LAB 2A (2012) - FISIOLOGIA DEL SISTEMA ENDOCRINO
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PRACTICA 3 Fisiología del sistema endocrino Objetivos 1. Definir: hormonas, célula diana, retroacción negativa, metabolismo, tiroxina, hormona 2. 3. 4. 5. 6. 7. estimulante de la tiroides (TSH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hipotálamo, sistema porta hipotálamo-hipofisario, vena porta,. Dar ejemplos de cómo los bucles de retroacción negativa regulan la liberación hormonal. Explicar el papel de la tiroxina en el mantenimiento del metabolismo basal de un animal. Explicar los efectos de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) sobre el metabolismo basal de un animal. Comprender el papel del hipotálamo en la regulación de la producción de tiroxina y de TSH. Explicar por qué es importante la insulina y cómo puede utilizarse para tratar la diabetes. Entender como los alteraciones en los niveles de cortisol y ACTH están asociados a patologías del sistema endocrino El sistema endocrino regula el funcionamiento de cada célula, tejido y órgano del cuerpo. Actúa para mantener un ambiente corporal interno estable, a pesar de los cambios que se producen en el interior o en el exterior del organismo. Las células endocrinas tienen la capacidad de percibir y responder a esos cambios a través de la secreción de compuestos químicos específicos denominados hormonas. Las hormonas son transportadas por la sangre, generalmente unidas a proteínas plasmáticas específicas, y circulan por todo el organismo. Cuando el complejo hormona-proteína alcanza una célula diana (la célula a la cual se dirige un mensaje químico), la hormona se separa de la proteína y penetra en la célula para inducir una reacción específica. Las hormonas actúan de diferentes maneras, dependiendo de su estructura química. Por ejemplo, las hormonas polipeptídicas, compuestas por cadenas de aminoácidos, primero se acoplan a una proteína receptora de la membrana celular, iniciando una serie de reacciones en la membrana con el resultado de la penetración en la célula del monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). La entrada de este producto químico induce que la célula trabaje más y más rápidamente. Las hormonas esteroides y la tiroxina (una hormona secretada por la tiroides y que examinaremos con detalle más adelante) entran en la célula para unirse a un receptor citoplasmático. El complejo hormona-receptor penetra entonces en el núcleo celular para unirse a puntos específicos sobre el ADN. Cada unión produce un ARNm específico que se traslada entonces al citoplasma para ser traducido en una proteína específica. La mayor parte de la regulación de los niveles hormonales en el organismo se lleva a cabo mediante un mecanismo de retroalimentación negativa: si se necesita una hormona particular, se estimulará su producción; si hay suficiente cantidad de hormona, se inhibirá su producción. En muy pocos casos la producción hormonal está controlada por mecanismos de retroalimentación positiva. Uno de tales ejemplos es la producción de la hormona de la hipófisis posterior oxitocina. Esta hormona produce la contracción de la capa muscular del útero, el miometrio, durante el parto. La contracción del miometrio causa una liberación adicional de oxitocina para ayudar a la contracción, independientemente de la cantidad de hormonas ya presente. El estudio de los efectos de las hormonas sobre el organismo es difícil realizarlo en el laboratorio, ya que, a menudo, los experimentos pueden durar días, semanas o incluso meses, y son bastante caros. Además, puede ser necesario el sacrificio de animales, y algunas veces se precisan técnicas quirúrgicas complejas. Las simulaciones de PhysioEx que se utilizarán en este ejercicio permiten estudiar los efectos de determinadas hormonas sobre el organismo, usando animales «virtuales» en lugar de animales vivos. Serás capaz de llevar a cabo delicadas técnicas quirúrgicas pulsando un botón. También serás capaz de completar experimentos en una fracción del tiempo que utilizarías en un laboratorio real. Hormonas y metabolismo Metabolismo es un término amplio utilizado para designar todas las reacciones bioquímicas que tienen lugar en el organismo. Incluye el catabolismo, un proceso por el cual los materiales complejos se descomponen en sustancias más simples, generalmente con la ayuda de enzimas presentes en las células. El metabolismo también incluye el anabolismo, en el cual los materiales más pequeños, por la acción de enzimas, crean moléculas más grandes y complejas. Cuando se rompen los enlaces durante el catabolismo, la energía que estaba almacenada en ellos se libera para ser utilizada por las células. Cuando se forman moléculas más grandes, la energía es almacenada en los diferentes enlaces que se forman. Una parte de la energía liberada puede dirigirse hacia la formación de ATP, el material rico en energía utilizado por el organismo para su funcionamiento. Sin embargo, no toda la energía liberada sigue este camino. Una parte de ella se emite en forma de calor