencia medio-ambiental, y está correlacionado
negativamente con el rendimiento (Johnson et al., 1985; Mariano et al., 1994; Blanco et
al., 1996). La fuerza del gluten está muy relacionada con el genotipo de prolaminas de
la variedad (Carrillo et al., 1990; Kaan et al., 1993), y puede ser evaluada con el test de
161
DISCUSIÓN GENERAL
sedimentación SDSS. La submuestra de 50 variedades locales, representativa de la
colección de trigo duro del CRF (Tabla 1 Cap. 4), se evaluó para calidad (P y SDSS) en
cuatro ensayos; en dos años diferentes, para estudiar la influencia del año; y con dos
dosis (alta y baja) de abonado nitrogenado, para estudiar la influencia del nitrógeno
(Figura 6). Antes de aplicar las dosis de nitrógeno, se realizó un análisis del suelo de las
parcelas de experimentación (Figura 7). Estos análisis confirmaron el bajo contenido de
materia orgánica (< 1%) del terreno. En los dos ensayos de abonado se evaluó también,
en una investigación previa (Ruiz et al., 2008), el rendimiento de cada variedad y la
influencia del abonado en el mismo. Como resultado de esta investigación, las
variedades fueron clasificadas en tres grupos; las que eran más productivas a dosis bajas
de nitrógeno que a dosis altas (variedad N-bajo), las que rindieron más con dosis altas
(variedad N-alto), y las que su rendimiento era similar con ambos niveles de nitrógeno
(variedad N- indiferente).
Figura 6. Ensayo de bajo abonado en el CRF-INIA
162
DISCUSIÓN GENERAL
Figura 7. Toma de muestra para los análisis de suelo.
El análisis de varianza mostró que no existió interacción significativa entre la
variedad y el año (V x A) o entre la variedad y el abonado nitrogenado (V x N) en
ninguno de los dos parámetros de calidad evaluados (Tabla 1 Cap. 5), lo que indicó que
el año y el nitrógeno afectaron a todas las variedades por igual. Esta estabilidad es muy
deseable cuando se selecciona material para ser cultivado en diversos ambientes. Ames
et al. (2003) obtuvieron los mismos resultados para el test SDSS; aunque encontraron
una interacción significativa V x N para la P. Por el contrario, Lerner et al. (2006)
detectaron una interacción no significativa entre V x N para la P, y significativa entre V
x A, tanto para la P como para el SDSS. Por otro lado, Boggini et al. (1997) encontraron
una interacción genotipo-ambiente para ambos parámetros de calidad. El amplio rango
de variación encontrado para la P y el SDSS (Tabla 1 Cap. 5) concuerda con la alta
variabilidad de la submuestra analizada, como han demostrado los análisis con gliadinas
y SSRs. Estos resultados indican que las variedades locales analizadas además de incluir
una alta variabilidad geográfica y agro-morfológica (Tabla 1 Cap. 4), incluyen también
una gran variabilidad para otro tipo de caracteres.
Aunque la P se vio significativamente afectada por los diferentes genotipos de
las variedades, el efecto del ambiente, especialmente del nitrógeno, fue mayor (Tabla 1
Cap. 5). Un resultado similar obtuvieron Boggini et al. (1997), Abad et al. (2004) y
Lerner et al. (2006). De hecho, el 92% de las variedades analizadas en esta tesis
presentaron valores mayores de P con alto que con bajo abonado nitrogenado, lo que
163
DISCUSIÓN GENERAL
concuerda con los resultados obtenidos por Ames et al. (2003) y Abad et al. (2004). No
obstante, 14 variedades tuvieron valores de P >14% en bajo abonado (Tabla 4 Cap. 5),
lo que se considera un “buen” valor para la calidad del trigo duro (Matveef, 1966).