corporal. Los humanos somos animales homeotermos, lo que significa que tenemos una temperatura corporal fija. El mantenimiento de esta temperatura es muy importante para sostener las vías metabólicas que existen en el organismo. La hormona más importante en el mantenimiento del metabolismo y la temperatura corporal es la tiroxina. También conocida como tetrayodotironina, o T4, la tiroxina es secretada por la glándula tiroides, localizada en el cuello. Sin embargo, la producción de tiroxina realmente está controlada por la hipófisis, que segrega la hormona estimulante de la tiroides (TSH). TSH es transportada hasta la glándula tiroides (su tejido diana) por la sangre, ocasionando una mayor producción de tiroxina. También es importante comprender el papel del hipotálamo en la producción de tiroxina y de TSH. El hipotálamo, localizado en el cerebro, es una glándula endocrina primaria que segrega varias hormonas que afectan a la hipófisis (también localizada en el cerebro). Entre éstas se encuentra la hormona liberadora de tirotropina (TRH), que estimula la producción de TSH en la hipófisis. Si el hipotálamo determina que no hay suficiente tiroxina circulando para mantener el metabolismo corporal, secretará TRH para estimular la producción de TSH por la hipófisis, la cual, a su vez, estimulará la producción de tiroxina por la glándula tiroidea (un ejemplo clásico de un bucle de retroalimentación negativa). La TRH es transportada desde el hipotálamo hasta la hipófisis vía el sistema porta hipotálamo-hipofisario, una organización de vasos sanguíneos especializados que consiste en una simple vena porta que conecta dos lechos capilares. El sistema porta hipotálamo-hipofisario transporta otras muchas hormonas desde el hipotálamo hasta la hipófisis. Ante todo, las hormonas secretadas por el hipotálamo son trópicas (o tróficas), es decir, hormonas que estimulan o inhiben la secreción de otras hormonas. La TRH es un ejemplo de una hormona trópica, ya que estimula la liberación de TSH (que, a su vez, es una hormona trópica, pues estimula la liberación de tiroxina). En los siguientes experimentos investigarás los efectos de la tiroxina y de la TSH sobre el metabolismo de un animal. Del menú principal selecciona Fisiología del Sistema Endocrino (Endocrine System Physiology). La pantalla de inicio aparecerá en pocos segundos (Figura 1). Figura 1. Arreglo experimental para el estudio de metabolismo basal A la izquierda verás una cámara en forma de bote conectada a un manómetro-respirómetro (consiste de un tubo en forma de U, una jeringuilla y unos tubos asociados). Colocarás los animales —en este caso ratas— en la cámara, con el fin de recopilar información sobre el efecto de la tiroxina y de la TSH sobre sus metabolismos basales. Observa que la cámara también incluye una balanza y que, junto a ella, hay un temporizador (min) (Timer) para fijar y calcular la duración de un determinado experimento. Bajo el temporizador hay un indicador de peso (Weight). En la parte superior de la cámara hay conectados dos tubos. El de la izquierda tiene una abrazadera que puede abrirse o cerrarse. Manteniéndola abierta (Clamp open) permitirás que el aire exterior entre en la cámara; cerrando la abrazadera (Clamp closed) se creará un sistema cerrado, hermético. El otro tubo conduce a un conector en forma de T. Uno de sus brazos está conectado a un tubo en forma de U, denominado manómetro, que contiene un líquido. A medida que un animal consume el aire del sistema cerrado, este fluido ascenderá en la parte izquierda del tubo en forma de U y descenderá en la derecha. El otro brazo del conector en forma de T conduce a una jeringuilla llena de aire. Al utilizar la jeringuilla para inyectar aire en el tubo, medirás la cantidad de aire necesario para que la columna de fluido vuelva a su nivel original. Esta medida será igual a la cantidad de oxígeno utilizada por el animal durante el transcurso del experimento. La sosa, situada en la parte inferior de la cámara, absorbe el dióxido de carbono producido por el animal, de forma que se puede medir fácilmente la cantidad de oxígeno consumido. Este dato, junto con el peso del animal, se utilizará para calcular su metabolismo basal. También aparecen en la pantalla tres ratas blancas en sus jaulas individuales. Son los ejemplares que utilizarás en los siguientes experimentos. Una rata es normal; la segunda está tiroidectomizada (abreviado en la pantalla como Tx) - lo que significa que se le ha eliminado la tiroides-, y la tercera está hipofisectomizada (abreviado en la pantalla como Hypox) es decir, se le ha extraído la hipófisis. En la parte superior izquierda de la pantalla hay tres jeringas que contienen varias sustancias químicas: propiltiouracilo (Propylthiouracil), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y tiroxina (Thyroxine). La TSH y la tiroxina se han mencionado anteriormente; el propiltiouracilo es un fármaco que inhibe la producción de tiroxina al bloquear la incorporación del yodo a la hormona. Sobre cada animal llevarás a cabo cuatro experimentos: 1) determinarás su metabolismo basal, 2) determinarás su tasa metabólica tras haberle inyectado tiroxina, 3) determinarás su metabolismo basal tras haber sido inyectada con TSH, y 4) determinarás su tasa metabólica basal tras haberle inyectado propiltiouracilo. Todos los datos los anotarás en el cuadro de resultados. También puedes guardarlos sobre la pantalla, utilizando el equipo que está en su parte inferior. Este equipo registra y muestra los datos que has acumulado durante los experimentos. El conjunto de datos para Normal debe estar resaltado en la ventana de Conjunto de Datos (Data Sets), ya que iniciarás la experimentación con la rata normal. El botón de Guardar Datos (Record Data) te permite guardar tus datos tras una prueba experimental. Pulsando sobre los botones de Borrar Línea (Delete Line) o Borrar Conjunto de Datos (Clear Data Set), eliminarás cualquier dato que desees. Actividad 1: Determinando el metabolismo basal En primer lugar, determinarás el metabolismo basal para cada rata. 1. Con la ayuda del ratón, pulsa y arrastra la rata Normal (Normal) hasta la cámara, colocándola sobre la balanza. Cuando el animal esté en la cámara, suelta el botón del ratón. 2. Asegúrate de que la llave del tubo de la izquierda (en la parte superior de la cámara) esté abierta, permitiendo la entrada de aire a la cámara. Si está cerrada, pulsa sobre ella para abrirla. 3. Asegúrate que en el indicador que está junto al conector en forma de T se lee Cámara y manómetro conectados (Chamber & manometer connected). Si no es así, pulsa sobre el tirador del conector en forma de T. 4. Pulsa sobre el botón Pesar (Weight) del módulo de la derecha de la cámara para pesar la rata. Anota este valor en el cuadro de resultados 5. Pulsa sobre el botón (+) del temporizador (Timer), hasta que se lea 1.00 en el indicador. 6. Pulsa sobre la llave para cerrarla. Esto evitará que entre aire del exterior y asegurará que el único oxígeno que está respirando la rata es el contenido dentro del sistema. 7. Pulsa Iniciar (Start) del módulo del temporizador. Verás que el Tiempo Transcurrido (Elapsed Time) aparece en el indicador. Observa qué ocurre con el nivel del agua del tubo en forma de U. 8. Al finalizar el periodo de 1 minuto el temporizador se detendrá automáticamente. Pulsa entonces sobre el tirador del conector en forma de T hasta que indique Manómetro y jeringuilla conectados (Manometer and syringe connected) 9. Pulsa sobre la llave para abrirla, de forma que la rata pueda respirar de nuevo el aire exterior. 10. Pulsa sobre el botón (+) bajo ml O2 , debajo de la jeringuilla, hasta que se lea 1.0 ml. Pulsa entonces Inyectar (Inject) y observa qué ocurre con el nivel del fluido. Continúa pulsando sobre el botón (+) e inyectando aire hasta que el nivel del fluido se iguale en los dos brazos del tubo en U. ¿Cuántos ml de aire has necesitado añadir para equilibrar el fluido en ambos brazos? _______________________ ml Este volumen es equivalente a la cantidad de oxígeno que ha utilizado la rata durante el minuto que ha permanecido en la cámara cerrada. 11. Anota esta medida en el cuadro de resultados. 12. Determina el consumo de oxígeno por hora para la rata. Utiliza la siguiente fórmula: mL O2 consumido 1 minuto X 60 min hr = ________________ ml O2 /hr 13. Anota este dato en el epígrafe «ml O2 utilizados por hora» en la sección Metabolismo Basal de la cuadro 1. 14. Ahora que ya tienes la cantidad de oxígeno utilizado por hora, determina el metabolismo basal por kilo de peso corporal, utilizando la siguiente fórmula (observa que necesitarás convertir el dato del peso, de gramos a kg, antes de utilizar la fórmula): Metabolismo basal = mL O2 /hr Peso (kg) = mL O2 /Kg/hr 15. Guarda este dato en el cuadro de resultados. 16. Pulsa sobre Guardar Datos (Record Data). 17. Pulsa y arrastra a la rata hasta su jaula. 18. Pulsa sobre el botón Reiniciar (Reset) del módulo denominado Aparato (Apparatus). 19. Ahora repite los pasos 1 a 18 para las ratas tiroidectomizada («Tx») e hipofisectomizada («Hypox»). Anota los resultados en el cuadro de resultados en las columnas correspondientes a cada rata. Asegúrate de resaltar Tx en Conjunto de Datos (Data Sets) (en el módulo de recogida de datos) antes de iniciar el experimento sobre la rata tiroidectomizada; del mismo modo, resalta Hypox en Conjunto de Datos antes de comenzar el experimento con la rata hipofisectomizada. ¿Qué diferencias existieron en los valores de metabolismo basal entre las tres ratas? Si un animal ha sido tiroidectomizado, ¿qué hormona(s) desaparecería(n) de su sangre? ¿cuál sería el efecto global sobre el organismo? ¿Qué efectos esperarías observar en los niveles hormonales de un animal que ha sido hipofisectomizado? ¿Cuál sería el efecto sobre el metabolismo de un animal? Actividad 2: Determinando el efecto de la tiroxina sobre el metabolism basal A continuación investigarás los efectos de las inyecciones de tiroxina sobre el metabolismo basal de las tres ratas. Observa que en un laboratorio real normalmente necesitarías inyectar tiroxina (o cualquier otra hormona) a una rata diariamente durante al menos 1 o 2 semanas para poder observar alguna respuesta. Sin embargo, en las siguientes simulaciones solo inyectarás una vez a la rata y serás capaz de presenciar los mismos resultados que si hubieras administrado múltiples inyecciones durante varias semanas. Además, al pulsar sobre el botón Limpiar (Clean) mientras una rata está en su jaula, puedes eliminar inmediatamente toda la hormona residual previamente inyectada y llevar a cabo un nuevo experimento sobre la misma rata. En un laboratorio real necesitarías esperar semanas para que los residuos hormonales abandonaran el organismo de la rata, o bien utilizar una rata diferente. 