La variedad tuvo un gran efecto en el SDSS en ambos años y dosis de nitrógeno,
mientras que el año y el abonado no influyeron (Tabla 1 Cap. 5). Lerner et al. (2006)
encontraron efectos significativos del año y de la fertilización, pero la variedad también
fue el factor que más afectó al SDSS. Abad et al. (2004) observaron que el efecto del
abonado variaba con la localidad y el año de cultivo. El rango de variación del SDSS de
las variedades locales fue de 20 mm a 70-80 mm (Tabla 4 Cap. 5). Los testigos,
Yavaros y Don Pedro, mostraron valores de 37 y 43 mm, respectivamente, lo que
concuerda con la alta fuerza del gluten de estos cultivares. En bajo abonado, 22
variedades presentaron valores de SDSS mayores que Don Pedro (>43 mm), y 10
variedades tuvieron valores mayores de 50 mm. Estos resultados demuestran que las
variedades locales pueden proporcionar una fuente de variación importante para la
fuerza del gluten. En tres de los cuatro ensayos, no se detectaron correlaciones entre los
dos parámetros de calidad evaluados. En cambio, se encontraron correlaciones
significativas entre los valores de P de los cuatro experimentos (en los dos años y las
dos dosis de abonado), al igual que entre los valores del SDSS. Estos resultados
indicaron que, a pesar de los factores ambientales del año y del abonado nitrogenado,
los dos parámetros estaban controlados genéticamente. Las diferencias entre variedades
para la P no mostraron relación con las encontradas entre las variedades para el SDSS,
indicando que los loci que controlan ambos factores son diferentes, y que el aumento
del contenido en proteína no influyó significativamente sobre la fuerza del gluten. Se
observó una correlación negativa entre el rendimiento, estimado en Ruiz et al. (2008), y
la P a altos niveles de N, pero solo en las variedades clasificadas como N-alto (mayor
rendimiento con alto N). Sin embargo, no se observó correlación entre el rendimiento y
la P para las variedades adaptadas a dosis bajas de abonado (N-bajo y N-indiferente), lo
que permite la selección simultánea de variedades productivas, con alto contenido en
proteína y buena calidad.
Respecto a la influencia de los alelos de prolaminas en la calidad, para el
contenido en proteína se observaron pocas diferencias significativas entre los alelos de
prolaminas. Se obtuvo una influencia negativa de los alelos Glu-A1b, Glu-A3e, Gli-A1e
y Gli-B1new-6, y un efecto positivo del Glu-A1a y c, Glu-A3new-1, Gli-A1new-3 y GliB1b. Sin embargo, Kaan et al. (1993) obtuvieron un efecto negativo del Glu-A1c y no
164
DISCUSIÓN GENERAL
encontraron efecto significativo de los alelos a y b. Estos autores, como en esta tesis,
también encontraron diferencias no significativas entre los alelos Glu-B1b, d, e y f.
La clasificación de los alelos de prolaminas en función los resultados del test
SDSS fue similar en los cuatro experimentos (Tabla 3 Cap. 5). No hay muchos estudios
sobre la influencia de los alelos a (HMW-1) y b (HMW-2*) del Glu-A1 en la calidad,
debido a que la mayoría de los trigos presentan el alelo c (nulo) (Figura 1 Cap. 4). En
este trabajo, el alelo b mostró una influencia negativa, mientras que el a proporcionó
mejores valores de SDSS (Tabla 3 Cap. 5). Esto pudo ser debido a que el alelo b
apareció junto los alelos de gliadinas Gli-B1new-1 o new-6, y el de gluteninas LMW
Glu-B3new-1, que mostraron peor calidad que otros. Por el contrario, el Glu-A1a se
mostró frecuentemente unido al Gli-B1c (gliadina γ-45) y al Glu-B3a, ambos asociados
con buena calidad (Tabla 5 Cap. 4 y Tabla 3 Cap. 5). Estos resultados confirmaron los
obtenidos por Kaan et al. (1993), quienes encontraron una influencia positiva del GluA1a, y una relación entre este alelo y la presencia de la gliadina γ-45. Por otro lado,
Brites y Carrillo (2001) no obtuvieron diferencias significativas entre los alelos b y c,
mientras que Raciti et al. (2003) observaron que el b confería mejor calidad del gluten
que el c. En esta tesis, parece que la combinación de alelos con efectos negativos para la
calidad del locus Glu-B3 fue demasiado perjudicial para obtener una compensación del
posible efecto positivo del Glu-A1b. Se sabe que el locus Glu-A1 es genéticamente
independiente del Glu-B3, sin embargo la asociación de alelos encontrada supone un
desequilibrio del ligamiento que ha podido mantenerse por procesos de selección o por
conferir ciertas ventajas adaptativas.
Respecto al locus Glu-B1, se observó una contribución positiva de los alelos
new-1, d (6+8) y e (20x+20y), y negativa del a (7) (Tabla 3 Cap. 5, Figura 1 Cap. 4).
Aunque solo se analizaron dos variedades con el alelo b (7+8), éste se relacionó con los
valores más altos del SDSS, coincidiendo con los resultados de Boggini et al. (1997) y
Lerner et al. (2006). El efecto positivo de los alelos d y b en la calidad del gluten fue
observado también por Turchetta et al. (1995), Raciti et al. (2003) y Martínez et al.
(2005). Sin embargo, muchos estudios han demostrado efectos negativos del alelo e en
la calidad (Ruiz y Carrillo, 1995; Turchetta et al., 1995; Brites y Carrillo, 2001); aunque
Raciti et al. (2003), Vázquez et al. (1996) y Ciaffi et al. (1991) encontraron que el alelo
e confería una calidad similar que el d. No obstante, las variedades analizadas en este
trabajo que presentaban el alelo e, frecuentemente, tenían el alelo Glu-B3a, con clara
influencia positiva en la calidad (Tabla 3 Cap. 5).
165
DISCUSIÓN GENERAL
En cuanto a las subunidades de gluteninas LMW, el alelo Glu-B2a fue mejor que
el b en los dos niveles de nitrógeno (Tabla 3 Cap. 5). En otros trabajos,
no se
encontraron diferencias significativas entre ambos alelos (Ruiz y Carrillo, 1996; Brites
y Carrillo, 2001); aunque Martínez et al. (2005) obtuvieron un efecto positivo del a en
la prueba del mixógrafo. Los alelos de los loci Glu-A3 y Gli-A1, estrechamente ligados,
mostraron muy poca influencia en la fuerza del gluten (Tabla 3 Cap. 5). Los alelos GluA3new-1 y f presentaron los valores más altos del SDSS, mientras que el a, b y e
mostraron los más bajos. El alelo f se estudió solo en dos variedades, ambas con el alelo
Glu-B3a relacionado con alta fuerza del gluten. Existen muy pocos trabajos que hayan
estudiado la influencia de los alelos del locus Glu-A3 en la calidad. Ruiz y Carrillo
(1995), y Vázquez et al. (1996) no encontraron ninguna influencia del Glu-A3 en el
SDSS. Por el contrario, Carrillo et al. (2000) observaron que el alelo a, el más común en
los cultivares de trigo, fue superior al f, y ambos mejores que el b y el e. La superioridad
del alelo nuevo new-1 con respecto al alelo a (Tabla 3 Cap. 5), considerado como
bueno, puede suponer, si se confirma en un estudio posterior, un hallazgo de gran
interés. De acuerdo con estos resultados, se observó que el mejor alelo del Gli-A1, el g,
estaba ligado al Glu-A3new-1. En el Glu-B3, el alelo a fue claramente superior a los h,
new-1 y b. Los alelos a y b suelen estar presentes, respectivamente en los modelos
LMW-2 y LMW-1, asociados a buena y mala calidad del gluten, respectivamente
(Carrillo et al., 1990; Ciaffi et al., 1991). Es importante destacar los altos valores de
calidad asociados a los nuevos alelos new-6 (Figura 1 Cap. 4) y new-9, que aunque en
este trabajo no fueron probados estadísticamente, se confirmaron en los cuatro
experimentos (Tabla 3 Cap. 5).
Respecto a las gliadinas del Gli-B1, los resultados obtenidos se correspondieron
con los esperados, dado el estrecho ligamiento entre este locus y el Glu-B3. De hecho,
los alelos Gli-B1b y c (ambos alelos con la gliadina γ-45 y ligados al Glu-B3a) se
relacionaron con valores mayores del SDSS que el new-1 (γ-44 y ligado al Glu-B3b).
Estos resultados explican la mejor calidad, en general, de las variedades del sur de
España que las del norte (Tabla 2 Cap. 5), teniendo en cuenta que los alelos más
frecuentes en las variedades del sur fueron Gli-B1c y Glu-B3a.
Basándonos en estos resultados, junto con los obtenidos para el rendimiento en
Ruiz et al. (2008), se pre-seleccionaron cuatro variedades locales que poseían alto
rendimiento y buena calidad del gluten en condiciones de bajo abonado nitrogenado:
BGE012346, BGE013622, BGE017170 y BGE020948.
166
CONCLUSIONES
167
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
1. Las colecciones de T. monococcum L. y T. turgidum L. del CRF poseen una gran
diversidad genética, mayor que la observada en germoplasma de otros países y en
colecciones internacionales. Esta variabilidad ha sido detectada con marcadores
moleculares (proteínas y SSRs), y para parámetros de calidad en trigo duro. Es, por
tanto, fundamental la adecuada conservación de los materiales para su utilización,
ya que éstos solo se encuentran en conservación ex-situ. En ambas colecciones la
variabilidad fue mucho mayor entre variedades (> 90%) que intra-varietal.