1. Selecciona una rata para el ensayo. El experimento lo vas a realizar con las tres ratas, y no importa el orden en que las utilices. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que escojas. 2. Pulsa el botón Reiniciar (Reset) en el módulo denominado Aparato (Apparatus). 3. Pulsa sobre la jeringuilla marcada con tiroxina (Thyroxine) y arrástrala hasta encima de la rata. Suelta el botón del ratón. Esto inyectará la tiroxina en la rata. 4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cámara. Sigue de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1, excepto que esta vez debes anotar los datos en la sección Con Tiroxina en el cuadro de Resultados. 5. Pulsa sobre Guardar Datos (Record Data). 6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cámara devolviéndola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de tiroxina del animal. 7. Ahora repite los pasos 1 a 6 con las ratas restantes. Anota tus datos en la sección Con Tiroxina en el cuadro de resultados, en la columna correspondiente a cada rata. ¿Cuál fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata normal? ¿Cómo es este metabolismo basal en comparación con el de una rata normal (sin tiroxina)? ¿Por qué se observó este efecto? ¿Cuál fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata tiroidectomizada? ¿Cómo es este metabolismo basal en comparación con el de una rata tiroidectomizada? ¿Por qué se observó este efecto? ¿Cuál fue el efecto de la tiroxina sobre el metabolismo basal de una rata hipofisectomizada? ¿Cómo es este metabolismo basal en comparación con el de una rata hipofisectomizada? ¿Por qué se observó este efecto? Actividad 3: Determinando el efecto de la TSH sobre el metabolismo basal A continuación investigarás los efectos de las inyecciones de TSH sobre el metabolismo basal de las tres ratas. Selecciona primero una rata para experimentar y después comienza. 1. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que estés utilizando. 2. Pulsa el botón Reiniciar (Reset) en el módulo denominado Aparato (Apparatus). 3. Pulsa y arrastra sobre la rata la jeringuilla marcada con TSH y suelta el botón del ratón, inyectando a la rata. 4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cámara. Sigue de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1. Anota los datos en la sección Con TSH del cuadro 1. 5. Pulsa Guardar Datos (Record Data). 6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cámara devolviéndola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de TSH. 7. Ahora repite esta actividad con las ratas restantes. Guarda tus datos en la sección Con TSH del cuadro 1, en la columna correspondiente a cada rata. Para cada rata experimental, explique cuáles son las diferencias, en su efecto y modo de acción, de la TSH en relación con la tiroxina? Compare estos resultados con los de las ratas a las que se les inyectó tiroxina: RATA NORMAL RATA TIROIDECTOMIZADA RATA HIPOFISECTOMIZADA Actividad4: Determinando el efecto del propiltiouracilo sobre el metabolismo basal A continuación investigarás los efectos de las inyecciones de propiltiouracilo (un inhibidor de la tiroxina) sobre el metabolismo basal de las tres ratas. Selecciona primero una rata para experimentar 1. En Conjunto de Datos (Data Sets) resalta Normal, Tx o Hypox dependiendo de la rata que estés utilizando. 2. Pulsa el botón Reiniciar (Reset) en el módulo denominado Aparato (Apparatus). 3. Pulsa y arrastra sobre la rata la jeringuilla marcada con Propiltiouracilo (Propylthiouracil) y suelta el botón ratón, inyectando a la rata. 4. Pulsa y arrastra la rata hasta la cámara. Ejecuta de nuevo los pasos 1 a 12 de la Actividad 1, excepto que esta vez guarda tus datos en la sección Con Propiltiouracilo del cuadro de resultados 5. Pulsa Guardar Datos (Record Data). 6. Pulsa y arrastra a la rata desde la cámara devolviéndola a su jaula, y pulsa Limpiar (Clean) para eliminar cualquier resto de propiltiouracilo. 