2. Se han identificado gran cantidad de alelos nuevos en las variedades locales
españolas de trigo duro, tanto de gliadinas (22) como de gluteninas (21). Este
número ha sido mayor que el detectado en colecciones de otros países, lo que indica
que el germoplasma español de trigo duro es muy singular. De especial importancia,
por su relación con la calidad, son las 10 subunidades nuevas de gluteninas B-LMW
identificadas en esta tesis. Estas subunidades, junto con las nuevas combinaciones
de subunidades anteriormente descritas, han aumentado considerablemente la
variabilidad de los loci que las codifican. Este resultado demuestra que las
variedades locales españolas proporcionan una fuente de variación importante para
la mejora del trigo duro.
3. Las gliadinas y los SSRs han demostrado ser marcadores moleculares muy útiles
para estimar la variabilidad intra- e inter-varietal de las colecciones de
germoplasma. La identificación de alelos ha permitido una discriminación
genotípica y un análisis de la diversidad intra- e inter-varietal mucho más preciso.
Además, este análisis proporciona a los bancos de germoplasma la posibilidad de
registrar en las bases de datos de manera fiable el genotipo de una variedad, que de
otro modo sería muy complicado. Este registro de genotipos puede ser muy útil para
subsanar errores en el Banco al identificar el genotipo correcto.
4. La caracterización agro-morfológica ha sido menos discriminante y adecuada para
distinguir los genotipos diferentes de las variedades heterogéneas; aunque se ha
encontrado gran concordancia entre las proteínas, los caracteres agro-morfológicos y
los SSRs, especialmente cuando las diferencias entre los genotipos eran grandes.
169
CONCLUSIONES
5. Las proteínas y los SSRs han mostrado ser de gran utilidad en la racionalización de
las colecciones en los bancos de germoplasma; se ha demostrado su gran eficacia en
la identificación de alelos poco frecuentes, la eliminación de las redundancias, y la
detección de errores y mezclas, fases previas a la creación de las colecciones
nucleares. El análisis combinado de gliadinas y SSRs ha sido una excelente
herramienta para distinguir biotipos auténticos de genotipos muy relacionados.
6. Se han establecido unos valores límite para unos parámetros de diversidad de
gliadinas y de SSRs para discriminar mezclas de biotipos, en accesiones
heterogéneas, y para confirmar duplicados potenciales. Se ha confirmado que una
homología en el perfil de gliadinas superior al 80% demuestra que los materiales
están muy relacionados genéticamente. En esta tesis, esta similitud se ha asociado a
una diferenciación en menos de 3 SSRs entre los materiales comparados.
7. Se han encontrado asociaciones entre la variación alélica en prolaminas y el origen
geográfico y filogenético de las variedades de trigo duro y T. monococcum. Las
diferencias entre las convariedades durum y turgidum coincidieron, a menudo, con
las existentes entre las variedades de las zonas norte y sur. Los alelos de prolaminas
pueden poseer cierto valor adaptativo o por lo menos servir como marcadores de
genes que influyen en la adaptación del trigo.
8. La colección de trigo duro del CRF ha demostrado ser una fuente importante de
genotipos interesantes para la mejora de la calidad, ya que se han observado altos
valores del contenido en proteína y fuerza del gluten, incluso a bajas dosis de
abonado nitrogenado.
9. No se observó correlación entre el rendimiento y el contenido en proteína para las
variedades adaptadas a dosis bajas de abonado, lo que permitió la selección
simultánea de varias variedades productivas, con alto contenido en proteína y buena
calidad.
170
CONCLUSIONES
10. Se ha confirmado la superioridad del alelo Glu-B3a en la fuerza del gluten.
También, se han identificado alelos nuevos muy interesantes, como el Glu-A3new-1,
con valores superiores que los del mejor alelo encontrado hasta el momento para el
Glu-A3, y los alelos nuevos Glu-B3new-6 y new-9. Las gliadinas pueden ser muy
útiles para detectar nuevos alelos de gluteninas LMW, no ligados a las subunidades
más comunes., descartando directamente los materiales que presenten las
subunidades γ-42 o γ-40, por su relación con una calidad peor.
171
172
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