7. Ahora repite esta actividad con las ratas restantes. Guarda tus datos en la sección Con Propiltiouracilo del cuadro de resultados, en la columna correspondiente a cada rata. ¿Por qué no se observan efectos en todas las ratas? Tomando en cuenta el bucle de retroalimentación negativa, prediga los cambios en las concentraciones de las hormonas participantes RATA NORMAL RATA TIROIDECTOMIZADA RATA HIPOFISECTOMIZADA Insulina y Diabetes La insulina es producida por las células de la porción endocrina del páncreas. Es vital para la regulación de los niveles sanguíneos de glucosa porque capacita a las células corporales para absorber glucosa desde el torrente circulatorio. La glucosa absorbida puede entrar en las células (generalmente en las hepáticas o musculares) donde se utiliza su exceso para formar glucógeno (almidón animal). Se estima que el 75% de la glucosa que se ingiere en una comida es almacenada de esta forma. Como se considera a los humanos «comedores discontinuos», esta producción de almidón animal tras una comida asegura que existirá glucosa disponible varias horas después de la ingesta. El organismo tiene que mantener un cierto nivel de glucosa en sangre para ser útil a las células del sistema nervioso, las cuales solo pueden absorber glucosa. Cuando los niveles de glucosa en sangre disminuyen por debajo de un cierto valor, las células a del páncreas producen entonces glucagón. La función de esta hormona es escindir el glucógeno almacenado en glucosa, para ser liberada a la sangre. Cuando el páncreas no produce insulina conduce a la diabetes mellitus Tipo I. Cuando el páncreas sí produce insulina, pero el organismo no responde a ella, el resultado es la diabetes mellitus Tipo II. En ambos casos, la glucosa permanece en la sangre, incapaz de ser incorporada por las células del organismo para ser utilizada como principal combustible para el metabolismo. El exceso de glucosa sanguínea es entonces filtrado por el riñón. Como la recaptación de la glucosa filtrada implica un número finito de receptores en las células renales, parte del exceso de glucosa no será reabsorbido hacia el organismo y, en su lugar, se perderá con la orina. La ausencia de insulina para el transporte de glucosa también afecta al músculo y tiene como resultado el catabolismo proteico de las células musculares, de forma que los aminoácidos liberados pueden formar glucosa en el hígado. Esta acción expone al organismo a un equilibrio negativo respecto del nitrógeno, debido al agotamiento proteico y al consumo tisular resultante. Este trastorno también está asociado a una deficiente resistencia a las infecciones. En el siguiente experimento estudiarás los efectos del tratamiento con insulina sobre la diabetes Tipo I. El experimento está dividido en dos partes. En la Parte 1 obtendrás una curva estándar de glucosa, que se explicará brevemente. En la Parte II compararás los niveles de glucosa de una rata normal con los de una rata diabética, y los compararás, de nuevo, tras haber inyectado insulina a cada rata. Parte 1 Actividad 5: Obteniendo una curva estándar de glucosa Para comenzar, selecciona Insulina y Diabetes-Parte 1 (Insulin and Diabetes-Part 1) del menú Experimento (Experiment) (Figura 3). En el lado derecho de la pantalla que aparece hay un espectrofotómetro (Spectrophotometer). El espectrofotómetro es uno de los instrumentos de investigación más ampliamente utilizado en biología. Se usa para medir las cantidades de luz de diferentes longitudes de onda absorbidas y transmitidas por una solución coloreada. En el interior del espectrofotómetro hay una fuente de luz blanca, que es escindida en varias longitudes de onda (o colores) por un prisma. El usuario selecciona una longitud de onda (color) y la luz de este color se hace pasar a través de un tubo, o cubeta, que contiene la muestra a ensayar. (Para este experimento, la fuente de luz del espectrofotómetro se preseleccionará a una longitud de onda de 450 nm). La luz transmitida por la muestra pasa entonces a un tubo fotoeléctrico, que convierte la energía luminosa en una corriente eléctrica. La corriente es entonces medida por un medidor. Alternativamente, la luz puede ser medida antes de que la muestra se coloque en su trayectoria, y después puede medirse la cantidad de luz absorbida denominada (densidad óptica). Utilizando cualquiera de los Figura 3. Arreglo experimental para el estudio de Insulina y diabetes (Parte 1) métodos, el cambio en la transmitancia luminosa o la luz absorbida, se puede medir la cantidad de una determinada sustancia en la muestra a ensayar. En la Parte II usarás el espectrofotómetro para determinar cuánta glucosa hay en muestras de sangre que habrás tomado de dos ratas. Pero antes de que puedas realizar esto debes obtener una curva estándar de glucosa, de forma que tengas un punto de referencia para convertir las lecturas de densidad óptica en lecturas de [glucosa] (que se medirá en mg/decilitro). Para hacer esto, prepararás cinco tubos de ensayo que contengan cantidades conocidas de glucosa: 30, 60, 90, 120 y 150 mg/dl, respectivamente. Determinarás entonces, en el espectrofotómetro, las lecturas de densidad óptica correspondientes a cada una de estas cantidades conocidas de glucosa. Usarás esta información para realizar la Parte II. En la pantalla también hay tres botellas cuentagotas, un lavador de tubos de ensayo (Test Tube Washer), un aparato distribuidor de tubos de ensayo (sobre el lavador) y una unidad incubadora de tubos de ensayo, que necesitarás para preparar las muestras para el análisis. 1. Pulsa y arrastra el tubo de ensayo (de encima del lavador de tubos de ensayo) (Test Tube Washer) a la ranura 1 de la unidad de incubación. Verás ascender otro tubo de ensayo del aparato distribuidor. Pulsa y arrastra este segundo tubo de ensayo hasta la ranura 2 de la unidad de incubación. Repite esta operación hasta que hayas arrastrado un total de cinco tubos de ensayo a las 5 ranuras de la unidad de incubación. 2. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre el tapón cuentagotas de la botella de Glucosa Estándar (Glucosa Standard). Arrastra el tapón sobre el tubo no 1. Suelta el botón del ratón para verter la glucosa. Verás que cae una gota de la solución de glucosa en el tubo. El gotero automáticamente se moverá hacia los siguientes tubos. Observa que cada tubo recibirá automáticamente una gota adicional de glucosa estándar (es decir, el tubo no 2 recibirá dos gotas, el tubo no 3 recibirá tres gotas, el tubo no 4 recibirá cuatro gotas y el tubo no 5 recibirá cinco gotas). 3. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre el tapón cuentagotas de la botella de Agua Desionizada (Deionized Water). Arrastra el tapón sobre el tubo no 1. Suelta el botón del ratón para verter el agua. Observa que se añaden automáticamente cuatro gotas de agua al primer tubo. Nota que cada tubo subsiguiente recibirá una gota menos de agua que el anterior (esto es, el tubo no 2 recibirá tres gotas, el tubo no 3 recibirá dos gotas y el tubo no 4 recibirá una gota). El tubo no 5 no recibirá ninguna gota de agua. 4. Pulsa sobre el botón Mezclar (Mix) de la unidad de incubación para agitar el contenido de los tubos. 5. Pulsa sobre el botón Centrifugar (Centrifuga). Los tubos descenderán a la unidad de incubación y serán centrifugados. Cuando los tubos son centrifugados, giran alrededor de un punto central a una velocidad elevada, de forma que cualquier partícula de materia del tubo se posará en su parte inferior, formando lo que se denomina un sedimento. 6. Cuando los tubos vuelvan a la superficie, pulsa sobre el botón Eliminar Sedimento (Remove Pellet). Cualquier sedimento del proceso de centrifugación será eliminado de los tubos de ensayo. 7. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre el tapón cuentagotas de la botella de Reactivo Enzimático para Colorear (Enzyme Color Reagent). Manteniendo todavía apretado el botón del ratón, arrástralo sobre el tubo n o 1. Cuando sueltes el ratón, observarás que se añaden cinco gotas del reactivo y que el tapón es devuelto a su botella. Automáticamente el gotero se deslizara hacia los subsiguientes tubos. 8. Pulsa ahora Incubar (Incubate). Los tubos descenderán a la unidad de incubación donde serán agitados para mezclar completamente el reactivo de color en el tubo, se incubarán y entonces volverán a la superficie. 9. Utilizando el ratón, pulsa sobre Ajustar (Set Up) del espectrofotómetro (Spectrophotometer). Esto calentará el instrumento y lo dejará listo para tus lecturas. En este caso, ajustar también incluye fijar el punto cero, de forma que el espectrofotómetro leerá exactamente la cantidad de material contenido en cada tubo. 10. Pulsa y arrastra el tubo n o 1 al espectrofotómetro (Spectrophotometer) (justo encima del botón de Ajustar (Set Up)) y suelta el botón del ratón. El tubo se colocará en su lugar. 11. Pulsa Analizar (Analyze). En la pantalla aparecerá un punto, y los valores aparecerán en los indicadores de Densidad Optica (Optical Density) y Glucosa (Glucosa). 12. Pulsa Guardar Datos (Record Data) en la unidad de recogida de datos. 13. Pulsa y arrastra el tubo al interior del lavador de tubos de ensayo (Test Tube Washer). 14. Repite los pasos 13 a 16 con los restantes tubos de ensayo. 15. Cuando todos los tubos hayan sido analizados, pulsa sobre el botón Gráfica (Graph). Esta es la gráfica estándar de glucosa que utilizarás en la Parte II del experimento. Parte II Actividad 6: Comparando los niveles de glucosa antes y después de la inyección de insulina Selecciona Insulina y Diabetes Parte 2 (Insulin and Diabetes Part 2) del menú Experimento (Experiment). Figura 4. Arreglo experimental para el estudio de Insulina y diabetes (Parte 2) La pantalla de inicio será similar a la de la Parte I (Figura 4). Observa las dos ratas en sus jaulas. Una será el animal Control y la otra el animal Experimental. Observa también las tres jeringuillas, que contienen insulina, solución salina y aloxana, respectivamente. La aloxana es un fármaco que, cuando se administra a un animal, destruye selectivamente todas las células B pancreáticas que producen insulina y vuelve al animal diabético al instante. En este experimento inyectarás solución salina a la rata Control y aloxana a la Experimental. (Normalmente las inyecciones se aplican diariamente durante una semana. En esta simulación administraremos las inyecciones una sola vez, pero podremos ver los resultados como si se hubiesen administrado durante un periodo más largo de tiempo). Tras administrar las inyecciones de solución salina y de aloxana, obtendrás muestras de sangre de las dos ratas. Inyectarás, entonces, a ambas con insulina y obtendrás de nuevo muestras de sangre. Finalmente, analizarás todas las muestras en el espectrofotómetro (descrito en la Parte 1) para comparar las cantidades de glucosa presente en ellas. 1. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Solución Salina (Salive) hasta la rata Control (Control) y suelta el botón del ratón para inyectar al animal. 2. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Aloxana (Alloxan) hasta la rata Experimental (Experimental) y suelta el botón del ratón para inyectar al animal. 3. Pulsa y arrastra un tubo de ensayo nuevo (del aparato distribuidor de tubos de ensayo) sobre el rabo de la rata Control (Control) y suelta el botón del ratón. Observarás que caen tres gotas de sangre desde el rabo al tubo. A continuación, pulsa y arrastra el tubo hasta el soporte n.° 1 de la unidad de incubación de tubos de ensayo. (Nota: la cola es un lugar común para obtener sangre de una rata. Su extremo puede cortarse fácilmente y recoger la sangre sin perturbar realmente a la rata. La cola se cura rápidamente, sin daño para el animal.) 4. Pulsa y arrastra otro tubo de ensayo nuevo (del aparato distribuidor de tubos de ensayo) sobre el rabo de la rata Experimental (Experimental) y suelta el botón del ratón. De nuevo observarás que caen tres gotas de sangre desde la cola al tubo. Pulsa y arrastra el tubo hasta el soporte n.° 2 de la unidad de incubación de tubos de ensayo. 5. Pulsa y arrastra la jeringuilla de Insulina (Insulin) hasta la rata Control (Control) y suelta el botón del ratón para inyectar al animal. 6. Repite el paso 5 con la rata Experimental (Experimental). 7. Repite de nuevo los pasos 3 y 4, obteniendo muestras de sangre de cada rata y colocándolas sobre los soportes n.° 3 y n.° 4 de la unidad de incubación. 8. Pulsa el botón Obtener Reactives (Obtain reagents) de encima del estante que actualmente muestra las jeringuillas. Las jeringuillas y las ratas desaparecerán y, en su lugar, verás cuatro botellas cuentagotas. 9. Pulsa el botón del ratón y mantenlo sobre la botella de Agua Desionizada (Deionized Water). Arrastra el tapón sobre el tubo n.° 1. Suelta el botón del ratón para verter el agua. Verás que se añaden al tubo cinco gotas de agua. El agua se añade para que todos los tubos contengan el mismo volumen. 10. Repite el paso 9 con los restantes tubos de ensayo. 11. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre el cuentagotas de Hidróxido de Bario (Barium Hydroxide). Arrastra el tapón hasta el tubo n° 1. Suelta el botón del ratón para verter su contenido. Observarás que se añaden al tubo cinco gotas de la solución. (El hidróxido de bario se utiliza para aclarar proteínas y células de forma que se puedan obtener lecturas limpias de glucosa.) 12. Repite el paso 11 con los restantes tubos de ensayo. 13. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre el cuentagotas de la botella de Heparina (Heparin). Todavía con el botón del ratón pulsado, arrastra el tapón hasta el tubo n° 1. Suelta el botón del ratón para verter la heparina. La heparina es un anticoagulante que evita que se coagule la sangre mientras se trabaja con ella. 14. Repite el paso 13 con los restantes tubos de ensayo. 15. Pulsa sobre el botón Mezclar (Mix) de la unidad de incubación para mezclar el contenido de los tubos. 16. Pulsa sobre el botón Centrifugar (Centrifuga). Los tubos descenderán al interior de la unidad de incubación para ser centrifugados y luego volverán a la superficie. 17. Pulsa sobre el botón Eliminar Sedimento (Remove Pellet) para quitar cualquier sedimento del proceso de centrifugación. 18. Pulsa y mantén el botón del ratón sobre la botella de Reactivo Enzimático para Colorear (Enzyme Color Reagent). Arrastra el tapón hasta el tubo n° 1. Suelta el ratón para verter la enzima. 19. Repite el paso 18 con los restantes tubos de ensayo. En un laboratorio real además deberías agitar los tubos de ensayo tras añadir el reactivo enzimático para colorear. 20. Pulsa Incubar (Incubate) una vez más. Los tubos descenderán a la unidad de incubación, se incubarán y volverán a la superficie. 21. Pulsa sobre Ajustar (Set Up) del espectrofotómetro (Spectrophotometer). Esto calentará el instrumento y lo dejará listo para que realices tus lecturas. 22. Pulsa sobre Gráfica Estándar de Glucosa (Graph Glucose Standard). Aparecerá en el monitor la gráfica de la Parte 1 del experimento. 23. Pulsa y arrastra el tubo n.' 1 al espectrofotómetro (Spectrophotometer) y suelta el botón del ratón. El tubo se colocará en su lugar. 24. Pulsa Analizar (Analyze). Verás que aparece una línea horizontal en la pantalla, y un valor en el indicador de Densidad óptica (Optical Density). 25. Arrastra la regla móvil (la línea roja vertical en el extremo derecho del monitor del espectrofotómetro) hasta el lugar donde se cruza la línea horizontal (del paso 24) con la línea estándar de glucosa. Observa lo que ocurre en el indicador de Glucosa (Glucose) a medida que mueves la regla móvil hacia la izquierda. ¿Cuál es la lectura de glucosa en el lugar en donde la línea horizontal cruza a la línea de glucosa estándar? Tubo de ensayo n° 1: ______________ mg/dL de glucosa. Este es el valor de glucosa de la muestra que estás ensayando. 26. Pulsa Guardar Datos (Record Data) de la unidad de recogida de datos. 27. Pulsa y arrastra el tubo de ensayo desde el espectrofotómetro (Spectrophotometer) hasta el lavador de tubos (Test Tube Washer), pulsa entonces Limpiar (Clear) debajo de la pantalla del osciloscopio. 28. Repite los pasos 22 a 27 para los restantes tubos de ensayo. Anota aquí las lecturas de glucosa de cada uno de ellos: Tubo de ensayo n° 2: ______________ mg/dL de glucosa. Tubo de ensayo n° 3: ______________ mg/dL de glucosa. Tubo de ensayo n° 4: ______________ mg/dL de glucosa. ¿Cuál es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n° 1 comparado con el del tubo de ensayo n° 2. Da una explicación a este resultado. ¿Cuál es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n° 3 comparado con el del tubo de ensayo n° 1? Da una explicación a este resultado. ¿Cuál es el nivel de glucosa en el tubo de ensayo n° 4 comparado con el del tubo de ensayo n° 2? . Da una explicación a este resultado. ¿Cuál fue el efecto de la administración de insulina sobre el animal Control y sobre el animal Experimental? Actividad 7: Análisis de los niveles de Cortisol y Adrenocorticotrópica Cortisol es una hormona secretada por la corteza adrenal y participa en los mecanismos de regulación del estrés a largo plazo. La libración de cortisol es estimulada por la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) cuya liberación, desde la hipófisis anterior, es estimulada por la hormona hipotalámica liberadora de corticotropina (CRH). Aumentos en los niveles de cortisol, bien por desórdenes hormonales o inducida (iatrogénica) inhibe la liberación tanto de ACTH como de CRH. Existen numerosos desórdenes hormonales descritos y asociados a alteraciones en los niveles plasmáticos de cortisol y ACTH. Debido a su importancia, analizaremos un método para cuantificar los niveles de cortisol y la hormona adrenocorticotrópica. Primero, selecciona Midiendo las Hormonas Cortisol y Adrenocorticotropica (Measuring Cortisol and Adrenocorticotropic Hormone) del menú de Experimentos (Experiments). En la nueva pantalla aparecerán 5 muestras de sangre tomadas a pacientes y una columna de cromatografía de alta resolución o HPLC (High- performance liquid chromatography) que será utilizada para simular un método para la cuantificación de los niveles de hormonas en sangre. Explique brevemente en que consiste la técnica de cromatografía de alta resolución o HPLC También se observa en la pantalla una jeringa que será utilizada para inyectar las muestras en el inyector del HPLC (HPLC injector) para análisis. Los botones de Cortisol y ACTH son usados para preparar la columna con los solventes necesarios para separar las dos hormonas. El detector medirá la cantidad de hormona presente y la convierte en valores de concentración 1. Inicie el experimento pulsando el botón de Cortisol. Con esto, se preparará la columna para la separación y cuantificación de cortisol 2. Pulse sobre la jeringa y arrástrela hasta la primera muestra de paciente. Libere el mouse para instantáneamente llenar la jeringa con la muestra. 3. Pulse nuevamente sobre la jeringa y arrástrela sobre el inyector de HPLC (HPLC inyector). Libere el mouse para que la muestra entre al tubo y fluya hacia la columna. El detector mostrará la concentración de cortisol de la primera muestra. 4. Registre sus datos (Record data) 5. Pulse el botón para Limpiar (Clean) cerca de la jeringa para tomar la próxima muestra y Limpiar la columna (Clean Column) cerca del margen superior de la pantalla para remover residuos de cortisol en la columna. 6. Repita los pasos 2-6 utilizando las otras muestras 7. Prepare la columna para la separación y cuantificación de ACTH 8. Pulse y arrastre la jeringa sobre la primera muestra. Libere el Mouse para llenar la jeringa con la muestra 9. Pulse nuevamente sobre la jeringa y arrástrela sobre el inyector de HPLC. Libere el mouse. El detector mostrará los niveles de ACTH en la primera muestra 10. Registre sus datos (Record data) 11. Pulse el botón para Limpiar (Clean) cerca de la jeringa para tomar la próxima muestra y Limpiar la columna (Clean Column) cerca del margen superior de la pantalla para remover residuos de ACTH en la columna. 12. Repita los pasos 8-12 utilizando las siguientes muestras de sangre 13. Seleccione una fila de l conjunto de datos (Data Set) y escoja Alto o Bajo (High o Low) basado en los valores que se muestran en el cuadro adjunto. 14. Registre sus valores en el cuadro de resultados Explique brevemente las diferencias en los niveles de cortisol y ACTH en cada una de las muestras ¿Que paciente podría ser diagnosticado con la enfermedad de Cushing? ¿Por qué? ¿Cuál(es) paciente(s) tienen los niveles hormonales característicos del síndrome de Cushing? ¿Cuál(es) paciente(s) es probable que se diagnosticado con la enfermedad de Addison? ¿Por qué?